Tytuł dokumentu

Metody Kinetyki Biomolekularnej
in vitro i in vivo
druga seria zadań
11 października 2016
Wprowadzenie.
Roztwór może być przedstawiony jako układ dyskretnych pozycji, w jakich mogą się znaleźć
cząsteczki substancji rozpuszczonej (patrz Rysunek 11 ). Objętość naczynia jest podzielona na Ω
sześciennych komórek wypełnionych rozpuszczalnikiem. Niektóre z tych komórek są zajęte przez
jedną z N cząsteczek substancji rozpuszczonej. Każda komórka może pomieścić co najwyżej
jedną cząsteczkę substancji rozpuszczonej.
Rysunek 1: Kratowy model roztworu.
Zadanie 1. Wykorzystaj kratowy model roztworu przedstawiony we wstępie i zagadnienie funkcji rozkładu przedstawione na wykładzie, aby określić prawdopodobieństwo związania ligandu
przez receptor, jako funkcję stężenia ligandu.
Rysunek 2: Kratowy model roztworu receptora i ligandów.
Rozwiązanie: W naszym kratowym modelu roztworu rozważmy Ω komórek, z których każda,
o objętości v, może pomieścić tylko jedną cząsteczkę ligandu. Każda komórka może więc być
albo pusta albo zawierać jedną cząsteczkę liganda. Całkowita objętość układu wynosi więc
V = Ω · v. Jak ligand znajduje się w takiej komórce to ma energię solwatacji sol . Cząsteczek
ligandu jest L, więc jak nie ma związania z receptorem to energia roztworu wynosi L · sol . Gdy
1
Ten i kolejny rysunek, wzięte z Physical Biology of the Cell, R. Phillips, J. Kondev, J. Theriot, H. Garcia.,
Garland Sci.
1
miejsce wiążące receptora jest zajęte przez ligand to energia tego ligandu wynosi b , a energia
całego roztworu wynosi b + (L − 1)sol .
Jeśli receptor jest niezajęty to mamy
Ω!
L!(Ω − L)!
mikrostanów charakteryzujących możliwe rozłożenia L cząsteczek pomiędzy Ω komórek elementarnych. Wzór bierze się stąd, że pierwszą cząsteczkę ligandu możemy wstawić do roztworu
na Ω sposobów, dla każdego z tych sposobów, drugą cząsteczkę możemy wstawić na Ω − 1
sposobów, itd. Mamy więc
Ω · (Ω − 1) · (Ω − 2) · . . . · (Ω − (L − 1)) =
Ω!
(Ω − L)!
sposobów. Ponieważ cząsteczki są nierozróżnialne, to różnych sposobów jest L! razy mniej,
stąd nasz wzór. Energia każdego z powyższych mikrostanów wynosi Lsol . W tej sytuacji suma
stanów (funkcja rozkładu) jest równa
ZLsol =
Ω!
e−βLsol
L!(Ω − L)!
Jeśli teraz receptor wiąże jedną cząsteczkę liganda, to pozostałe L − 1 może być rozłożone na
Ω!
(L − 1)!(Ω − L + 1)!
różnych sposobów pomiędzy Ω komórek, a energia każdego z mikrostanów wynosi (L−1)sol +b .
W tej sytuacji suma stanów jest równa
sol
ZL−1
=
Ω!
e−β(L−1)sol e−βb
(L − 1)!(Ω − L + 1)!
Całkowita suma stanów wynosi
sol
Z(L, Ω) = ZLsol + ZL−1
Prawdopodobieństwo, że ligand jest związany przez receptor wynosi
pb =
sol
ZL−1
sol
ZLsol + ZL−1
Korzystając z wyrażeń na sumy stanów mamy
Ω!
e−β(L−1)sol e−βb
(L − 1)!(Ω − L + 1)!
pb =
Ω!
Ω!
e−βLsol +
e−β(L−1)sol e−βb
L!(Ω − L)!
(L − 1)!(Ω − L + 1)!
co upraszczamy do postaci
L
L
e−β(b −sol )
e−β∆
Ω
−
L
+
1
Ω
−
L
+
1
≡
pb =
L
L
−β(
−
)
b
sol
1+
e
1+
e−β∆
Ω−L+1
Ω−L+1
2
(∗)
Zaniedbując jedynkę wobec Ω i L, oraz wprowadzając stężenie ligandów w roztworze w postaci
ułamka objętościowego φ = L/Ω, mamy
φ −β∆
e
1−φ
pb =
φ −β∆
1+
e
1−φ
W problemach takich jak ten rozważany w tym zadaniu, często korzystamy z przybliżenia
Ω!
≈ ΩL
(Ω − L)!
gdy Ω L
Gdy skorzystamy, to z tego przybliżenia w równaniu (*) to dostaniemy
ΩL−1 −β(L−1)sol −βb
e
e
(L − 1)!
pb = L
Ω −βL
ΩL−1 −β(L−1) −β
sol +
sol e
b
e
e
L!
(L − 1)!
Ostatni wynik możemy uprościć mnożąc licznik i mianownik przez (L!/ΩL )eβLsol :
L −β∆
e
φe−β∆
≡
pb = Ω
L
1 + φe−β∆
1 + e−β∆
Ω
Dostaliśmy więc prawie dokładnie to co w wyprowadzeniu nie korzystającym z powyższego
przybliżenia, bo dla Ω L
L
L
≈
Ω−L+1
Ω
Zadanie 2. Wyprowadź równanie na prawdopodobieństwo związania cząsteczki ligandu przez
receptor w modelu kratowym roztworu, zakładając, że cząsteczki ligandu są rozróżnialne.
Rozwiązanie: Gdy cząsteczki ligandu sa rozróżnialne to liczba możliwych rozłożeń tych cząsteczek w komórkach naszej kratownicy, gdy miejsce wiążące receptora jest wolne, wynosi
Ω!
(Ω − L)!
Energia układu wynosi przy tym L · sol .
Gdy miejsce receptorowe jest zajęte, to liczba możliwych konfiguracji jest równa liczbie możliwych przypadków utworzenia kompleksu pomnożonej przez liczbę możliwych rozłożeń L − 1
cząsteczek ligandu w Ω komórkach, a więc mamy
L·
Ω!
(Ω − L + 1)!
a energia układu wynosi (L − 1)sol + b .
3
Całkowita suma stanów wynosi więc
ZT = e−βL·sol ·
Ω!
L · Ω!
+ e−β[(L−1)sol +b ] ·
(Ω − L)!
(Ω − L + 1)!
a prawdopodobieństwo związania ligandu wynosi
pb =
e−β[(L−1)sol +b ] ·
e−βL·sol ·
Ω!
(Ω−L)!
+
L·Ω!
(Ω−L+1)!
e−β[(L−1)sol +b ] ·
L·Ω!
(Ω−L+1)!
Widać, że licznik i mianownik możemy skrócić przez czynnik L·Ω!·exp[−β(L−1)sol ], otrzymując
pb =
e−β·(b −sol ) ·
1
L·(Ω−L)!
+
1
(Ω−L+1)!
1
e−β·(b −sol ) · (Ω−L+1)!
Jest to dokładnie takie samo wyrażenie jakie otrzymaliśmy rozważając nierozróżnialne ligandy.
A więc dalsze postępowanie jest takie jak poprzednio.
Zadanie 3. Wiele procesów komórkowych to procesy polimeryzacji (transkrypcja, translacja,
tworzenie cytoszkieletu). Rozważ prosty model polimeryzacji, w którym każdy monomer jest
dodawany do rosnącego łańcucha, z tą samą stałą równowagi wiązania:
K
X1 + X1 X2
K
X2 + X1 X3
K
. . . Xn−1 + X1 Xn
Symbol Xn oznacza polimer złożony z n monomerów.
Mamy tu do czynienia z równowagą polimerów o wszystkich możliwych rozmiarach. Wyznacz,
w ramach tego modelu, średnią wielkość polimeru, w zależności od stężenia monomerów. Znajdź
prawdopodobieństwo utworzenia polimeru z n monomerów jako funkcji K i x ≡ [X1 ] (stężenia swobodnych monomerów). Wykaż, że średnia wielkość polimeru może być przedstawiona
równaniem
d ln Q
hni =
dKx
2
3
gdzie Q = 1 + Kx + (Kx) + (Kx) + . . . (wyrażenie to nosi nazwę ang. binding polynomial).
Rozwiązanie: Ponieważ reakcja
K
Xn−1 + X1 Xn
ma stałą równowagi K, to możemy zapisać
[Xn ] = K[X1 ][Xn−1 ]
Z kolei
K
Xn−2 + X1 Xn−1
też ze stałą równowagi K, więc
[Xn ] = K 2 [X1 ]2 [Xn−2 ]
oraz
4
[Xn−1 ] = K[X1 ][Xn−2 ]
Stosując to rekurencyjnie, dostaniemy
[Xn ] = K n−1 [X1 ]n ≡ K n−1 xn ;
[Xn−1 ] = K n−2 xn−1 ;
...
Prawdopodobieństwo, że polimer ma długość n wynosi
P (n) =
[Xn ]
[Xn ]
= P∞
[X1 ] + [X2 ] + . . .
i=1 [Xi ]
Suma w mianowniku jest szeregiem geometrycznym
∞
X
[Xi ] =
i=1
∞
X
K i−1 xi =
i=1
∞
1 X
Kx
x
1
·
=
(Kx)i =
K i=1
K 1 − Kx
1 − Kx
Podstawiamy ten wynik do wzoru na prawdopodobieństwo
P (n) = K n−1 xn
1 − Kx
= (Kx)n−1 (1 − Kx)
x
Średnia długość polimeru jest zatem dana wzorem
hni =
P∞
i=n
nP (n) =
P∞
i=n
P∞
(Kx)n )
i=n
d
n(Kx)n−1 (1 − Kx) = (1 − Kx) d(Kx)
(
d
= (1 − Kx) d(Kx)
Kx
1−Kx
= (1 − Kx)
1
1−Kx
−1
(1−Kx)2
Kx
1
= 1−Kx
1−Kx
− Kx
=1+
Wyznaczmy teraz Q
Q = 1 + Kx + (Kx)2 + . . .
jest to szereg geometryczny, więc
Q=
1
1 − Kx
Policzmy
1
d ln 1−Kx
d ln Q
1
1
1
=
=
· (−1) ·
· (−1) =
2
d(Kx)
d(Kx)
1/(1 − Kx)
(1 − Kx)
1 − Kx
czyli dostaliśmy wzór na hni.
Zwróćmy uwagę, że jak Kx → 1 to hni dąży do nieskończoności. Wynika to z tego, że Kx =
[Xn ]/[Xn−1 ] – czyli, że równowagowe stężenie polimeru dłuższego nie jest mniejsze niż polimeru
krótszego, a to implikuje polimery nieskończenie długie.
Zadanie 4. Wykorzystaj wzór Boltzmanna na entropię układu termodynamicznego, wyprowadzony w oparciu o rozważania statystyczne:
S = kB ln W
gdzie kB jest stałą Boltzmanna, a W jest liczbą mikrostanów dostępnych dla układu w danym
stanie makroskopowym, aby określić entropię cząsteczki DNA posiadającej N niespecyficznych
miejsc wiążących cząsteczkę danego białka, gdy zajętych jest Np miejsc wiążących.
Rozwiązanie: Zakładamy, że energia wiązania białka do DNA jest taka sama dla każdego miejsca niespecyficznego, co niekoniecznie musi być prawdą, lecz co zapewnia nam, że przyłączenie
5
cząsteczki białka do każdego z niespecyficznych miejsc wiążących jest tak samo prawdopodobne.
Wyznaczymy entropię jako funkcję liczby miejsc wiążących i liczby związanych białek:
S = kB ln W (Np ; N )
Przyłączając białko do DNA ze wszystkimi miejscami pustymi mamy N możliwości umieszczenia cząsteczki białka, to zmniejsza się o 1 w miarę zapełniania kolejnych miejsc, więc liczba
możliwych kombinacji wynosi
N × (N − 1) × (N − 2) × · · · × (N − Np + 1)
Ponieważ cząsteczki białka są nierozróżnialne, to ich przestawianie, w danym stanie mikroskopowym, nie zmienia tego stanu mikroskopowego, konsystentnego z danym stanem makroskopowym, który z kolei określa jedynie całkowita liczba związanych cząsteczek. Tych możliwych
przestawień jest Np !, mamy więc
W (Np ; N ) =
N!
N × (N − 1) × (N − 2) × · · · × (N − Np + 1)
=
Np !
Np !(N − Np )!
Dla cząsteczki DNA E. coli o liczbie 5 × 106 niespecyficznych miejsc wiążących dla represorowego białka Lac, która ma średnio przyłączonych 10 cząsteczek białka, liczba rozróżnialnych
mikrostanów, odpowiadających związaniu tej liczby cząsteczek białka wynosi około 3 × 1060 .
Teraz możemy przywołać wzór Boltzmanna na entropię i mamy
S = kB ln
N!
Np !(N − Np )!
Jednym z kluczowych przybliżeń jakie potrzebne są w przypadku obliczania wielkości takich
jak powyżej otrzymana, jest wzór Stirlinga, który w najprostszej wersji przyjmuje postać
ln N ! ≈ N ln N − N
Korzystając z tego wzoru dostajemy
S = kB N [c ln c + (1 − c) ln(1 − c)] = kB N ln
c
1−c
c
(1 − c)
gdzie c ≡ Np /N . Na koniec można spróbować wykreślić zależność S od c lub przynajmniej
wyznaczyć c dla którego S przyjmuje ekstremum i przekonać się że jest to maksimum.
dS
1−c
c
= kB N ln c + 1 − ln(1 − c) −
= kB N ln
dc
1−c
1−c
przyrównujemy to do zera
ln
c
=0
1−c
⇒
c
=1
1−c
Zadanie 5. Oceń dokładność przybliżenia
Ω!
≈ ΩL
(Ω − L)!
6
⇒
c=
1
2
dla L = 10 i Ω = 102 ; 104 ; 106 .
Rozwiązanie: Rozważmy Ω = 106 i L = 10. Mamy zatem
106 !
=
(106 − 10)!
106 · (106 − 1) · (106 − 2) · (106 − 3) · (106 − 4) · (106 − 5) · (106 − 6) · (106 − 7) · (106 − 8) · (106 − 9)
= (1012 − 106 ) · (1012 − 5 · 106 + 6) · (1012 − 9 · 106 + 20) · (1012 − 12 · 106 + 42) · (1012 − 17 · 106 + 72)
= (1012 − 106 ) · (1024 − 14 · 1018 + 71 · 1012 − 154 · 106 + 120)·
·(1024 − 29 · 1018 + 318 · 1012 − 1578 · 106 + 3024)
tu zaniedbajmy wyrazy w sumach w nawiasach okrągłych, które są mniejsze o przynajmniej
12 rzędów wielkości niż największy wyraz. One w sumie dają wielkości ujemne, mamy więc
oszacowanie od góry
(1012 − 106 ) · (1024 − 14 · 1018 + 71 · 1012 ) · (1024 − 29 · 1018 + 318 · 1012 )
= (1012 − 106 ) · (1048 − 43 · 1042 + 795 · 1036 − 6511 · 1030 + 22578 · 1024 )
= 1060 − 44 · 1054 + 838 · 1048 − 7306 · 1042 + 29089 · 1036 − 22578 · 1030
≈ 1060 − 44 · 1054 + 0.000838 · 1054 − 0.000000007306 · 1054 = 1060 − 43.9991620073 · 1054
i oszacowanie od dołu
(1012 − 106 ) · (1024 − 14 · 1018 + 70 · 1012 ) · (1024 − 29 · 1018 + 317 · 1012 )
= (1012 − 106 ) · (1048 − 43 · 1042 + 793 · 1036 − 6468 · 1030 + 22190 · 1024 )
= 1060 − 44 · 1054 + 836 · 1048 − 7261 · 1042 + 28661 · 1036 − 22190 · 1030
≈ 1060 − 44 · 1054 + 0.000836 · 1054 − 0.000000007261 · 1054 = 1060 − 43.9991640073 · 1054
Po pierwsze widzimy jak mała jest różnica między oszacowaniem od góry i od dołu, w porównaniun z wynikiem. Po drugie wynik prawdziwy różni się od 1060 o mniej niż 0.005% w sensie
błędu względnego
7