Ćwiczenia X

Biochemia: Ćw. – Metoda RT-PCR
METODA RT-PCR
Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych:
alkohol izoamylowy
bromek etydyny
chloroform
EDTA
etanol, 96%
fenol
izotiocyjanian guanidyny
kwas octowy, 96%
Tris
– Xn
– T+
– Xn
– Xi
–F
– T, C
– Xn
–C
– Xi
Metoda łańcuchowej reakcji polimerazy poprzedzona odwrotną transkrypcją (RT-PCR, ang. reverse transcription
polymerase chain reaction) używana jest najczęściej do badania ekspresji genów. Bezpośrednim i najbardziej
miarodajnym sposobem sprawdzenia, czy gen ulega ekspresji w danej komórce jest wykrycie obecności
transkryptu danego genu – cząsteczek mRNA. Technika RT-PCR składa się z dwóch etapów:
- reakcji odwrotnej transkrypcji, w której mRNA przepisywane jest na cDNA,
- amplifikacji (wielokrotnego powielenia) cząsteczek cDNA metodą PCR.
W celu oceny ekspresji genu wykonuje się elektroforezę produktów (amplifikatów) reakcji PCR najczęściej w żelu
agarozowym.
1. PRZYGOTOWANIE RNA
1.1. IZOLACJA RNA ZMODYFIKOWANĄ METODĄ CHOMCZYŃSKIEGO
Fenolowo-chloroformowa izolacja RNA z użyciem izotiocyjanianu guanidyny (GTC) została opracowana przez
Chomczyńskiego i Sacchi w 1987 roku (Chomczynski P., Sacchi N. (1987) Single-step method of RNA isolation
by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162(1):156-9).
Materiałem do izolacji RNA w opisanym poniżej doświadczeniu są komórki linii komórkowych hodowane
warunkach in vitro. Wszystkie etapy izolacji należy wykonać w lodzie, używając czystych rękawiczek oraz
sterylnych końcówek i probówek.
Wykonanie:
1.1.1. Po osiągnięciu 70-80% zarośnięcia naczynia hodowlanego komórki adherentne przemyć zimną pożywką
nie zawierającą surowicy a następnie zbuforowanym roztworem soli fizjologicznej (PBS, ang. phosphate buffered
saline). Po dokładnym odciągnięciu PBS komórki zebrać w 300 l roztworu GTC używając sterylnego skrobaka i
przenieść do probówki o pojemności 1.5 ml. Lizaty komórkowe pipetować 10-krotnie (w efekcie roztwór staje się
lepki). Dodać 30 l 3 M octanu sodu (pH 4), 300 l fenolu i 60 l mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy
(1:49). Wymieszać przez pipetowanie i inkubować 15 min w lodzie. Wirować przez 10 min, 10.000 rpm, (ang.
revolutions per minute, liczba obrotów na minutę). Ostrożnie zebrać fazę wodną (górną) zawierającą RNA do
nowej probówki.
1.1.2. Do 100 ul wyizolowanego RNA dodać 10 l 3 M octanu sodu (pH 5.2) i 250 l 96% etanolu (-20C).
Wymieszać dokładnie i inkubować przez 30 min w temperaturze -20C. Wytrącone RNA wirować przez
10 min, 13.000 rcf (ang. relative centrifugal force, względna siła odśrodkowa), wirówka miniSpin plus (Eppendorf).
Zebrać dokładnie nadsącz a peletę przemyć 250 l 70% etanolu i wymieszać przez worteksowanie. Ponownie
zwirować przez 10 min, 13.000 rcf. Po dokładnym zebraniu nadsączu peletę wysuszyć pod lampką (ok.10 min) a
następnie rozpuścić w 10 l wody dejonizowanej.
1
Biochemia: Ćw. – Metoda RT-PCR
W celu określenia odzysku RNA po precypitacji zmierzyć jego stężenie w roztworze wyjściowym oraz
precypitacie. Obliczyć ilość RNA w roztworze wyjściowym i precypitacie oraz procent RNA odzyskany po
precypitacji oceniając wydajność precypitacji.
Tabela1. Bilans precypitacji RNA.
RNA
A260
A280
A260/A280
stężenie RNA [ng/µl]
ilość RNA [µg]
odzysk
RNA [%]
roztwór wyjściowy
precypitat
1.2. OKREŚLENIE STĘŻENIA ORAZ CZYSTOŚCI RNA
Kwasy nukleinowe selektywnie pochłaniają światło ultrafioletowe (UV) wykazując maksimum absorbancji przy
długości fali 260 nm. Zjawisko to znajduje zastosowanie w oznaczaniu stężenia kwasów nukleinowych. Roztwory
kwasów nukleinowych mogą być zanieczyszczone białkami. W celu określenia czystości przygotowanego
preparatu mierzy się OD również przy dł. fali 280 nm (maksimum absorbancji dla białek). Preparat uznaje się za
czysty wówczas, kiedy stosunek A260/A280 dla RNA jest równy lub zbliżony do 2.0.
Wykonanie: W spektrofotometrze do mikroobjętości (Nano-Drop 2000, Thermo Scientific) zmierzyć absorbancję
przy dł. fali 260 i 280 nm względem próby ślepej (wody dejonizowanej). Spektrofotometr w oparciu o zadaną
wartość współczynnika absorbancji (dla RNA 1 jednostka A260 równa jest 40 g/ml) przelicza zmierzoną wartość
absorbancji na stężenie wyrażone w ng/µl. Wyznaczona wartość ilorazu A260/A280 świadczy o czystości preparatu
RNA.
2. ODWROTNA TRANSKRYPCJA
Cząsteczki kwasu mRNA przed amplifikacją w reakcji PCR należy przepisać na cDNA (ang. complementary DNA,
DNA komplementarne do mRNA) w procesie odwrotnej transkrypcji z użyciem enzymu – odwrotnej transkryptazy
(RT, ang. reverse transcriptase).
Wykonanie: W probówce o pojemności 0.5 ml 1 g RNA rozcieńczyć wodą wolną od RNaz do obj. 5 l.
Przygotować mieszaninę reakcyjną, składającą się z: buforu 10-krotnie stężonego, roztworu czterech
deoksyrybonukleozydotrifosforanów (dNTP), krótkich fragmentów oligodeoksyrybonukleotydowych (dT23), wody
wolnej od RNaz oraz odwrotnej transkryptazy. Zamieszczona poniżej tabela 2 zawiera skład mieszaniny
reakcyjnej na jedną próbkę.
Tabela 2. Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji odwrotnej transkrypcji.
1.
składniki mieszaniny
objętość [l]
bufor 10-krotnie stężony
2
2.
5 mM dNTP
2
3.
70 M oligo dT23
0,3
4.
woda wolna od RNaz
9,7
5.
odwrotna transkryptaza
1
razem
15
2
Biochemia: Ćw. – Metoda RT-PCR
Równocześnie z próbką badaną przygotować kontrolę negatywną: mieszanina reakcyjna z wodą wolną od RNaz
w miejsce RNA. Odwrotną transkryptazę dodać na końcu, tuż przed dodaniem mieszaniny do probówki
zawierającej RNA. Po zwirowaniu, probówki umieścić w termobloku i prowadzić reakcję zgodnie ze schematem
podanym w tabeli 3.
Tabela 3. Etapy odwrotnej transkrypcji.
nazwa cyklu
temperatura
czas [min]
1.
wstępna denaturacja
65ºC
5
2.
odwrotna transkrypcja
37ºC
60
3.
przerwanie reakcji
95ºC
5
4.
koniec reakcji
4ºC
3. AMPLIFIKACJA CDNA METODĄ PCR
Technika PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy lub reakcja łańcuchowa polimeryzacji) zapewnia uzyskanie w
przeciągu krótkiego czasu milionów – miliardów kopii badanego fragmentu DNA. Miejsce syntezy w cząsteczce
cDNA wskazują startery – krótkie sekwencje nukleotydowe komplementarne do początku i końca powielanego
odcinka cDNA. Proces syntezy katalizowany jest przez termostabilny enzym – polimerazę DNA. Najczęściej
stosowana jest polimeraza Taq wyizolowana z termofilnych bakterii Thermus aquaticus.
Wykonanie: Do probówki o pojemności 0.2 ml dodać 2 l cDNA. Przygotować mieszaninę odczynników do reakcji
PCR, w skład której wchodzi: bufor (10-krotnie stężony), roztwór czterech deoksyrybonukleozydotrifosforanów
(dNTP), MgCl2 (jony magnezu są kofaktorami polimerazy Taq), para starterów (R – ang. reverse i F – ang.
forward), woda wolna od RNaz oraz polimeraza Taq (tabela 4).
Tabela 4. Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji PCR
składniki mieszaniny
objętość [l]
1.
bufor 10x stężony
1
2.
10 mM dNTP
1.6
3.
MgCl2
1
4.
20 M starterów R
1
5.
20 M starterów F
1
6.
woda wolna od RNaz
2.15
7.
polimeraza Taq
0.25
razem
8
Równocześnie z próbką badaną przygotować kontrolę negatywną (mieszanina reakcyjna z wodą wolną od RNaz
w miejsce cDNA). Polimerazę Taq dodać na końcu, tuż przed przeniesieniem mieszaniny do probówki
zawierającej matrycę. Po krótkim zwirowaniu probówki umieścić w termocyklerze PCR i prowadzić reakcję
zgodnie ze schematem podanym w tabeli 5.
3
Biochemia: Ćw. – Metoda RT-PCR
Tabela 5. Etapy reakcji PCR.
nazwa cyklu
temperatura
czas [min]
1.
wstępna denaturacja
94ºC
3
2.
denaturacja
94ºC
1
3.
hybrydyzacja
temperatura zależy od
sekwencji starterów
1
4.
wydłużanie
72ºC
2
5.
końcowe wydłużanie
72ºC
6.
koniec reakcji
4ºC
35 cykli (pkty: 2 – 4)
10
4. ELEKTROFOREZA AGAROZOWA PRODUKTÓW REAKCJI PCR
Produkt reakcji PCR identyfikujemy rozdzielając uzyskany materiał w żelu agarozowym metodą elektroforezy. W
celu określenia wielkości badanego genu równocześnie rozdzielmy w żelu standardy masowe – fragmenty DNA o
znanej wielkości wyrażonej w ilości par zasad (pz, ang. base pair, bp). Na podstawie położenia badanego genu w
stosunku do standardów masowych określamy jego wielkość. Rozdzielone elektroforetycznie produkty reakcji
PCR wizualizujemy przy użyciu fluorochromu bromku etydyny (EtBr), który interkalując z dsDNA (dwuniciowym
kwasem deoksyrybonukleinowym,
ang. double stranded
deoxyribonucleic
acid) wykazuje
intensywną
fluorescencję w świetle UV.
Wykonanie
Przygotowanie 2% żelu agarozowego
Do kolby stożkowej o poj. 250 ml dodać 0.8 g agarozy oraz 40 ml buforu TAE (40 mM Tris-kwas octowy, pH 8.3,
1 mM EDTA). Dokładnie rozpuszczać agarozę ogrzewając w mikrofalówce przez 3-5 min. Zamieszać zawartość
kolby; jeśli agaroza nie uległa rozpuszczeniu kolbę umieścić ponownie na kilka minut w mikrofalówce. Złożyć
podstawę na żel z płytkami zamykającymi oraz grzebieniem do formowania studzienek. Do roztworu agarozy
schłodzonego pod wodą bieżącą do temp. 50-60ºC dodać 2.5 μl bromku etydyny (uwaga! bromek etydyny ma
działanie kancerogenne!). Dokładnie wymieszać a następnie wylać żel na podstawę i odczekać do zastygnięcia
(ok. 30 min). Wyjąć płytki zamykające podstawę z żelem oraz grzebień. Umieścić żel w aparacie horyzontalnym
(poziomym) wypełnionym buforem TAE (ok. 300 ml).
Przygotowanie próbek
Do probówki o pojemności 0.5 ml (lub na kawałkach parafilmu) przygotować próbki do elektroforezy dodając:
5 μl cDNA (amplifikatu uzyskanego w reakcji PCR),
1 μl 6-krotnie stężonego buforu do próbek (Loading Dye Solution, Fermentas).
Wymieszać i krótko zwirować.
Rozdział elektroforetyczny
Próbki nałożyć do studzienek w żelu agarozowym. Podłączyć elektrody do zasilacza i prowadzić rozdział przez 30
min przy napięciu 100 V. Pod wpływem pola elektrycznego ujemnie naładowane kwasy nukleinowe
przemieszczają się w żelu agarozowym od katody do dodatnio naładowanej anody z prędkością zależną od ich
wielkości.
4
Biochemia: Ćw. – Metoda RT-PCR
Wizualizacja kwasów nukleinowych
Po zakończeniu elektroforezy żel przenieść na folię. Wynik rozdziału elektroforetycznego analizować w świetle
UV używając transiluminatora (UVItec).
Zalecana literatura:
"Biochemia" J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, PWN; W-wa 2005.
"Biochemia Harpera" R.J. Murray, D.K. Granner, V.W. Rodwell, PZWL, W-wa 2008
„Biologia molekularna. Krótkie wykłady" PC Hames, AG McLennan, AD Bates, MRH White, PWN, W-wa 2007
„Biochemia. Krótkie wykłady" BD Hames, NM Hooper, PWN, W-wa 2005
5