Biotechnologia środowiska dla OZE od 2014/2015 Ćwiczenie 8

Ćwiczenie 8
Biotechnologia środowiska dla OZE od 2014/2015
Wpływ substancji toksycznych na aktywności dehydrogenaz osadu czynnego.
Wprowadzenie
Proces biologicznego oczyszczania ścieków polega na sorpcji cząsteczek związków rozpuszczonych w ściekach na powierzchni
kłaczków osadu czynnego, dyfuzji do wnętrza komórek bakteryjnych oraz utlenieniu wchłoniętych przez komórkę związków i
usuwaniu produktów przemiany materii. O szybkości przemian biochemicznych w osadzie czynnym decydują nie tylko warunki
środowiskowe, ale także skład morfologiczny i ilość biomasy mikroorganizmów. Oczyszczanie jest możliwe jeżeli zapewnimy
mikroorganizmom odpowiednią ilość substratów, które są źródłem C:N:P oraz innych makro i mikroelementów, a proces
prowadzimy w warunkach tlenowych przy pH 6 - 8.
Oddychanie bakterii osadu czynnego może przebiegać drogą klasycznego łańcucha oddechowego. Procesowi temu towarzyszy
powstanie dużej ilości energii. Zachodzące przy oczyszczaniu ścieków osadem czynnym biochemiczne utlenianie związków
organicznych polega na ich odwodorowaniu (dehydrogenacji). W procesie tym odszczepione od substratu atomy wodoru
przenoszone są na tlen z wytworzeniem produktów w postaci H 2O lub H2O2. Łańcuch oddechowy oraz proces utleniania
biologicznego sprzężone są w komórce z fosforylacją oksydacyjną, tj. syntezą związków wysokoenergetycznych typu ATP. W
pierwszej fazie odwodorowania, katalizowanej przez dehydrogenazy osadu czynnego, zaktywowane atomy wodoru przenoszone
są kolejno przez odpowiednie kodehydrogenazy, nukleotyd dwufosfopirydynowy (DPN) i dwunukleotyd flawoadeninowy (FADN).
Druga faza odwodorowania polega na aktywizacji ostatecznego akceptora – tlenu atmosferycznego do tlenu aktywnego. Reakcja
katalizowana jest przez oksydazę cytochromową, współpracującą z cytochromami, złożonymi białkami zawierającymi grupy czynne
w postaci żelazoporfiryn. Cytochromy, przez odwracalny proces oksydacyjno-redukcyjny żelaza grup żelazoporfirynowych, mają
zdolność przenoszenia elektronów z odszczepionych atomów wodoru na zaktywowany atom tlenu, czemu towarzyszy
powstawanie cząsteczki wody
2H+ + O2- → H2O
Na efektywność biologicznego utleniania związków organicznych w ściekach ma wpływ rodzaj dostępnego substratu. W ściekach
komunalnych można wyróżnić związki organiczne rozpuszczone oraz w formie zawiesin. Związki organiczne występujące w postaci
rozpuszczonej dzieli się na bardzo łatwo, łatwo oraz trudno rozkładalne. Frakcję nierozpuszczalną (zawiesiny) można podzielić na
łatwo i trudno rozkładalną. Przyjmuje się, że frakcje bardzo łatwo i łatwo rozkładalna składają się z substancji, które mogą być
bezpośrednio adsorbowane przez mikroorganizmy i metabolizowane dla potrzeb syntezy i pozyskiwania energii. Natomiast frakcja
trudno rozkładalna wymaga rozbicie przez enzymy zewnątrzkomórkowe przed adsorpcję i wykorzystaniem przez mikroorganizmy.
Aktywność dehydrogenaz może służyć jako wskaźnik aktywności mikroorganizmów osadu czynnego. Aktywność dehydrogenaz
jest zależna od rodzaju mikroorganizmów, ich fazy wzrostu i żywotności oraz składu fizyko-chemicznego ścieków, a także od
obciążenia osadu ładunkiem zanieczyszczeń. W celu wykonania oznaczenia konieczne jest rozbicie kłaczków osadu ze względu na
zlokalizowanie enzymów łańcucha oddechowego.
Metoda spektrofotometryczna z chlorkiem trójfenylotetrazoliowym (TTC) służy do kontroli procesu oczyszczania ścieków metodą
osadu czynnego. Badanie to jest szczególnie konieczne w przypadku oczyszczania ścieków zawierających szereg związków
toksycznych, inhibitorów reakcji biochemicznych. Metoda oznaczania dehydrogenaz służy do oceny aktywności biochemicznej
mikroorganizmów w procesach utleniania związków organicznych. Oznaczanie tych enzymów stosuje się do kontroli
prawidłowości przebiegu procesu oczyszczania ścieków oraz określania stopnia adaptacji osadu czynnego do ścieków
przemysłowych. W przypadkach pogarszania się efektu oczyszczania ścieków, pomiar aktywności dehydrogenaz daje podstawę do
wprowadzania zmian parametrów technicznych. Czynnikami przeszkadzającymi w oznaczaniu są światło i tlen.
Metoda spektrofotometryczna z TTC (PN-82 C-04616.08)
Oznaczenie aktywności dehydrogenaz w osadzie czynnym polega na pomiarze ilości trójfenyloformazanu (TF) wytworzonego z
chlorku trójfenylotetrazoliowego (TTC). Aktywność dehydrogenaz przejawia się w procesie odwodornienia substratu – glukozy,
dodanego do próbki osadu czynnego i przeniesienia wodoru na bezbarwny związek biologicznie czynny TTC, który ulega redukcji
do TF o zabarwieniu czerwonym. Reakcja odwodornienia glukozy przez dehydrogenazy zachodzi podczas inkubacji odtlenionych
próbek w określonym czasie, temperaturze i odczynie. Intensywność zabarwienia zależy od ilości wytworzonego formazanu i jest
proporcjonalna do aktywności enzymatycznej mikroorganizmów. TF zostaje wyekstrahowany z próbki za pomocą alkoholu nbutylowego. Intensywność zabarwienia ekstraktu oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali 490 nm. W oznaczeniu
uwzględnia się badanie próbki kontrolnej bez dodatku substratu egzogennego – glukozy, w celu określenia intensywności
oddychania endogennego mikroorganizmów osadu czynnego. Jeżeli aktywność dehydrogenaz w próbce z dodatkiem glukozy jest
równa lub niższa niż aktywność dehydrogenaz w próbce bez dodatku glukozy, w której zachodzi oddychanie endogenne, oznacza
to że dodana glukoza nie stanowi źródła dla mikroorganizmów osadu, a więc osad czynny wykazuje aktywność tylko w stosunku
do substratów wewnątrzkomórkowych. Ze względu na trudności w określaniu żywej biomasy, oznaczane są zawartości zawiesin
ogólnych osadu, w których skład wchodzą żywe organizmy i zawiesiny. Jako wynik oznaczenia przyjmuje się iloraz ilości
trójfenyloformazanu do zawartości zawiesin ogólnych.
Degradacja fenolu
Fenole są związkami toksycznymi (powodującymi uszkodzenia narządów miąższowych) stosowanymi w przemyśle jako
półprodukty. Występują głównie w ściekach pochodzących z przemysłu petrochemicznego, farmaceutycznego, papierniczego,
hutniczego, tworzyw sztucznych. Największe ilości znajdują się w ściekach pochodzących z produkcji fenolu i acetonu – stężenie
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Ćwiczenie 8
Biotechnologia środowiska dla OZE od 2014/2015
Wpływ substancji toksycznych na aktywności dehydrogenaz osadu czynnego.
3000-15000 ppm. Po wstępnym usuwaniu fizyko-chemicznym (adsorpcja na wymieniaczu anionowym) stężenie fenolu często
nadal jest wysokie i wynosi od 300 do 400 ppm. Prowadzonych jest wiele badań dotyczących biodegradacji fenolu w procesach
mikrobiologicznych lub enzymatycznych. Za degradację związku odpowiedzialne są m.in. bakterie Actinetobacter calcoaceticus,
Pseudomonas sp. CF600, Pseudomonas putida WAS2, drożdże np. Trichosporon oraz enzymy m.in. oksydaza o-dwufenolanowa
otrzymywana z grzybów, oksydaza polifenolowa lub peroksydazy. Ograniczenia metod mikrobiologicznych, to przede wszystkim
możliwość oczyszczania ścieków o niskich stężeniach fenolu (do 30 ppm) oraz małej objętości. Metody te charakteryzują się długim
czasem reakcji, dużą wrażliwością na zmiany temperatury i pH. Szeroko stosowaną obecnie metodą oczyszczania ścieków zarówno
miejskich jak i przemysłowych jest biologiczna metoda oczyszczania ścieków z wykorzystaniem osadu czynnego. Zasadą
oczyszczalni biologicznej jest otrzymanie zawiesiny osadu w ściekach podczas mieszania i napowietrzania. Ilość osadu czynnego w
oczyszczalni jest regulowana poprzez odprowadzanie tzw. osadu nadmiernego oraz recylkulację. Układy technologiczne
oczyszczania ścieków metodą osadu czynnego różnią się między sobą stopniem biologicznego oczyszczenia. Systemy oczyszczania
ścieków metodą osadu czynnego różnią się między sobą:
- stopniem obciążenia osadu ładunkiem zanieczyszczeń
- wiekiem osadu
- czasem napowietrzania
- sprawnością i efektywnością oczyszczania ścieków.
Usuwanie węglowodorów ze ścieków metodą osadu czynnego polega na ich adsorpcji na kłaczkach oraz rozkładzie biologicznym.
Wymagana jest wstępna aklimatyzacja osadu do danego rodzaju ścieków.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest zbadanie wpływu substancji toksycznych (fenol, sole metali ciężkich) na aktywność dehydrogenaz
mikroorganizmów osadu czynnego oznaczanych metodą spektrofotometryczną z TTC.
Wykonanie ćwiczenia
1.
-
Odczynniki stosowane w analizie:
osad czynny
0,05 M bufor Tris-HCl, pH=8,4
woda buforowana
0,4 % wodny roztwór TTC
0,36 % wodny roztwór siarczynu sodu
alkohol n-butylowy,
15 % octan ołowiu
1 % r-r fenolu
2.
Oznaczanie suchej masy osadu czynnego
Suchą masę osadu czynnego należy oznaczyć, gdyż aktywności dehydrogenaz (A1) mikroorganizmów osadu czynnego
podaje się w przeliczeniu na jego suchą masę [mg/cm3].
2.1. 15 minut przed rozpoczęciem pomiaru włączyć wagosuszarkę – urządzenie musi się nagrzać.
2.2. Po 15 minutach otworzyć wieko wagosuszarki, umieścić w niej wieczko szalki Petriego i nacisnąć dwukrotnie przycisk
TARE- tarując wagosuszarkę z szalką.
2.3. Na szalkę Petriego wprowadzić 5ml wymieszanego osadu czynnego – zanotować masę osadu!. Zamknąć pokrywę
wagosuszarki.
2.4. Nacisnąć przycisk F1 (programowanie temperatury) i klawiszem F2 ustawić temperaturę – 1040C.
2.5. Nacisnąć klawisz F1 (czas próbkowania) i klawiszem F2 ustawić czas próbkowania – 5 lub 10.
2.6. Nacisnąć klawisz F1 – pojawi się komunikat na wyświetlaczu READY – potwierdzić ponownie naciskając F1 – rozpoczyna
się pomiar. Wynik podawany jest w % wilgotności próbki. Pomiar prowadzić do momentu uzyskania stałej wartości
wilgotności (wagosuszarka sama zakończy pomiar po ok. 20-30 minutach).
2.7. Zapisać wynik i wyliczyć suchą masę analizowanej próbki. Zakończyć pomiar naciskając klawisz TARE – otworzyć pokrywę
wagosuszarki, wyciągnąć szalkę z osadem, zamknąć i wyłączyć urządzenie. Szalkę Petriego dokładnie umyć.
3.
Przygotowanie próbki osadu do badań.
Pobrać 50 cm3 dokładnie wymieszanego osadu czynnego do zlewki o pojemności 250 cm3 i zhomogenizować przez 0,5 min
przy 2500 obr/min.
4.
Wykonanie oznaczenia
4.1. W 3 probówkach okrągło dennych z podziałką i szlifem o pojemności 25 cm3 przygotować roztwory wg tabeli 1 (objętości
poszczególnych składników w cm3).
Tabela 1 Objętość roztworów [cm3] w mieszaninie reakcyjnej
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Ćwiczenie 8
Biotechnologia środowiska dla OZE od 2014/2015
Wpływ substancji toksycznych na aktywności dehydrogenaz osadu czynnego.
Roztwór
Bufor Tris-HCl
Homogenat osadu
Fenol
Octan ołowiu
Woda buforowana
Siarczyn sodu
TTC
1 - osad czynny
5
5
2
1
2
2 - osad czynny + fenol
5
5
1
1
1
2
3 - osad czynny + octan ołowiu
5
5
1
1
1
2
4.2. Po zamknięciu korkiem szklanym zawartość próbek dokładnie wymieszać. Inkubować w ciemności w temperaturze 37 0C
przez 30 minut.
UWAGA – czekając na przebieg reakcji należy podgrzać wodę do temperatury ok. 900C, w zlewce (podgrzewając na
kuchence) lub włączając i programując łaźnię wodną.
4.3. Do każdej próbki wlać po 8 cm3 n-butanolu i po zatkaniu korkiem dokładnie wymieszać.
4.4. Próbki termostatorować przez 5 minut w wodzie o temperaturze ok. 900C.
4.5. Następnie ostrożnie wyciągnąć probówki z gorącej wody (nie wstrząsać próbek) i z każdej pobrać 5 cm3 ekstraktu
butanolowego (faza górna), przenieść do probówki wirówkowej i odwirować przy 1000 obr/minutę przez 10 minut.
4.6. Po zakończeniu wirowania zdekantować ciecz znad osadu do probówek szklanych i zmierzyć absorbancję klarownego
roztworu w spektrofotometrze przy długości fali = 490 nm.
Dla każdej próby wykonać co najmniej 3 pomiary absorbancji.
4.7. Dla uśrednionych wyników pomiarów absorbancji próbek osadu czynnego, oraz osadu zawierającego fenol i octan ołowiu
odczytać na krzywej wzorcowej zawartość TF w μmolach.
5.
Obliczenie wyniku oznaczenia
5.1. Aktywność dehydrogenaz (A1) osadu czynnego obliczyć w μmolach na 1 mg suchej masy osadu wg wzoru:
𝑨𝟏 =
𝒂𝟏 ∙ 𝟐𝟎𝟎
𝟓 ∙ 𝒔𝒎
gdzie:
a1 – odczytana z krzywej wzorcowej ilość TF, odpowiadająca próbce osadu o objętości 5 cm 3 [µm]
sm – sucha masa osadu [mg/cm3]
5 – współczynnik przeliczeniowy z objętości 10 cm3 na 50 cm3 alkoholu n-butylowego
200 – współczynnik przeliczeniowy z objętości 5 cm3 na 1 dm3
Krzywa wzorcowa do obliczenia stężenia TF [µm] w próbce na podstawie absorbancji:
Y = 21,06x – 0,197
gdzie: y – ilość TF w mg/l
x - absorbancja
6.
Opracowanie wyników
W sprawozdaniu umieścić wszystkie wyniki pomiarów i obliczenia. Sprawozdanie podsumować wnioskami wyciągniętymi na
podstawie przeprowadzonego doświadczenia – określając wpływ substancji toksycznych na aktywność enzymatyczną
mikroorganizmów osadu czynnego.
7.
Literatura
7.1. Minczewski J., Marczenko Z., chemia analityczna. Chemiczne metody analizy ilościowej, PWN, Warszawa 1998.
7.2. Dymaczewski Z., Poradnik eksploatatora oczyszczalni ścieków. Polskie Zrzeszenie inż. I tech. Sanitarnych, Poznań, 1997.
7.3. Hermanowicz W., Fizyczno-chemiczne badanie wody i ścieków, Arkady, Warszawa, 1999.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba