Acta Bio-Optica et Informatica Medica

Acta Bio–Optica et Informatica Medica, Vol. 9, 2003
157
WZAJEMNE ODDZIAŁYWANIE POMIĘDZY KATIONOWĄ TETRAKIS
[4-(TRIMETYLAMINO)FENYLO] PORFIRYNĄ A KONKANAWALINĄ A
Katarzyna Polska, Magdalena Makarska, Stanisław Radzki
Wydział Chemii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Pl. M.C. Skłodowskiej 2,
20-031 Lublin, Poland, e-mail: [email protected],
http://hermes.umcs.lublin.pl/users/radzki
Streszczenie
Rozpuszczalne w wodzie meso-pochodne porfiryn są związkami, które mogą być wykorzystywane w fotodynamicznej terapii nowotworów (PDT) ze względu na wysokie powinowactwo do komórek rakowych oraz fototoksyczność. Wydajność i biodystrybucję porfiryn można poprawić łącząc je z makrocząsteczkami. Głównym celem pracy
było badanie tworzenia się kompleksów pomiędzy lektyną a porfiryną za pomocą miareczkowania spektrofotometrycznego. W badaniach wykorzystano rozpuszczalną w wodzie kationową tetrakis[4-(trimetylamino)fenyl]
porfirynę (H2TTMePP) oraz jej kompleks z Cu (II). Miareczkowanie UV-Vis roztworu porfiryny o stężeniu rzędu
10–6 M prowadzono roztworem ligandu – konkanawaliny A, (stężenie 10–3 M) w buforze TRIS przy różnych
wartościach pH. Wyznaczone stałe trwałości kompleksów konkanawaliny A z badanymi porfirynami wzrastają wraz
ze wzrastającą wartością pH. Otrzymane wyniki wskazują, że takie kompleksy par jonowych mogłyby ewentualnie
służyć jako nośniki sensybilizatorów w fotodynamicznej terapii nowotworów.
Abstract
Mutual interaction between cationic tetrakis[4-(trimethylammonio)phenyl] porphyrin and concanavalin A
The high affinity and phototoxicity of water-soluble meso-porphyrins to tumour cells allow their consideration as
promising compounds for PDT. Binding to macromolecules may significantly modulate the effectiveness and
biodistribution of porphyrins. The main purpose of our studies was examination of lectin-porphyrin complex
formation using spectrophotometric titration. The present work was concerned on the water-soluble cationic
porphyrin: tetrakis[4-(trimethylammonio)phenyl] (H2TTMePP) and its complex with Cu(II). UV-Vis titrations were
carried out using porphyrin concentration range about 10–6 M and concanavalin A as a ligand (concentration range
about 10–3 M) in the solution of TRIS buffer in various values of pH. The calculated constants of associations
between concanavalin A and porphyrins increase with increasing pH. Our results indicate that such ion–pair
complexes can potentially serve as drug delivery agents in photodynamic therapy.
Słowa kluczowe: kationowe porfiryny, kompleks Cu(II), konkanawalina A, fotodynamiczna terapia nowotworów
(PDT)
Key words: cationic porphyrins, complex Cu(II), concanavalin A, photodynamic therapy (PDT)
Wpłynęło: 10.05.2003
1. Wstęp
Fotosensybilizatorami w terapii fotodynamicznej nowotworów są m.in. porfiryny i ich pochodne. Porfiryny
należą do grupy makrocyklicznych związków aromatycznych. Zasadniczym elementem ich budowy jest
charakterystyczny makrocykl aromatyczny złożony z
czterech pierścieni pirolowych połączonych mostkami
metinowymi, który tworzy układ sprzężonych wiązań
podwójnych, zawierających 18 zdelokalizowanych
Rys. 1. Budowa pierścienia porfirynowego [1].
158
Acta Bio–Optica et Informatica Medica, Vol. 9, 2003
elektronów (rys. 1). Układ ten spełnia regułę aromatyczności Hückle'a (4n + 2, gdzie n = 4). Pierścienie
pirolowe tworzą zamkniętą, aromatyczną płaszczyznę,
stanowiącą centrum związku. Dzięki swojej budowie
pierścień porfirynowy może być zaangażowany w
olbrzymią liczbę reakcji chemicznych, a poszczególne
układy porfirynowe, choć zbudowane według podobnego schematu, mogą się różnić, między innymi:
– charakterem grup mostkujących, występujących pomiędzy pirolami (są to grupy: –CH=, =C(R)–, –N=
lub ich wzajemne kombinacje);
– rodzajem podstawników (wprowadzanych w miejsce atomów wodoru przy węglach piroli i mostkach
metinowych), którymi mogą być: –H, –CH3, –C2H5,
–CH=CH2, –CH(OH)CH3, –CHO, –COOH,
–CH2COOH, –(CH2)2COOH;
– możliwością uwodornienia jednego lub kilku wiązań podwójnych w pierścieniach pirolowych i
zamykania sąsiadujących podstawników w nowy
pierścień;
– rodzajem jonów metali lub niemetali przyłączonych
w miejsce atomów wodoru grup imidowych piroli
(rolę tę pełni już większość pierwiastków układu
okresowego), co pozwala na tworzenie bardzo
licznych związków koordynacyjnych;
– ponadto, reakcja ulteniania 18-elektronowego pierścienia porfirynowego, polegająca na oderwaniu
elektronu z orbitalu HOMO prowadzi do tworzenia
się twałych p-kationów.
Tabela 1. Wybrane przykłady podstawników porfiryn rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych w wodzie
PORFIRYNY NIEROZPUSZCZALNE W WODZIE
podstawnik
nazwa związku
PORFIRYNY ROZPUSZCZALNE W WODZIE
podstawnik
nazwa związku
meso-tetrafenylo-porfiryna
meso-tetrakis(4-hydroksyfenylo)porfiryna
OH
F
meso-tetrakis(pentafluorofenylo)-porfiryna
F
meso-tetrakis(4-metoksy-3-sulfonianoOCH3 fenylo)-porfiryna
F
SO3H
F
F
meso-tetrakis(metoksyfenylo)-porfiryna
meso-tetrakis(4-karboksyfenylo)porfiryna
OCH3
COOH
meso-tetrakis(metylofenylo)-porfiryna
meso-tetrakis(4-sulfonianofenylo)porfirySO3H na
CH3
meso-tetra(4-pirydylo)porfiryna
N
2,3,7,8,12,13,17,18-oktaetyloporfiryna
CH2-CH3
+
N
CH3
meso-tetrakis(N-metylo-4-pirydylo)porfir
yna
meso-tetrakis[4-(trimetyloamino)fenylo]+
-porfiryna
N(CH3)3
Acta Bio–Optica et Informatica Medica, Vol. 9, 2003
Porfiryny są nierozpuszczalne w wodzie, jednak
wprowadzenie do pierścienia porfirynowego odpowiednich podstawników umożliwia w mniejszym lub
większym stopniu ich rozpuszczalność, przy jednoczesnym zachowaniu wszystkich właściwości charakterystycznych dla tej grupy związków chemicznych.
Porfiryny rozpuszczalne w wodzie ze względu na
rodzaj podstawnika dzielimy na anionowe i kationowe.
Porfiryny anionowe występują zazwyczaj w postaci
soli sodowych, zaś porfiryny kationowe zawierają grupy p-metylosulfonianowe (tosylanowe) lub jodki neutralizujące jon dodatni. W Tabeli 1 zestawiono przykłady podstawników należących do wyżej wspomnianych grup.
Terapia fotodynamiczna otwiera nowe możliwości
rozpoznawania i leczenia nowotworów, chociaż stosowanie tej terapii na szerszą skalę ujawniło także jej poważne wady. Wybiórcze powinowactwo porfiryn do
tkanki nowotworowej okazało się dość iluzoryczne [2],
chociaż przyjmuje się, że kumulacja porfiryn następuje
szybciej w tkankach chorych aniżeli w zdrowych.
Jednak związki te są często w dużym stopniu pochłaniane przez wiele szybko rozwijających się tkanek, w
tym także skórę, co prowadzi do działań niepożądanych, związanych z nadwrażliwością na światło. Rozwiązaniem tego problemu mogłoby być dołączenie porfiryn do związków wykazujących również powinowactwo do komórek rakowych i ułatwiających porfirynom
przenikanie i kumulowanie się w takich komórkach.
2. Oddziaływania porfiryn z białkami
Mechanizm biologicznego wnikania porfiryn do komórek zależy przede wszystkim od rodzaju porfiryny,
a zwłaszcza jej charakteru chemicznego. Istotny wpływ
ma obecność i rodzaj metalu w centrum pierścienia
porfirynowego, rodzaj ligandu aksjalnego, a także stopień agregacji porfiryny [3–7]. Porfiryny o charakterze
silnie hydrofobowym mogą przenikać przez błonę komórkową, wiążąc się z obecnymi w niej lipidami, porfiryny umiarkowanie hydrofobowe wybierają jej regiony
bogate w białka, natomiast porfiryny o charakterze
polarnym pozostają w fazie wodnej, bo ich zdolność
przenikania przez błonę komórkową jest niewielka.
Wiele rozpuszczalnych w wodzie porfiryn, zarówno
z grupy anionowej, jak i kationowej, tworzy agregaty
z albuminami, głównymi składnikami osocza krwi.
159
Wzajemne oddziaływania porfiryn z albuminami są
przedmiotem szeregu prac. Wynika to z faktu, że porfiryny w roztworach zawierających albuminy stwarzają
środowisko, w którym panują warunki podobne do warunków w naturalnych tkankach. Ustalono, że szereg
porfiryn, takich jak anionowa sulfonowana tetrafenyloporfiryna [4], kationowa tetrametylo- lub benzylopirydylowa i ich kompleksy z miedzią(II) i indem(III)
[8–11], a także obojętne uro-, kopro-, hemato- czy protopofiryna [12–14] tworzą z albuminami kompleksowe
asocjaty o stechiometrii 1:1. Takie agregaty zawierające
kompleks porfiryny z białkiem mogą łatwiej pokonywać błonę komórkową, co w rezultacie podnosi ich
efektywność w terapii. Makrocząsteczki mogą również
poprawiać skuteczność biodystrybucji kompleksów
porfiryn z metalami.
Badanie oddziaływań rozpuszczalnych w wodzie
porfiryn z białkami ma jeszcze jeden aspekt. Otóż leki
zawierające porfiryny są zazwyczaj wprowadzane do
krwiobiegu jako dosyć stężone roztwory, co może
powodować wiele niekorzystnych skutków. Pozytywny
efekt takich badań może nie tylko ułatwić otrzymanie
leków trwałych, o wysokiej skuteczności biologicznej,
ale także bezpiecznych dla organizmu [4]. Zbadanie połączeń porfiryn z białkami pozwoli zapewne lepiej
zrozumieć mechanizm lokalizowania fotosensybilizatorów w guzach nowotworowych [15, 16]. Rodgers na
podstawie studiów nad podwójnymi kompleksami oligopeptydów i metaloporfiryn pochodnych od metylopirydyloporfiryny, wykazał, że w takich układach możliwy jest transfer elektronów, co jest warunkiem koniecznym do wytworzenia tlenu singletowego [3]. Kompleksy, które określa się często mianem jonowych par
kompleksowych, mają charakter zdecydowanie niekowalencyjny [17, 18].
Receptorowe właściwości rozpuszczalnych w wodzie porfiryn w stosunku do peptydów mogą być wykorzystane w katalizie i w technice sensorowej [19].
Szeroki przegląd możliwości immobilizowania białek
hemowych w zol-żelowych matrycach został przedstawiony w pracy Lana i współaut. [20]. Takie układy
mogą być wykorzystane do konstrukcji optycznych
czujników, w których białka hemowe zachowują wszystkie swoje funkcje biokatalityczne, chemiczne utleniająco-redukujące oraz możliwości przyłączania takich
ligandów jak O2, CO i NO.
160
Acta Bio–Optica et Informatica Medica, Vol. 9, 2003
3. Konkanawalina A – białko z grupy lektyn
Lektyny są białkami wykazującymi zdolność do specyficznego rozpoznawania i wiązania mono- i oligosacharydów oraz substancji je zawierających. Białka te,
przyłączając się do powierzchniowych glikoprotein i
glikolipidów innych komórek, mogą powodować ich
aglutynację (sieciowanie). Niektóre z nich mają również właściwości mitogenne wobec limfocytów. Po raz
pierwszy lektyny zostały zastosowane w badaniach immunologicznych. Obecnie ich właściwości bardzo szeroko wykorzystuje się w histochemii, immunologii oraz
w diagnostyce szeregu chorób. W biologii molekularnej lektyny są stosowane do izolacji i identyfikacji glikoprotein i glikopeptydów. Zdolność lektyn do wiązania glikokoniugatów pozwala, przy udziale tych białek,
na identyfikację reszt cukrowcowych na powierzchni
erytrocytów odpowiedzialnych za specyficzność grupową krwinek, a także na rozróżnianie komórek normalnych od nowotworowych. Tę zdolność lektyn wykorzystuje się w diagnostyce chorób nowotworowych sutka,
pęcherza moczowego, jelit, wątroby. Prowadzone są
także badania nad antynowotworowymi właściwościami niektórych lektyn, część z nich, między innymi konkanawalina A, posiada zdolność do hamowania wzrostu komórek nowotworowych in vitro [21]. Wiele lektyn, poza wiązaniem grup cukrowych, oddziałuje z innymi niewielkimi cząsteczkami, jak np. 1,8-anilinonaftalenosiarczan (ANS), adenina czy cytokinina.
Niektóre lektyny wykazują zdolność do preferencyjnych oddziaływań ze zmienionymi komórkami, stąd
pojawiła się sugestia, że mogłyby służyć jako przenośniki czynników chemioterapeutycznych w zorientowanym transporcie. Dla przykładu konkanawalina A
była już testowana przy przenoszeniu do komórek rakowych substancji stosowanych w chemioterapii np.
takich toksyn jak rycyna [22].
Lektyny występują najczęściej jako dimery lub tetramery złożone z identycznych lub prawie identycznych podjednostek, albo z dwóch różnych podjednostek stanowiących łańcuchy lekkie alfa oraz ciężkie
beta. Poszczególne podjednostki lektyn zazwyczaj nie
są połączone wiązaniami kowalencyjnymi, dlatego przy
zmianie pH lub stężenia soli mogą ulegać odwracalnej
dysocjacji. Każda z podjednostek zawiera jedno miejsce wiążące dla cukrowca.
Konkanawalina A to białko pochodzące z fasoli
(Canavalia ensiformis) zbudowane z identycznych pro-
tomerów, w skład których wchodzi 237 aminokwasów,
masa cząsteczkowa takiego protomeru jest rzędu
25 500. W zależności od pH konkanawalina A może
istnieć w postaci dimeru (pH < 6) lub tetrameru (pH >
7); może także tworzyć wyższe agregaty. Budowa cząsteczkowa monomeru i tetrameru konkanawaliny A jest
pokazana na rys. 2. Każdy monomer posiada miejsce
wiążące grupę cukrową, a w nim jon Ca2+ i jon metalu
przejściowego, zwykle jest to Mn2+, niezbędne do związania węglowodanu. Ligandy dla atomu metalu przejściowego to Glu8, Asp10, Asp19 i His24, a atom wapnia
otoczony jest przez Asp10, Tyr12, Asn14 i Asp19. Tylko
wówczas, gdy oba miejsca wiążące metale są zajęte
przez jony, lektyna jest zdolna do wiązania węglowodanów. Łańcuch aminokwasów układa się w dwie
antyrównoległe helisy beta, jedna z nich składa się
z siedmiu, a druga z sześciu wstęg, zakończonych krótkimi odcinkami helis alfa. Dimer tworzy się przez złożenie dwóch sześcio-wstęgowych helis w jedną składająca się z dwunastu wstęg. Dwa dimery komponują
teramer przez ułożenie naprzeciw siebie dwóch dwunasto-wstęgowych helis, w rezulatcie powstaje kompleks
z czterema dobrze odseparowanymi miejscami wiążącymi cukier [24].
Konkanawalina A należy do najczęściej stosowanych w badaniach biologicznych środków roślinnych
powodujących aglutynację czerwonych krwinek. Posiada także wiele właściwości wykorzystywanych w badaniach błon komórkowych, procesów podziału komórkowego i metabolizmu komórki, wiele z nich można dodatkowo zmodyfikować poprzez związanie konkanawaliny A ze specyficznymi monosacharydami, jak np.
D-glukoza czy D-mannoza. Najlepiej poznaną aktywnością tej lektyny jest wywoływanie mitogenezy limfocytów, zjawiska analogicznego do stymulacji komórek
odpornościowych przez specyficzne antygeny [21, 22].
Rys. 2. Modele monomeru i tetrameru cząsteczki
konkanawaliny A wygenerowane na podstawie danych
krystalograficznych [23].
Acta Bio–Optica et Informatica Medica, Vol. 9, 2003
Swamy wraz ze współpr. przeprowadzili termodynamiczne i kinetyczne badania połączeń pomiędzy
lektynami a rozpuszczalnymi w wodzie porfirynami:
sulfonową, karboksylową i metylopirydylową [22,
25–28]. Na podstawie widm absorpcji i fluorescencji
ustalili, że w takich układach ma miejsce wzajemne
oddziaływanie tych związków i oszacowali metodą graficzną stałe asocjacji utworzonych związków. Przedstawiony powyżej przegląd badań przemawia za
możliwością zastosowania lektyn jako nośników w
ukierunkowanym transporcie porfirynowych fotosensybilizatorów do komórek nowotworowych.
4. Część doświadczalna
Celem naszej pracy było zbadanie za pomocą miareczkowania spektrofotometrycznego oddziaływań pomiędzy konkanawaliną A (lektyną wyizolowaną z ziaren
fasoli) a [4-(trimetylamino)fenyl] porfiryną i jej kompleksem z miedzią (rys. 3). Porfiryna H2TTMePP,
zwana potocznie porfiryną anilinową, została zsyntezowana w 1993 roku i dopiero od kilku lat jest obecna
w handlu [29]. Charakteryzuje się ona dobrą rozpuszczalnością w wodzie i dużymi przestrzennymi podstawnikami przy grupach fenylowych. Celem pracy było
również oszacowanie stałych asocjacji tworzących się
połączeń i ustalenie wpływu pH środowiska.
Materiały. Konkanawalina A (SIGMA), 5,10,15,20-tetrakis[4-(trimetylamino)fenyl] porfiryna (Aldrich) i
2-amino-2-(hydroksymetyl)-1,3-propanodiol (TRIS)
(Aldrich) były wykorzystane bez dodatkowego oczyszczania. Kompleks porfiryny z miedzią otrzymano według procedury opisanej wcześniej [30].
Pomiary. Widma absorpcji UV-Vis mierzono za pomocą spektrofotometru SPECORD M42 (Carl Zeiss
Jena). Były one rejestrowane w postaci zbiorów ASCII
przy użyciu programu M500, w zakresie długości fali
od 200 do 900 nm, w temperaturze 21°C. Program
SigmaPlot został wykorzystany do przygotowania rysunków widm i analizy uzyskanych danych. Wyjściowy roztwór porfiryny w ilości 2 cm3 dodawano do kuwety kwarcowej o objętości 4 cm3 (stężenie wynosiło
ok. 10–6 M) i bezpośrednio w kuwecie prowadzono
miareczkowanie roztworem ligandu. Podczas miareczkowania roztwór konkanawaliny A (10–3 M) dodawano
za pomocą mikrostrzykawki do porfiryny i za każdym
razem rejestrowano widmo absorpcji. Wszystkie roztwory wyjściowe były sporządzone w 0,025 M roztwo-
161
Rys. 3. Modele cząsteczki H2TTMePP i CuTTMePP.
rze buforu TRIS w wodzie. Wartość pH takiego roztworu wynosiła 8,75; roztwory o wyższym i niższym
pH uzyskano dodając odpowiednie ilości NaOH lub
HCl.
Metoda. Stałe równowagi asocjacji konkanawaliny A
z H2TTMePP i CuTTMePP wyznaczono na podstawie
miareczkowań spektrofotometrycznych, które prowadzono do momentu, w którym w widmach nie obserwowano dalszych zmian, poza efektem
rozcieńczeniowym. Stałe asocjacji wyliczano na
podstawie metody opisanej początkowo przez Irvinga
i Rossottiego [31], a później zmodyfikowanej przez
Becka [32].
5. Omówienie wyników i wnioski
Rys. 4. Ewolucja widma absorpcji porfiryny CuTTMePP w
czasie miareczkowania roztworem konkanawaliny A, przy
pH=8,70.
Typowe zmiany w widmie absorpcji porfiryny
CuTTMePP w roztworze w buforze TRIS otrzymane
podczas miareczkowania roztworem konkanawaliny
A pokazane są na rysunku 4. Pod wpływem dodawanego ligandu, absorbancja pierwotnego pasma
Soreta znacznie się obniża (∆A = 0.75), a pasmo przesuwa się w stronę fal dłuższych (∆λ = 6 nm).
162
Acta Bio–Optica et Informatica Medica, Vol. 9, 2003
twór TRIS-u, i rejestrowaniu kolejnych widm UV-Vis.
Jeśli w roztworze nie ma wzajemnych oddziaływań
pomiędzy substancją miareczkowaną a titrantem, to
obydwie krzywe idealnie się pokrywają. Jak widać na
rysunku 5 w tym przypadku efekt ten nie ma miejsca,
również dla różnych wartości pH.
Do obliczania stałych trwałości powstających asocjatów przyjęto następującą procedurę. Dla reakcji
asocjacji konkanawaliny (konA) z porfiryną (P):
konA
konA
P +konA
→P(konA)

→P(konA)2+... + 

→P(konA)n
(1)
stałą równowagi można zapisać w postaci:
Kn =
Rys. 5. Zależność zmian absorbancji pasma Soreta od stężenia porfiryn: H2TTMePP i CuTTMePP podczas miareczkowania roztworem TRIS-u i roztworem konkanawaliny A.
A=
ε 0 + ε 1 ⋅ K 1 ⋅ [ konA ] + ε 2 ⋅ K
1 + K 1 ⋅ [ konA ] + K 1 ⋅ K
2
[P (konA)n ]
[P (konA)n −1 ][konA]
Wśród metod wyliczania stałych równowagi kompleksowania najpopularniejsza jest metoda Benesi-Hildebrandta [33, 34]. Nie może być ona jednak tutaj
zastosowana, ponieważ pasmo absorpcyjne tworzącego się kompleksu jest zlokalizowane zbyt blisko
pasma wyjściowej porfiryny. Tak więc, dla potwierdzenia stechiometrii i obliczenia wartości stałych
asocjacji zastosowano równanie Irvinga-Rossottiego
[31, 32] łączące zmiany absorbancji ze stałymi tworzenia się kompleksów:
⋅ [ konA ] 2 + ⋅ ⋅ ⋅ + ε n ⋅ K n ⋅ [ konA ] n
⋅ [ P0 ]
⋅ [ konA ] 2 + ⋅ ⋅ ⋅ + K 1 ⋅ K 2 ⋅ ... ⋅ K n ⋅ [ konA ] n
2
Podobne efekty obserwowano także podczas
miareczkowania H2TTMePP (∆A = 0.8, ∆λ = 17 nm).
Na rysunku 4 można również zauważyć dwa punkty
izosbestyczne około 380 i 430 nm. Na wykresie zmian
absorbancji w paśmie Soreta 418 nm i w paśmie konkanawaliny 280 nm od stężenia konkanawaliny A,
przecięcie się krzywych następuje przy stężeniu konkanawaliny równym 4·10–6 M, co odpowiada stężeniu
porfiryny w analizowanej próbce i co sugeruje, że stechiometria powstającego związku wynosi 1:1.
Aby mieć pewność, że w analizowanym układzie
tworzą się asocjaty przeprowadzono klasyczny eksperyment rozcieńczeniowy, którego wyniki pokazane są
na rysunku 5. Eksperyment ten polega na spektrofotometrycznym miareczkowaniu roztworu porfiryny rozpuszczalnikiem, w tym wypadku jest to wyjściowy roz-
(2)
(3)
gdzie A jest absorbancją; ε0 to współczynnik absorpcji
molowej wyjściowej porfiryny; ε1 i K1, ε2 i K2, ... ,
etc. – współczynniki molowej absorpcji i stopniowe
stałe trwałości dla kompleksów o stechiometrii 1:1,
1:2, ..., etc., [konA] i [P] – analityczne stężenia
molowe ligandu (konkanawaliny A) i porfiryny (przy
założeniu, że [konA] >> [P]).
Aby obliczyć stałe K, dane eksperymentalne były
dopasowywane do równania (3) przy użyciu nieliniowej procedury fitowania opartej na algorytmie Marquardta-Levenberga (program SigmaPlot). Fitowanie
przeprowadzono dla kompleksów o stechiometrii 1:1
i 1:2, ale tylko wyniki dla kompleksów 1:1 dawały
dobrą zgodność między wyliczoną krzywą i punktami
eksperymentalnymi. Zgodność wyników fitowania dla
analizowanych układów przedstawiona jest na rys. 6.
Acta Bio–Optica et Informatica Medica, Vol. 9, 2003
163
występuje wówczas w postaci tak zwanego dikationu
H4P2+. Efekt ten nie występuje w przypadku jej
kompleksu z miedzią, ponieważ atomy azotu są
zaangażowane w wiązanie koordynacyjne. Należy tu
dodać, że kompleks CuTTMePP jest bardzo trwały –
tworzy się nawet w wodnych roztworach EDTA i nie
ulega rozkładowi pod wpływem stężonego H2SO4, co
jest rzadko spotykane w chemii kompleksów metali z
porfirynami [30].
Podsumowując możemy stwierdzić, że porfiryna
H2TTMePP, a także jej kompleks z Cu(II) tworzą
trwałe asocjaty z konkanawaliną A. Asocjaty te tworzą
się w całym zakresie pH i posiadają stechiometrię 1:1.
Połączenia z porfiryną zawierającą miedź są trwalsze.
Takie asocjaty mogą odgrywać istotną rolę podczas
transportu fotosensybilizatora do komórek. Jest natomiast kwestią otwartą, czy porfiryna biorąc udział w
utworzonym związku koordynacyjnym z białkiem,
będzie zdolna do generowania tlenu singletowego.
Rys. 6. Zmiany absorbancji w paśmie Soreta porfiryn:
H2TTMePP i CuTTMePP podczas miareczkowania
roztworem konkanawaliny A przy różnych wartościach pH;
punkty to dane eksperymentalne, a krzywe zostały wygenerowane na podstawie równania (3).
Tabela 2. Wartości stałych asocjacji kompleksów o stechiometrii 1:1 konkanawaliny A z kationowymi
porfirynami
PORFIRYNA
H2TTMePP
CuTTMePP
pH
2,80
8,70
10,0
2,80
8,70
10,0
K [dcm3·mol–1]
1,00·103 (±3%)
4,35·105 (±9%)
1,50·106 (±8%)
1,48·106 (±10%)
6,55·106 (±12%)
6,94·106 (±11%)
Wartości wyznaczonych stałych trwałości dla kompleksów konkanawaliny A i badanych porfiryn zesta
wione są w Tabeli 2. Stałe te cechuje dobra zgodność
z publikowanymi wcześniej stałymi trwałości analogicznych układów złożonych z białek i porfiryn [4, 9].
Obliczone stałe są praktycznie tego samego rzędu,
poza jednym wyjątkiem. Wartość K dla wolnej
porfiryny jest o trzy rzędy wielkości niższa przy pH
2,8. Wynika to z faktu, że przy niskich wartościach pH
pierścień N4 jest całkowicie sprotonowany. Porfiryna
Literatura
1. R. Bonnett: The Porphyrins. (ed. D. Dolphin),
vol. 1, s. 9, Academic Press, New York, 1978.
2. N. Lane: Nowe światło dla medycyny. Świat
Nauki, 138 (2003) 58.
3. M. Aoudia, M.A.J. Rodgers: Photoprocesses in
self-assembled complexes of oligopeptides with
metalloporphyrin. J. Am. Chem. Soc., 119 (1997)
12859.
4. T. T. Tominaga, V. E. Yushmanov, I. E. Borissevitch, H. Imasato, M. Tabak: Agregation phenomena in the complexes of iron tetraphenylporphine
sulfonate with bovine serum albumin. J. Inorg.
Biochem., 65 (1997) 235.
5. S.M. Andrade, S.M.B. Costa: Spectroscopic
studies on the interaction of a water soluble
porphyrin and two drug carrier proteins. Biophys.
J., 82 (2002) 1607.
6. S.M. Andrade, S.M.B. Costa: Aggregation kinetics
of meso-tetrakis(4-sulfonatophenyl) porphyrine in
the presence of proteins: Temperature and ionic
strength effects. J. Fluorescence, 12 (2002) 77.
7. Y. Lu, A. Sousa, R. Franco, A. Mangravita, et al::
Binding of protoporphyrin IX and metal
derivatieves to the active site of wild-type mouse
ferrochelatase at low porphyrin-to-protein ratios.
Biochemistry, 41 (2002) 8253.
164
Acta Bio–Optica et Informatica Medica, Vol. 9, 2003
8. M. Mifune, H. Asahara, T. Hinokiyama, J. Liu, H.
Akizawa, A. Iwado, N. Motohasi, Y. Saito: Photoreaction generating active oxygens of In3+tetrakis(4-methylpyridyl)-porphine in the presence of albumins. Chem. & Pharm. Bull., 50 (2002) 1638.
9. A.K. Borbar, A. Eslami, S. Tangestaninejad:
Spectral investigation of the solution properties of
5,10,15,20-tetrakis(4-N-benzyl-pyridyl)porphyrin
and its interaction with human bovine albumin
(HSA). J. Porph. and Phthalo., 6 (2002) 225.
10. A.K. Borbar, A. Eslami, S. Tangestaninejad:
Solution properties of Cu(II) complex of moderately hydrophobic water-soluble porphyrin and investigation of its interaction with human serum albumin. Polish J. Chem., 77 (2003) 283.
11. S. Chatterjee, T.S. Srivastava: Spectral of the interaction of some porphyrins wit bovine serum albumin. J. Porph. and Phthalo., 4 (2000) 147.
12. Y.S. Ding, B.C. Lin, C.W. Huie: Binding studies of
porphyrin to human albumin using affinity capillary electrophoresis. Electrophoresis, 22 (2001)
2210.
13. L. Brancaleon, H. Moseley: Effects of photoproducts on the binding properties of protoporphyrin
IX to proteins. Biophysical Chemistry, 96 (2002)
77.
14. N. Datta-Gupta, D. Malakar, J. Dozier: Binding
studies of four free base porphyrins and six
iron(+3) porphyrins with human serum albumin.
Research Communications in Chemical Pathology
and Pharmacology, 63 (1989) 289.
15. J. Osterloh, M.G.H. Vincente: Mechanisms of porphyrinoid localization in tumors. J. Porphyr.
Phthalo., 6 (2002) 305.
16. S. Sil, A.S. Chakraborti: Hematoporhyrin interacts
with myoglobin and alters its functions. Mol. Cell.
Biochem., 237 (2002) 103.
17. M. Urbanova, V. Setnicka, V. Kral, K. Volka: Noncovalent interactions of peptides with porphyrins in
aqueous solution: Conformational study using vibrational CD spectroscopy. Biopolymers, 60 (2001)
307.
18. B. J. Blackmon, T. A. Dailey, X. Lianchun, H. A.
Dailey: Characterization of a human and mouse
tetrapyrrole-binding protein. Archives of Biochemistry and Biophysics, 407 (2002) 196.
19. M. Sirish, H. J. Schneider: Porphyrin derivatives
as water-soluble receptors for peptides. Chem.
Commun., (1999), 907.
20. E.H. Lan, B.C. Dave, J.M. Fukuto, B. Dunn, J.I.
Zink, J.S. Valentine: Synthesis of sol-gel encapsulated heme proteins with chemical sensing properties. J. Mater. Chem., 9 (1999) 45.
21. E. Fik, A. Goździcka-Józefiak, Lektyny roślinne.
Na pograniczu chemii i biologii (red. H. Koroniak,
J. Barciszewski) t.III, 383, Wydawnictwo
Naukowe UAM, Poznań, 1999.
22. K. Bahnu, S. S. Komath, B.G. Maiya, M. J.
Swamy: Interaction of porphyrins with concanavalin A and pea lectin. Curr. Sci., 73 (1997) 598.
23. R. Bergmann: http://www.biologie.uni-hamburg.
de/b-online/chimes/1cvn/e1cvnm.htm.
24. G.N. Reeke, J.W. Becker, B.A. Cunningaham,
G.R. Gumther, J.L. Wang, G.M. Endelman: Relationships between the structure and activities of
concanavalin A. Ann. N. Y. Acad. Sci., 234 (1974)
369.
25. S.S. Komath, R. Kenoth, L. Giribabu, B.G. Maiya,
M.J. Swamy: Fluorescence and absorption spectroscopic studies on the interaction of porphyrins
with snake gourd (Trichosanthes anguina) seed
lectin. J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 55
(2000) 49.
26. S.S. Komath, K. Bhanu, B.G. Maiya, M.J. Swamy:
Binding of porphyrins by the tumor-specific lectin,
Jacalin [Jack Fruit (Artocarpus integrifolia)
Agglutin]. Bioscience Rep., 20 (4) (2000) 265.
27. M. Goel, D. Jain, K.J. Kaur, R. Kenoth, B.G. Maiya, M.J. Swamy, D.M. Salunke: Functional equality in the absence of structural similarity. J. Biol.
Chem., 276 (42) (2001) 39277.
28. R. Kenoth, D.R. Reddy, B.G. Maiya, M.J. Swamy:
Thermodynamic and kinetic analysis of porhyrin
binding to Trichosantes cucumeria seed lectin.
Eur. J. Biochem., 268 (2001) 5541.
29. D.K. Lavallee, Z. Xu, R. Pina: Synthesis and properties of new cationic-periphery porphyrins, tetrakis(p-(aminomethyl)phenyl)porphyrin and N-methyltetrakis(p-(aminomethyl)phenyl)porphyrin.
J. Org. Chem., 58 (1993) 6000.
30. M. Makarska: Charakterystyka związków kompleksowych kationowych porfiryn rozpuszczalnych w
wodzie. Praca doktorska, Wydział Chemii UMCS,
Lublin 2001.
Acta Bio–Optica et Informatica Medica, Vol. 9, 2003
31. F.J.C. Rossotti and H. Rossotti: The determination
of stability constants. McGraw-Hill, New York
1961, p. 279.
32. M.T. Beck: Chemistry of Complex Equilibria. Van
Nostrand Reinhold Company, London 1970, s. 93.
165
33. R. Foster: Organic Charge Transfer Complexes.
Academic Press, London 1969.
34. K. Hirose: A practical guide for the determination
of binding constants. J. Inclus. Phenom. Macro.
Chem., 39 (2001) 193.
166
Acta Bio–Optica et Informatica Medica, Vol. 9, 2003