microgen™ bacillus-id

MICROGEN™ BACILLUS-ID
System identyfikacyjny dla mezofilnych Bacillus spp. z produktów żywnościowych.
Instrukcja obsługi
MID-66 paski testowe
20 testów
Podręczny opis
MATERIAŁ DO BADAŃ
Wybrać odpowiednią ilość kolonii do uzyskania wymaganej gęstości
inokulum
INOKULUM
Wykonać zawiesinę w bulionie dla Bacillus
INOKULACJA
Przenieść 4 krople (100 µl) na studzienkę
CZAS INKUBACJI
24 godziny
TEMPERATURA INKUBACJI
30°C
WSTĘPNE ODCZYTY
Odczytać wyniki po 24 godzinach inkubacji, zapisać zmianę barwy
i prowadzić dalszą inkubację w 30˚C przez następne 24 godziny
ODCZYT KOŃCOWY
Dokonać odczytu, dodać reagenty i zapisać wyniki po 48 godz. inkubacji
INTERPRETACJA WYNIKÓW
Wyniki zinterpretować za pomocą Oprogramowania Microgen
PRZREZNACZENIE TESTU
System Microgen Bacillus-ID przeznaczony jest do użytku profesjonalnego przez wykwalifikowany
personel laboratoryjny z użyciem techniki aseptycznej i za pomocą odpowiednich środków ostrożności.
System Microgen Bacillus-ID składa się z 2 x 12 standaryzowanych studzienek zawierających substraty
i powiązany jest z Oprogramowaniem Microgen, co umożliwia identyfikację następujących gatunków
z rodzaju Bacillus:
Bacillus sp.
grupa B. cereus
B. firmus
B. badius
B. laevolacticus
B. coagulans
B. lentus
B. amyloliquefaciens
B. subtilis
B. circulans
B. insolitus
B. thiaminolyticus
B. freudenreichii
B. globisporus
B. sphaericus
B. pumilus
B. licheniformis
B. megaterium
Vergibacillus sp.
V. pantothenticus
Paenibacillus sp.
P. alvei
P. polymyxa
P. macerans
Brevibacillus sp.
Br. brevis
Br. Laterosporus
Uwaga: grupa B. cereus składa się z B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides i B. weihenstephanensis.
Na podstawie rutynowych testów biochemicznych powyższe gatunki są nierozróżnialne. (Zobacz
Ograniczenia)
MICROGEN BACILLUS ID
Strona 1
ZASADA DZIAŁANIA TESTU
W skład systemu Microgen Bacillus-ID wchodzą dwa paski ze studzienkami (oznaczone BAC1 i BAC2),
każdy z nich zawiera 12 standardowych substratów służących do wykrywania zdolności dekarboksylacji
węglowodanów i do przeprowadzania innych reakcji biochemicznych. Ostatnia studzienka w drugim
pasku jest studzienką kontrolną dla reakcji fermentacji węglowodanów i jest używana jako studzienka
referencyjna przy interpretacji wyników testów. Wybór substratów znajdujących się w studzienkach oparty
został na kombinacji substratów, które służą do potwierdzania obecności gatunków z rodzaju Bacillus
i/lub dalszego różnicowania gatunków w obrębie rodzaju.
Jeżeli badany szczep metabolizuje pojedyncze substraty, zachodzi zmiana barwy podczas inkubacji po 24
i 48 godzinach inkubacji w 30˚C i po dodaniu odpowiednich odczynników (indol, azotany, test VP) po 48
godzinach inkubacji.
Zmianę metabolizowanych substratów można interpretować używając do identyfikacji badanego szczepu
oprogramowanie Microgen Identification System Software (MID-60).
Każdy z dwóch pasków Microgen Bacillus-ID składa się z dwunastu studzienek zawierających substraty
dla 24 biochemicznych reakcji opisanych poniżej:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
Substrat
Arabinoza
Cellobioza
Inozytol
Mannitol
Mannoza
Rafinoza
Ramnoza
Salicyna
Sorbitol
Sacharoza
Trehaloza
Ksyloza
Adonitol
Galaktoza
Metylo-D-mannozyd
Metylo-D-glukozyd
Inulina
Melezytoza
Indol
20
ONPG
20
plus
reag
Azotany
21
Dihydrolaza argininy
Reakcja
Dodatnia
Ujemna
Fermentacja specyficznych cukrów
powoduje powstanie kwasu, który
zmienia pH a tym samym kolor
czerwieni fenolowej z czerwonego na
żółty.
Żółty
Czerwony
Fermentacja specyficznych cukrów
powoduje powstanie kwasu, który
zmienia pH a tym samym kolor
czerwieni fenolowej z czerwonego na
żółty.
Żółty
Czerwony
Różowy/
Czerwony
Bezbarwny/
Żółty
Żółty
Bezbarwny
Czerwony
Bezbarwny
Zielononiebieski/
Niebieksi
Żółty/
Żólto-zielony
Indol jest produktem rozkładu
tryptofanu i daje różowy/czerwony
kolor po dodaniu odczynnika Kavacs’a.
Hydroliza ONPG przez β-galaktozydazę
powoduje powstanie żółtego ortonitrofenolu.
Azotany są redukowane do azotynów,
które tworzą ciemnoczerwony kompleks
po dodaniu α-naftylaminy i kwasu
sulfanilowego.
Arginina jest rozkładana do ornityny,
amoniaku i CO2 przez dihydrolazę
argininy powodując wzrost pH i zmianę
koloru błękitu bromotymolowego z
zielonego na niebieski. Po 48 godzinach
kolor zielony wskazuje na reakcję
ujemną.
MICROGEN BACILLUS ID
Strona 2
22
Utylizacja cytrynianu
23
Voges Proskauer
24
Kontrola
Rozkład cytrynianu (tylko źródło węgla)
prowadzi do wzrostu pH powodując
zmianę koloru błękitu
bromotymolowego z żółto-zielonego na
niebieski.
Produkcja acetony stanowiącej jeden
z produktów rozkładu glukozy
powoduje powstanie
różowego/czerwonego kompleksu po
dodaniu α-naftolu i kreatyny w
obecności KOH.
Kontrola węglowodorów
Niebieski
Żółty/
Jasnozielony
Różowy/
Czerwony
Słomkowy
Czerwony
Czerwony
ZAWARTOŚĆ ZESTAWU (20 testów)
•
•
•
•
•
Podstawka do pasków
Formularze do wyników
Instrukcja użycia
20 MID66c paski (BAC1 i BAC2) w osobnych opakowaniach foliowych
20 MID66b bulion do wykonania zawiesiny bakteryjnej (Bacillus Suspending Medium)
MATERIAŁY WYMAGANE, ALE NIEDOSTARCZONE:
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Oprogramowanie Microgen Identification System Software (MID-60) – daje identyfikację opartą
na prawdopodobieństwie, % prawdopodobieństwa i podobieństwie z analizą jakości
różnicowania. Pełna definicja tych terminów znajduje się w podręczniku pomocy do
oprogramowania.
Odczynniki VPI i VPII
Odczynniki na azotany A i B
Odczynnik Kovacs’a
Kolorowy schemat do odczytywania wyników
Sterylne ezy bakteriologiczne
Sterylne wymazówki
Sterylne pipety pasterowskie
Cieplarka (35 - 37˚C), bez wentylatora
Lodówka (2 - 8˚C)
Pisak
Woda utleniona, używać w stężeniu 3% (w/w), do testu na katalazę,
Odczynniki do barwienia metodą Grama
Mikroskop, szkiełka do mikroskopu
Cieplarka (25˚C), bez wentylatora
Mieszadło typu Vortex
MICROGEN BACILLUS ID
Strona 3
PRZECHOWYWANIE I TERMIN WAŻNOŚCI
Paski ze studzienkami Micrgen Bacillus-ID są stabilne w zamkniętych firmowo opakowaniach foliowych
w temperaturze 2 - 8°C do czasu upływu terminu ważności oznaczonego na naklejce. Otwarte
opakowania z paskami testowymi można przechowywać do 14 dni w temperaturze 2 - 8°C upewniwszy
się, że opakowanie jest ponownie szczelnie zamknięte i zawiera saszetkę ze środkiem suszącym. Podłoże
do przechowywania zawiesin powinno być przechowywane w temperaturze 2 - 8˚C.
INSTRUKCJA UŻYCIA
(Przed użyciem produktu należy zapoznać się z Ośrodkami ostrożności i Ograniczeniem testu)
1. Selekcja kolonii do identyfikacji
1.1. Do przeprowadzenia testu można użyć czystej hodowli z podłoża nieselektywnego np. Blood
Agar. Zaleca się przesianie hodowli z pierwotnej płytki.
Przed posianiem studzienek Mirogen Bacillus-ID, wyizolowane kolonie powinny być sprawdzone
czy dany mikroorganizm należy do rodzaju Bacillus. (Gram-dodatnie laseczki, tworzące endospory,
katalazo-dodatnie, optymalna temperatura wzrostu mieści się pomiędzy 25 i 45˚C, mezofile.
Wyizolowane szczepy rosnące w temp. < 25˚C (psychrofile) czy szczepy rosnące w temp. > 45˚C
(termofile) nie są identyfikowane przez ten test).
2. Przygotowanie zawiesiny
2.1. Przed użyciem, bulion należy doprowadzić do temperatury pokojowej.
2.2. Wybrać wyizolowane kolonie z 18-24 godzinnej hodowli za pomocą ezy bądź wymazówki
i rozprowadzić we fiolce zawierającej bulion dla Bacillus (5 ml).
2.3. Dobrze wymieszać np. za pomocą mieszadła typu vortex do uzyskania jednorodnej zawiesiny
o gęstości równej 2.0 MacFarland’a i pozwolić komórkom osiąść przed posianiem. Może być
potrzebna więcej niż jedna płytka z hodowlą do uzyskania takiej zawiesiny.
2.4. Posiać studzienki w przeciągu 10 minut od momentu przygotowania i wymieszania zawiesiny.
3. Posiew i inkubacja
3.1. Wyjąć paski z opakowań foliowych i umieścić paski w ramce.
3.2. Delikatnie odkleić taśmę samoprzylepną z paska testowego ze studzienkami NIE wyrzucać
taśmy, ponieważ będzie potrzebna później.
3.3. Używając jałową pipetkę pasterowską dodać 4 krople (ok. 100 – 125 µl) zawiesiny bakteryjnej do
każdej studzienki na pasku.
3.4. Po posianiu, pokryć studzienkę nr 21 (arginina) 3-4 kroplami oleju mineralnego.
3.5. Zakleić wierzch paska taśmą samoprzylepną odklejoną wcześniej i inkubować w temp. 30°C
przez 24 do 48 godzin. Należy się upewnić czy znajdują się perforacje w folii zakrywającej nad
studzienkami z cytrynianem i ONPG, na pasku BAC2. Odczytać wyniki po 18 - 24 godz.
inkubacji.
3.6. Jako sprawdzian czystości zawiesiny, nanieść 1 kroplę na płytkę z odpowiednim podłożem
nieselektywnym. Inkubować płytkę tlenowo w temp. 30°C przez 18 - 24 godz.
MICROGEN BACILLUS ID
Strona 4
4. Interpretacja
4.1. Po 24 godzinach usunąć taśmę samoprzylepną i zapisać wszystkie wyniki w dostarczonym
formularzu ze studzienek 1 do 18 (węglowodany) w odniesieniu do studzienki kontrolnej.
Wszystkie wyniki o kolorze bardziej pomarańczowym czy żółtym w stosunku do kontroli
powinny być oznaczone jako pozytywne. Testy na argininę, ONPG i cytrynian powinny być
odczytywane w porównaniu z formularzem wyników. Zapisać wszystkie wyniki na
dostarczonym formularzu, przykryć paski folią i inkubować przez dalsze 24 godziny w temp.
30˚C.
4.2. Po 48 godzinach inkubacji dodać odpowiednie odczynniki do następujących studzienek
w drugim pasku:
4.2.1. Dodać 2 krople odczynnika Kovacs’a do studzienki 19. Odczytać i zapisać wynik po 60
sekundach. Utworzenie koloru różowego/czerwonego wskazuje na wynik dodatni.
4.2.2. Dodać po jednej kropli odczynników VPI i VPII do 23 studzienki i odczytać po 15-30
minutach. Utworzenie różowego/czerwonego koloru wskazuje na wynik dodatni.
4.2.3. Wykonać test redukcji azotanów w 20 studzience, odczytać i zapisać wynik testu ONPG.
Dodać po 1 kropli odczynników Nitrate A i Nitrate B do studzienki i odczytać wynik po
60 sekundach.
4.3. Zapisać powyższe wyniki na dostarczonym formularzu.
4.4. Formularz wyniku
MICROGEN BACILLUS ID
Strona 5
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
Bezpieczeństwo:
1. Test Microgen Bacillus-ID jest przeznaczony do użytku laboratoryjnego przez wykwalifikowany
personel z zastosowaniem techniki aseptycznej, po uprzednim zapoznaniu się z załączoną
Instrukcją Obsługi.
2. Użyte materiały powinny być wyrzucone po uprzednim wyjałowieniu w autoklawie, spopieleniu
lub zanurzeniu w odpowiednim środku dezynfekcyjnym.
3. Taśmy przykrywające paski ze studzienkami reakcyjnymi nie izolują studzienek w sposób
całkowity, dlatego pasków nie należy inkubować w atmosferze wzbogaconej w CO2 (ze względu
na nieprawidłowy wpływ zmienionego pH) ani w cieplarce z wentylatorem (wykluczanie
nadmiernego wysuszenia).
4. Zawsze należy odczytywać wyniki fermentacji w odniesieniu do studzienki kontrolnej (studzienka
24, pasek 2).
5. Wyniki testów fermentacyjnych powinny być odczytywane po 24 i 48 godzinach inkubacji. Jeżeli
wynik testu jest pozytywny po 24 godzinach inkubacji, ale jest negatywny po 48 godzinach
inkubacji, zapisany wynik powinien być dodatni.
OGRANICZENIA TESTU
1. System Microgen Bacillus-ID jest przeznaczony tylko do identyfikacji drobnoustrojów należących
do rodzaju Bacillus. Nie można stosować tego testu do identyfikacji innych rodzajów.
2. Grupa B. cereus składa się z B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides i B. weihenstephanensis. Na podstawie
rutynowych testów biochemicznych powyższe gatunki są nierozróżnialne. Poniżej zamieszczone
informacje mogą pomóc w uzyskaniu identyfikacji.
Organizm
B. cereus
B. thuringiensis
B. mycoides
B. weihenstephanensis
Ruchliwość
+
+
–
?
3. B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis i B. pumilus należą do grupy B. subtilis. Jako że gatunki te są
blisko spokrewnione, wymagane może być wykonanie dodatkowych testów w celu uzyskania
satysfakcjonującej identyfikacji.
4. Zaleca się posianie wykonanej zawiesiny bakteryjnej na podłoże stałe w celu potwierdzenia, iż posiało
się czystą hodowlę jednego gatunku.
5. Test identyfikacyjny Microgen Bacillus-ID identyfikuje mikroorganizmy o optymalnej
temperaturze wzrostu mieszczącej się pomiędzy 25 a 45˚C (mezofile). Szczepy rosnące poniżej
25˚C (psychrofile) czy szczepy rosnące powyżej 45˚C (termofile) nie są identyfikowane przez test.
MICROGEN BACILLUS ID
Strona 6
KONTROLA JAKOŚCI
Poprawność działania systemu Microgen Bacillus-ID powinna być monitorowana z użyciem
odpowiednich szczepów kontrolnych. Do niezależnej kontroli laboratoryjnej użytkownika poleca się
następujące szczepy wzorcowe:
LITERATURA
1. Lapage S.P, S. Bascombe, W.R. Willcox and M.A. Curtis. 1973 Identification of Bacteria by Computer:
General Aspects and Perspectives J. Gen. Microbiol. 77: 273-290.
MICROGEN BACILLUS ID
Strona 7
BAZA DANYCH
System Microgen Listeria-ID jest oparty na standardowych metodach biochemicznych. Dane na temat interpretacji profili reakcyjnych są zgodne ze źródłami
literaturowymi.
1. Grupa B. cereus składa się z B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides i B. weihenstephanensis
2. B. alvei, B. polymyxa i B. macerans teraz Paenibacillus spp.
3. B. brevis i B. laterosporus teraz Brevibacillus spp.
4. B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis i B. pumilus należą do grupy B. subtilis
5. B. pantothenicus teraz Vergibacillus pantothenicus
Liczby wskazują na procent szczepów pozytywnych.
MICROGEN BACILLUS ID
Strona 8
KOLOROWA TABELA WYNIKÓW
MicrogenTM Bacillus-ID MID-66
Odczyt pasków po 24 i 48 godzinach
Uwaga: Chronić przed światłem. Ze względu na starzenie się papieru i odbarwianie laminatu, kolory w dołączonej do zestawu
tabeli wyników mogą ulec zmianie.
Legenda:
Przed odczytem wyników należy dodać odpowiednie odczynniki po 48 godzinach inkubacji.
Pokryć studzienkę olejem mineralnym.
(*) Negatywny wynik fermentacji węglowodanów u niektórych szczepów Bacillus może z czasem zmienić kolor
z czerwonego na pomarańczowy, dlatego przy zapisywaniu wyników w studzienkach 1 do 18 należy porównywać
je z negatywną kontrolą w 24 studzience.
GRASO Biotech
Krąg 4A, 83-200 Starogard Gd.
Dział Obsługi Klienta: 058 562 30 21, 058 562 56 61 do 64 wew. 30
[email protected]; www.podloza.pl; www.grasobiotech.pl;
MICROGEN BACILLUS ID
Strona 9