Ćwiczenie 8

Ćwiczenie 8
OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY
(PIROFOSFATAZY)
Część doświadczalna obejmuje:
−
sączenie żelowe ekstraktu uzyskanego z bielma niedojrzałych nasion kukurydzy
−
oznaczanie aktywności alkalicznej difosfatazy w bielmie niedojrzałych nasion kukurydzy
w warunkach zróżnicowanego stężenia jonów dwuwartościowych w środowisku reakcyjnym
WPROWADZENIE
Uniwersalnym środkiem wymiany energii swobodnej w układach biologicznych jest
ATP. Adenozynotrifosforan jest cząsteczką bogatą w energię, ponieważ jego jednostka trifosforanowa zawiera dwa bezwodnikowe wiązania fosforanowe (Ryc. 1). Stosunkowo duża
ilość energii swobodnej uwalniana jest podczas jego hydrolizy do ADP i fosforanu (-30,5 kJ
x mol-1; -7,3 kcal x mol-1) (Ryc. 1), a jeszcze większa zmiana energii swobodnej towarzyszy
hydrolizie ATP do AMP i difosforanu (pirofosforanu; PPi) (-45,6 kJ x mol-1; 10,9 kcal x
mol-1) (Ryc. 2). W komórce energia swobodna tych reakcji jest jeszcze wyższa, gdyż przebiega w nieco odmiennych warunkach siły jonowej i stężenia jonów Mg2+ w środowisku. Inne
nukleotydy trifosforanowe (GTP, CTP, UTP) również mają dwa bezwodnikowe wiązania
fosforanowe i wykazują właściwości podobne do ATP, lecz spełniają inne funkcje w przemianie materii.
Energetycznie korzystna reakcja hydrolizy ATP do ADP i nieorganicznego fosforanu
-2
(HPO4 ) jest sprzężona z wieloma reakcjami energetycznie niekorzystnymi. Ponadto, wiele
reakcji biosyntezy zależy od alternatywnej drogi hydrolizy ATP, w której uwalniany jest
difosforan i AMP (Ryc. 2). Powstający w tym wypadku difosforan (pirofosforan; PPi) jest
natychmiast hydrolizowany przez difosfatazę do dwóch cząsteczek ortofosforanu. Cały
proces wyzwala całkowitą energię swobodną o wartości około –108 kJ/mol, dzięki czemu
reakcje biosyntezy stają się nieodwracalne.
1
Ryc. 1. Wzajemne przekształcanie ATP i ADP (Alberts i wsp. 1999)
Ryc. 2. Alternatywna droga hydrolizy ATP. A. W dwóch następujących po sobie reakcjach hydrolizy
atomy tlenu z cząsteczek wody są wiązane przez produkty, natomiast atomy wodoru oddysocjowują
tworząc wolne jony wodorowe H+. B. Całkowita reakcja przedstawiona w postaci skróconej (Alberts i
wsp. 1999)
2
Poniżej przedstawione są przykładowe reakcje biosyntezy, których przebieg w prawą stronę
zależy od obecności w środowisku difosfatazy (pirofosfatazy):
Synteza DNA i RNA
(DNA)n reszt + trifosforan deoksyrybonukleozydu ↔ (DNA)n+1 reszt + PPi
PPi + H2O → 2 Pi
(RNA)n reszt + trifosforan rybonukleozydu ↔ (RNA)n+1 reszt + PPi
PPi + H2O → 2 Pi
Aktywacja aminokwasów
aminokwas + ATP ↔ aminoacylo-AMP + PPi
PPi + H2O → 2 Pi
aminoacylo-AMP + tRNA → aminoacylo-tRNA + AMP
Aktywacja kwasów tłuszczowych
kwas tłuszczowy + ATP ↔ acylo-AMP + PPi
PPi + H2O → 2 Pi
acyloadenylan + HS-CoA → acylo-CoA + AMP
Biosynteza di- i oligosacharydów
glukozo-6-fosforan → glukozo-1-fosforan
glukozo-1-fosforan + UTP → UDP-glukoza + PPi
PPi + H2O → 2 Pi
UDP-glukoza + fruktozo-6-fosforan ↔ fosfosacharoza + UDP
fosfosacharoza + H2O → sacharoza + Pi
Biosynteza glikogenu i skrobi
glukozo-6-fosforan → glukozo-1-fosforan
glukozo-1-fosforan + UTP → UDP-glukoza + PPi
PPi + H2O → 2 Pi
UDP-glukoza + gliokogenn → glikogenn+1 + UDP
UDP-glukoza + amylozan → amylozan+1 + UDP
3
Difosfataza (pirofosfataza) cechuje się wysoką specyficznością względem difosforanu jako
substratu (nie hydrolizuje wiązań bezwodnikowych w nukleotydach ani wiązań fosfoestrowych) i wymaga jonów magnezu jako aktywatora. Aktywność difosfatazy można oznaczać
na podstawie ilości enzymatycznie uwalnianego ortofosforanu, który powstaje zgodnie z
poniższym równaniem reakcji:
P2O7 4- + H2O
2PO4 3- + 2H+
Ilość uwolnionego ortofosforanu można oznaczać m. in. metodą Fiske-Subbarowa.
WYKONANIE
Odczynniki:
1. 50 mM bufor Tris-HCl, pH 8,6
2. 2 mM difosforan (V) sodu w 50 mM buforze Tris-HCl, pH 8,6
3. MgCl2 (2,5 – 12,5 mM) w 50mM buforze Tris-HCl, pH 8,6
4. 5 mM CaCl2 w 50 mM buforze Tris-HCl, pH 8,6
5. 12,5 mM EDTA w 50 mM buforze Tris-HCl, pH 8,6
6. 5 mM NaF w 50mM buforze Tris-HCl, pH 8,6
7. 10% TCA
8. 10 M H2SO4
9. Roztwór molibdenianu (VI) amonu
10. Eikonogen
Materiał:
Zamrożone bielmo (endosperm) z niedojrzałych nasion kukurydzy
Oznaczanie aktywności difosfatazy (pirofosfatazy) w warunkach zróżnicowanego stężenia jonów dwuwartościowych w środowisku reakcyjnym
Przygotowanie ekstraktu białkowego:
Z zamrożonego bielma zdrapać metalową szpatułą 2 g zamrożonej tkanki i po rozmrożeniu rozetrzeć w małym moździerzu. Dobrze roztarty materiał przelać do dwóch probówek
wirówkowych Eppendorfa i wirować 5 min. przy 15 000 obr/min. Ściągnięty pipetą z obu
4
probówek nadsącz poddać rozdziałowi na krótkiej (15 cm x 1,5 cm) kolumnie Sephadex G-15
(sączenie żelowe) w celu oddzielenia frakcji białkowej (zawierającej m. in. difosfatazę) od
endogennego fosforanu, jonów magnezu, wapnia i innych związków niskocząsteczkowych, które mogą wpływać na aktywność enzymu. W tym celu, przy zamkniętym wypływie
kolumny, nanieść ostrożnie na powierzchnię żelu całą objętość nadsączu po wirowaniu, a
następnie otworzyć wylot kolumny. Po wniknięciu całej próbki do żelu (UWAGA! nie dopuścić do zapowietrzenia kolumny) pipetą Pasteura nanieść ostrożnie na powierzchnię żelu 4 –
5 ml buforu do elucji (50 mM Tris-HCl, pH 8,6), a następnie podłączyć butlę z roztworem
elucyjnym i prowadzić rozdział, śledząc przesuwanie się wzdłuż kolumny żółto zabarwionej
frakcji białek. Kiedy białka będą na wysokości 2 – 3 cm od wylotu kolumny, rozpocząć zbieranie frakcji o objętości około 1 ml. Frakcję o najintensywniejszym żółtym zabarwieniu zachować do oznaczeń, natomiast pozostałe zebrane frakcje wylać. Przed rozpoczęciem oznaczeń zebraną (odsoloną) próbę rozcieńczyć 20-krotnie buforem używanym do elucji.
Przygotowanie środowiska reakcyjnego:
Do prób od 1 do 9 napipetować podane w Tabeli 1 objętości substratu (2 mM difosforan czterosodowy w 50 mM buforze Tris-HCl, pH 8,6) oraz kolejnych roztworów zawierających jony Mg2+ o rosnącym stężeniu, Mg2+ + wersenian czterosodowy (EDTA), Ca2+
oraz fluorku sodu. Wszystkie mieszaniny reakcyjne przygotować w dwóch powtórzeniach!
Wszystkie probówki (18 probówek; w każdej po 0,9 ml roztworu) umieścić w łaźni wodnej o
temperaturze 300C, co najmniej 5 minut przed rozpoczęciem dodawania enzymu.
Wykonanie oznaczenia
Do prób umieszczonych w łaźni i podgrzanych do 300 C dodawać w odstępach co 30
sekund po 0,1 ml 20-krotnie rozcieńczonego roztworu odsolonych na kolumnie białek w kolejności: 1, 1’; 2, 2’; 3, 3’… itd., z pominięciem prób 9 i 9’ (próby zerowe!). Nie wyłączając
stopera, inkubować wszystkie próby 30 min w łaźni wodnej (temp. 300C), po czym dokładnie po 30 min rozpocząć hamowanie reakcji dodając co 30 sekund po 0,5 ml 10% roztworu
TCA (denaturacja białek!) w tej samej kolejności, jak dodawano enzym, tj. 1, 1’; 2, 2’; 3,3’
itd. Postępując w ten sposób wszystkie próby będą inkubowane z enzymem dokładnie 30 minut. Uwaga! Na końcu, do 9 i 9’ (próby kontrolne!) dodać najpierw po 0,5 ml 10% roztworu
TCA, a następnie po 0,1 ml enzymu! (dodanie najpierw TCA spowoduje, że wprowadzony do
próby enzym będzie natychmiast denaturowany przez TCA).
5
Tabela 1. Przygotowanie mieszanin reakcyjnych do oznaczania aktywności difosfatazy w
warunkach zróżnicowanego stężenia jonów dwuwartościowych
Skład próby
1
2
3
4
5
6
7
8
9
2 mM PPi w
0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml
50 mM Tris-HCl
pH 8,6
50 mM Tris-HCl 0,4 ml
pH 8,6
2,5 mM MgCl2
5 mM MgCl2
10 mM MgCl2
0,4 ml
0,4 ml
0,4 ml
12,5 mM MgCl2
0,4 ml
5 mM CaCl2
0,2 ml 0,2 ml 0,4 ml
0,4 ml
12,5 mM EDTA
0,2 ml
5 mM NaF
0,2 ml
Wszystkie próby wyjąć z łaźni wodnej, a następnie do każdej dodać kolejno odczynniki potrzebne do oznaczaniu ortofosforanu metodą Fiske-Subbarowa: 0,4 ml mieszaniny zawierającej H2SO4, molibdenian amonu i H2O zmieszanych w stosunku 1:2:1, a po dokładnym
wytrząśnięciu każdej próby, po 0,1 ml eikonogenu (redukcja kompleksu fosfomolibdenowego). Wszystkie próby ponownie umieścić w łaźni wodnej (temperatura 300C) na 10 min, w
celu przyspieszenia tworzenia barwnego kompleksu błękitu molibdenowego. Po wyjęciu
prób z łaźni, zmierzyć absorbancję przy 660 nm względem próby zerowej (połączone próby 9
i 9’).
Korzystając z przygotowanej uprzednio krzywej kalibracyjnej (ćwiczenie 6) obliczyć
ilość uwolnionego enzymatycznie ortofosforanu, (ilość wyrazić w µmolach) w czasie 30 min
inkubacji enzymu w środowisku reakcyjnym o odpowiednim składzie. Aktywność difosfatazy, wyrażona jako ilość µmoli ortofosforanu powstałego w ciągu 1 min inkubacji enzymu z
substratem, przedstawić w postaci histogramów. Pod każdym słupkiem podać końcowe stęże-
6
nie substratu (PPi) oraz stężenie badanego jonu w środowisku reakcyjnym (0,9 ml mieszaniny
reakcyjnej + 0,1 ml enzymu).
Zagadnienia do przygotowania:
−
reakcje produkujące nieorganiczny difosforan (pirofosforan) w komórce
−
rola enzymu hydrolizującego difosforan
−
zasada oznaczania aktywności enzymatycznej alkalicznej difosfatazy
−
aktywatory i inhibitory reakcji enzymatycznej (hamowanie kompetycyjne i niekompetycyjne)
Literatura:
Biochemia – JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa 2005
Ćwiczenia z biochemii – pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz) PWN, Warszawa 2005
7