Gene Pulser Xcell

--------------------------------------------------------------------
Gene Pulser Xcell™
System do Elektroporacji
Instrukcja Obsługi
Numery Katalogowe
165-2660, 165-2661, 165-2662, 165-2666,
165-2667, and 165-2668
W celu uzyskania pomocy technicznej
NaleŜy dzwonić do lokalnego biura Bio-Rad
Lub biura w U.S. pod numer 1-800-4 BIORAD
(1-800-424-6723)
kontakt przez stronę internetową discover.bio-rad.com
1
Zasady Bezpieczeństwa
System do elektroporacji Gene Pulser Xcell podlega 12 miesięcznej gwarancji przeciw
wadom w wykonaniu i uŜytych materiałów. Jeśli podczas tego okresu gwarancji pojawią się
jakiekolwiek wady wykryte podczas uŜytkowania aparatury lub inne, wówczas firma Bio Rad
Laboratories naprawi albo zastąpi wadliwe części nowymi, zaleŜnie od własnego uznania
bez opłaty. Następujące wady aparatu nie podlegają gwarancji:
1.
Wady wywołane niewłaściwym uŜytkowaniem.
2.
Naprawa lub modyfikacja aparatu wykonana przez osoby inne niŜ inŜynier serwisowy
Bio-Rad Laboratories.
3.
Uszkodzenie wywołane uŜyciem części alternatywnych.
4.
UŜywanie części zamiennych pasujących do aparatu, ale dostarczanych nie przez BioRad Laboratories.
5.
Uszkodzenie wywołane przypadkowym lub niewłaściwym uŜywaniem aparatu.
6.
Uszkodzenie wywołane przez katastrofę.
7.
Korozja wywołana przez niewłaściwy rozpuszczalnik albo próbkę.
Gwarancja nie dotyczy następujących części:
Bezpieczników
W celu zapytania albo prośby o usługę naprawy, proszę się skontaktować z Bio-Rad
Laboratories. NaleŜy poinformować Bio-Rad o modelu i numerze seryjnym aparatu.
Uwaga
Aparat firmy Bio-Rad jest odpowiednio zaprojektowany i posiada certyfikaty bezpieczeństwa
EN-61010∗ oraz spełnia wymagania EN61326 (dla klasy A) standardów bezpieczeństwa.
UŜytkowanie produktów posiadających ten certyfikat jest bezpieczne pod warunkiem, Ŝe
uŜywane są zgodnie z instrukcją obsługi. Aparat ten nie moŜe być w Ŝaden sposób
modyfikowany przez uŜytkownika. Wprowadzenie zmian spowoduje:
•
UniewaŜnienie gwarancji producenta
•
UniewaŜnienie certyfikatów bezpieczeństwa EN-61010
•
Stworzenie zagroŜenia dla bezpieczeństwa pracujących osób
Bio Rad Laboratories nie jest odpowiedzialny za jakiekolwiek zranienie albo szkodę
spowodowaną przez uŜycie tego aparatu dla celów inny niŜ te, do których został
przeznaczony, lub przez modyfikacje aparatu dokonaną nie przez Bio-Rad Laboratories lub
jej upowaŜnionego przedstawiciela.
Model : Gene Pulser Xcell …………………………………………………………………………
Nr katalogowy: 165-xxxx .......................................................................................................
Data dostarczenia: ...................................................................................................................
Nr Seryjny: ...............................................................................................................................
Nr faktury: ................................................................................................................................
Nr zamówienia: ........................................................................................................................
2
Spis Treści
Rozdział 1 System do Elektroporacji Gene Pulser XcellTM ..................................................... 1
1.1
Podstawowe Informacje Bezpieczeństwa............................................................... 1
1.2
Niebezpieczeństwo elektryczne ............................................................................. 2
1.3
Niebezpieczeństwo mechaniczne .......................................................................... 2
1.4
Inne Środki Bezpieczeństwa .................................................................................. 3
Rozdział 2 Rozpakowanie i Instalacja Systemu..................................................................... 3
2.1
Rozpakowanie Składników Systemu...................................................................... 4
2.2
Montowanie Systemu............................................................................................. 4
2.1.1
Montowanie Jednostki Głównej Gene Pulser Xcell i podłączanie komory
ShockPod (nr kat 165-2660, 165-2661, 165-2662, and 165-2666)................................. 4
2.1.2
Podłączenie Modułu PC do jednostki głównej Gene Pulser Xcell (nr kat 1652660, 165-2662, i 165-2668).......................................................................................... 5
2.1.3
Podłączenie Modułu PC do jednostki głównej Gene Pulser Xcell (nr kat 1652660, 165-2661, i 165-2667).......................................................................................... 6
2.1.4
Komora ShockPod (nr kat. 165-2660, 165-2661, 165-2662, i 165-2669) ........ 7
Rozdział 3 Instrukcja Obsługi Gene Pulser XcellTM ................................................................ 9
3.1
Przegląd rozdziału ................................................................................................. 9
3.2
Pulpit główny oraz ekran wyjściowy .....................................................................10
3.2.1
Opis klawiatury..............................................................................................10
3.2.2
Home Screen (ekran główny) ........................................................................11
3.2.3
Ekrany pomocy .............................................................................................13
3.3
Czynności ręczne..................................................................................................13
3.3.1
Czynności ręczne (szybki przewodnik) ..........................................................13
3.3.2
Elektroporacja pulsami o rozkładzie ekspotencjalnym ...................................14
3.3.3
Elektroporacja z określoną stałą czasową .....................................................15
3.3.4
Elektroporacja przy uŜyciu pulsu fali kwadratowej .........................................17
3.3.5
Ekrany uzyskanych wyników .........................................................................19
3.3.6
Ochrona programu przed Operacjami Ręcznymi. ..........................................20
3.3.6.A. Zapisywanie protokołu w wybranym połoŜeniu bez określonego Protokołu
UŜytkownika. ................................................................................................................22
3.3.6.B Zapisywanie protokołu w wybranym połoŜeniu z nazwanym Protokołem
UŜytkownika .................................................................................................................23
3.4
Wcześniej zaprogramowane protokoły..................................................................23
3.4.1
UŜywanie wcześniej zaprogramowanego protokołu (krótki przewodnik). .......24
3.4.2
Przeprowadzenie elektroporacji uŜywając nastawiania protokołów. ..............24
3.4.3
Modyfikowanie parametrów nastawiania protokołu........................................27
3.4.4
Zapisywanie zmian dla protokołu nastawianego . ..........................................28
3.5
Protokoły uŜytkownika...........................................................................................28
3.5.1
UŜywanie protokołu uŜytkownika ..................................................................28
3.5.2
Tworzenie nowej nazwy uŜytkownika . ..........................................................29
3.5.3
tworzenie nowego protokołu uŜytkownika .....................................................29
3.5.4
Modyfikowanie protokołu uŜytkownika...........................................................32
3.5.5
Usuwanie nazwy oraz protokołu uŜytkownika ...............................................34
3.5.6
Zmienianie nazwy uŜytkownika lub protokołu ................................................35
3.6
Ostatni impuls .......................................................................................................36
3.7
Optymalizowanie operacji .....................................................................................36
3.8
Zarządzanie danymi..............................................................................................38
3.9
Pomiary.................................................................................................................41
3.9.1
Pomiary oporności próbki ..............................................................................41
3.9.2
Kalibrowanie i pomiar kondensatorów w module CE .....................................42
3.10 Preferencje uŜytkownika .......................................................................................43
3.10.1
Nastawianie zegara.......................................................................................43
3.10.2
Ustawianie intensywności ekranu..................................................................44
3.10.3
Ustawianie funkcji snu...................................................................................45
3
3.11 System Pulse Trac™ ............................................................................................45
3.11.1
Opis systemu Trac System............................................................................46
3.11.2
Diagnostyczny algorytm Pulse Track.............................................................46
Rozdział 4 Ogólny zarys teorii elektroporacji ........................................................................47
4.1 Impulsy o rozkładzie wykładniczym ............................................................................48
4.2 Impulsy fali o rozkładzie kwadratowym .......................................................................48
Rozdział 5 Czynniki wpływające na elektroporację: Optymalizacja Elektroporacji................51
5.1 Wzrost komórek..........................................................................................................51
5.2 DNA............................................................................................................................52
5.3 Roztwory do elektroporacji..........................................................................................52
5.4 Temperatura...............................................................................................................53
Rozdział 6 Literatura ............................................................................................................55
Specyfikacja i Informacje o produkcie...................................................................................58
4
5
Rozdział 1 System do Elektroporacji Gene Pulser XcellTM
Gene Pulser Xcell jest urządzeniem, które za pomocą kondensatorów umoŜliwia
generowanie impulsów, aby wyprodukować skontrolowane wykładnicze albo kwadratowe
fala elektryczne - pulsy dla elektroporacji komórki. Jednostka urządzenia jest zdolna do
wyprodukowania pulsów do 3000 V w obwodzie wysokiego napięcia i do 500 V w obwodzie
niskiego napięcia. Dla wygenerowania pulsów w obwodzie wysokiego napięcia, w jednostce
głównej Gene Pulser Xcell kondensatory 10, 15 i 25 µF są uŜyte, a generowanie pulsów w
obwodzie niskiego napięcia wymaga uŜycia kondensatorów w Module CE. Rozkład
wykładniczy (albo rozładowanie pojemności) i kwadratowe pulsy fali są najczęściej uŜytymi
typami impulsu elektrycznego. Głębsza dyskusja na ten temat zostanie przedstawiona w
Rozdziale 4.
Gene Pulser Xcell jest systemem modułowym, składającym się z jednostki głównej i dwóch
dodatkowych modułów, modułu CE i modułu PC. Dodatkowo posiada komorę wstrząsową
oraz kuwety z przyłączonymi elektrodami.
Moduł CE przeznaczony do uŜycia wraz z jednostką główną Gene Pulser Xcell w celu
elektroporacji większości komórek eukariotycznych, włączając komórki ssacze i protoplasty
roślinne. Moduł CE powinien zostać uŜyty tylko do badania komórek w roztworach o niskiej
oporności (< 1000 omów). Dla pulsów o rozkładzie wykładniczym, Moduł CE daje moŜliwość
kontrolowania pojemności obwodu przez powiększanie stałej czasowej pulsu. Dla pulsów fali
kwadratowej, Moduł CE dostarcza kondensator o duŜej pojemności, który jest niezbędny do
wprowadzenia pulsu fali kwadratowej do roztworów o niskiej oporności. Moduł ten zawiera
komplet kondensatorów z funkcjonalnym zakresem pomiędzy 50 i 3275 µF z moŜliwością
wzrostu w 25 µF odstępach. Dla kwadratowych pulsów fali, Moduł CE dostarcza duŜej
pojemności, 3275 µF, niezbędnej dla dostarczania kwadratowego pulsu fali do roztworów o
niskich opornościach.
Moduł PC jest przeznaczony do elektroporacji bakterii i grzybów przy uŜyciu rozkładu
wykładniczego, jak równieŜ do innych aplikacji, gdzie pod wysokim napięciem pulsy są
przykładane do próbek o małej objętości i wysokiej oporności. Moduł PC umoŜliwia wybór
wartości oporności w granicach od 50 omów do 1000 omów w odstępach 50 Ω. Jednostka
jest uŜyta, w celu kontrolowania oporności obwodu przez umieszczanie oporników
równolegle z próbką, tym samym dostarczając sposobności zmniejszania stałej czasowej
wykładniczego rozkładu pulsu. To dostarcza efektywnego sposobu kontrolowania stałych
czasowych kiedy uŜyto roztworów o wysokiej oporności ale ma słaby wpływ na stałe
czasowe gdy zastosowano roztwory o niskiej oporności. Moduł PC znacznie zmniejsza
prawdopodobieństwo arc (sprzęŜenia zwrotnego) w obwodzie o wysokim napięciu. Nie
zaleca się stosowania modułu PC do kwadratowych pulsów fali z powodu wzrostu w
opadaniu pulsu, który moŜe zdarzyć się (zobacz rozdział 4).
Zarówno Moduł PC jak i Moduł CE posiada integralne połączenia z jednostką główną
(zobacz Rozdział 2 w celu instalacji). Obie jednostki są kontrolowane bezpośrednio z
interfejsu uŜytkownika na przednim pulpicie jednostki głównej.
1.1
Podstawowe Informacje Bezpieczeństwa
Aparat ten, wyprodukowany przez firmę Bio-Rad jest tak zaprojektowany i sprawdzony, aby
sprostać wymaganiom bezpieczeństwa EN61010 i wymaganiom EMC EN61326 (dla Klasy
A) i dostosowuje się do "Klasy A ” standardów promieniowania elektromagnetycznego dla
sprzętu przeznaczonego do aplikacji stosowanych w laboratorium naukowym. Aparat ten jest
przeznaczony tylko do stosowania w laboratorium! Promieniowanie elektromagnetyczne
1
wytwarzane przez ten produkt moŜe przeszkadzać w pracy wraŜliwych urządzeń, jeśli są
umieszczone w jego pobliŜu albo podłączone do tego samego obwodu. UŜytkownik powinien
być świadomym tego potencjalnego zagroŜenia i wziąć to pod uwagę aby uniknąć
oddziaływania.
śadna z części systemu Gene Pulser Xcell nie powinna zostać uŜyta, jeśli zdarzyła się
oczywista zewnętrzna przypadkowa szkoda albo elektroniczny wyświetlacz nie funkcjonuje
tak jak opisano w instrukcji. Aparat ten moŜe być uŜyty tylko z komponentami dostarczonymi
(albo ich upowaŜnionymi dodatkowymi albo wymiennymi) włączając, ale nie ograniczając do,
dostarczonych przewodów i ShockPod (komory wstrząsowej). Zakres temperatury
obsługiwania systemu Gene Pulser Xcell i jego komponentów wynosi 0 lat – 35 ° C.
W aparacie nie ma Ŝadnych części, które mogą być naprawiane samodzielnie przez
uŜytkownika. UŜytkownik nie powinien poczynić zrobić Ŝadnej próby, w celu otwarcia
którejkolwiek pokrywy lub dokonać zerwania zabezpieczeń. Aparat ten nie moŜe być
zmieniony albo zmodyfikowany w jakikolwiek sposób.
Zmiany wprowadzone przez uŜytkownika do aparatu spowodują:
• uniewaŜnienie gwarancji producenta
• uniewaŜnienie certyfikatów bezpieczeństwa IEC 1010
• spowodowanie potencjalnego niebezpieczeństwa
Bio-Rad nie jest odpowiedzialny za jakiekolwiek zranienie albo szkody spowodowane przez
uŜycie tego aparatu dla celów innych niŜ te, dla których został przeznaczony albo przez
modyfikację aparatu dokonaną przez osobę inną niŜ Bio-Rad lub jego upowaŜniony
przedstawiciel.
1.2 Niebezpieczeństwo elektryczne
Gene Pulser Xcell wytwarza napięcia, aŜ 3,000 woltów i jest zdolny do podawania bardzo
wysokich prądów. Kiedy jest naładowany do maksymalnego napięcia, aparat magazynuje
około 400 dŜuli. Pewien stopień ostroŜności jest wymagany dla poziomów energii tego
rozkładu. Zasady bezpieczeństwa systemu zabraniają dostępu uŜytkownika do wgłębień w
których znajdują się gniazda wtykowe oraz zakończenia elektrod wewnątrz komory próbki.
Te łącza mechaniczne nigdy nie powinny zostać oszukany przez uŜytkownika.
Przycisk pulsu jest aktywny, gdy obszar zajmowany przez znak w dolnym prawym rogu
iskrzy się. Jeśli przycisk pulsu został przyciśnięty i gdy „Pulsing” jest wyświetlone na ekranie
LCD w przedniej części aparatu, wysokie napięcie jest obecne w polu elektrycznym. Z
powodu wbudowanych połączeń bezpieczeństwa w komorze ShockPod, w momencie kiedy
wieko ShockPod jest otwarte, Ŝaden puls nie jest dostarczony do kuwety. Jeśli kondensator
został częściowo naładowany ale nie rozładowany ( na przykład, kiedy cykl ładowania został
przerwany zanim puls został dostarczony), jakiś ładunek moŜe pozostać na wewnętrznej
części kondensatora. Ładunek ten zostanie odprowadzony w ciągu 1 – 2 minut.
UŜytkownik, ze względów bezpieczeństwa nie moŜe pozostać w jakimkolwiek kontakcie z
naładowanymi elektrycznie elementami systemu.
1.3 Niebezpieczeństwo mechaniczne
Gene Pulser Xcell zawiera opatentowany obwód zabezpieczający arc - obwód ten
dramatycznie zmniejsza częstotliwość z arcing (zakrzywiania) w kuwecie kiedy wysokie
napięcie jest dostarczony do próbki. Jednostka wbudowuje obwód w taki sposób, Ŝe
odbierając początek arc (zakrzywienia/łuku) i zmienia kierunek prądu z próbki w < 10 µsek,
zapobiegając, albo znacznie zmniejszając, mechaniczne, optyczne i słyszalne zjawiska
2
zachodzące w komorze ShockPod. Podczas pojawienia się arc, w komorze próbki mają
miejsce małe wyładowania, niemniej jednak silnie zaleca się noszenie szkieł bezpieczeństwa
w momencie korzystania z aparatu.
1.4 Inne Środki Bezpieczeństwa
NaleŜy unikać rozlewania jakichkolwiek płynów na aparacie. Aby wyczyścić zewnętrzne
powierzchnie Gene Pulser Xcell naleŜy uŜywać tylko papierowych ręczników lub szmatki
zwilŜonej wodą lub alkoholem.
NaleŜy uŜywać przewodów elektrycznych tylko tych, które zostały dostarczone przez BioRad wraz z Gene Pulser Xcell.
UŜywaj komory ShockPod tylko gdy jest kompletnie złoŜona. Nie usiłuj oszukać
zabezpieczeń elektrycznych komory ShockPod albo uŜyć jej gdy jest rozmontowana.
Weryfikuj segmenty obrazu okresowo.
Przeczytaj instrukcję obsługi przed uŜywaniem Systemu do Elektroporacji Gene Pulser Xcell.
W celu uzyskani pomocy technicznej skontaktuj się z lokalnym biurem Bio-Rad lub z tym w
USA, zadzwoń 1-800-4BIORAD (1-800-424-6723).
OstrzeŜenie: Gene Pulser Xcell wygenerowuje, uŜywa i wypromieniowuje energię o
częstotliwościach radiowych. Jeśli aparat nie jest uŜywany zgodnie z zaleceniami podanymi
w tej instrukcji, moŜe to spowodować zakłócenia radiokomunikacyjne.
Gene Pulser Xcell został przetestowany zgodnie z ograniczeniami dla Klasy A i spełnia te
same normy co urządzenia komputerowe (na podstawie Subpart J Część 15 zasada FCC),
które zapewniają realną ochronę przeciw zakłóceniom gdy działają w środowisku
komercyjnym. Korzystanie z tego urządzenia na terenie zamieszkałym moŜe spowodować
zakłócenia. W tym przypadku uŜytkownik na własną odpowiedzialność i koszt będzie
zmuszony, dokonać pomiarów, aby usunąć zakłócenia.
Rozdział 2 Rozpakowanie i Instalacja Systemu
Gene Pulser XCell™ moŜe być zakupiony jako trzy odrębne systemy lub jako komponenty:
165-2660
Gene Pulser Xcell Total System do badania komórek
Eukariotycznych i bakteryjnych, 100–240 V, 50/60 Hz, dostarcza
impulsy elektryczne o charakterze ekspotencjalnym i kwadratowym,
zawiera jednostkę główną, Moduł CE, Moduł PC, komorę ShockPod,
15 sterylnych kuwet (po 5 o średnicach 0.1, 0.2, i 0.4 cm), instrukcję
obsługi
165-2661
Gene Pulser Xcell Eukaryotic System, 100/240 V, 50/60 Hz,
dostarcza impulsy elektryczne o charakterze ekspotencjalnym (w
zakresie 25–3,275 µF) oraz kwadrtowym, zawiera jednostkę główną,
Moduł CE, komorę ShockPod, 5 sterylnych kuwet (o średnicy 0.4 cm),
instrukcję obsługi
165-2662
Gene Pulser Xcell Microbial System, 100/240 V, 50/60 Hz, dostarcza
impulsy elektryczne o charakterze ekspotencjalnym i kwadratowym,
zawiera jednostkę główną, Moduł PC,
komorę ShockPod, 10
sterylnych kuwet (po 5 o średnicy 0.1 i 0.2 cm), instrukcję obsługi
3
165-2666
Gene Pulser Xcell jednostka główna, 100/240 V, 50/60 Hz
165-2667
Gene Pulser Xcell Moduł CE, zakres 25–3,275 µF kontrolowany przez
jednostkę główną, zawiera przewody przyłączeniowe do jednostki
głównej, 5 sterylnych kuwet (o średnicy 0.4 cm), instrukcję obsługi
165-2668
Gene Pulser Xcell Moduł PC, zakres 50–1,000 Ω kontrolowany przez
jednostkę główną, zawiera przewody przyłączeniowe do jednostki
głównej, 10 sterylnych kuwet (po 5 o średnicy 0.1 i 0.2 cm), instrukcję
obsługi
165-2669
Gene Pulser Xcell ShockPod shocking chamber, zawiera przewody
przyłączeniowe do jednostki Gene Pulser Xcell, Gene Pulser II, lub
MicroPulser, instrukcję obsługi
2.1
Rozpakowanie Składników Systemu
NaleŜy usunąć wszystkie materiały uszczelniające i połączyć komponenty umieszczając je
na płaskiej, suchej powierzchni w pobliŜu odpowiedniego gniazda elektrycznego.
Po otrzymywaniu zamówionego aparatu, proszę sprawdzić, czy dostarczone zostały
wszystkie elementy wymienione przy opisie produktu (przy odpowiednim numerze
katalogowym). Jeśli brakuje któregoś z elementów albo jest on uszkodzony, naleŜy
skontaktować z lokalnym biurem Bio-Rad.
2.2
2.1.1
Montowanie Systemu
Montowanie Jednostki Głównej Gene Pulser Xcell i podłączanie komory
ShockPod (nr kat 165-2660, 165-2661, 165-2662, and 165-2666)
NaleŜy przeprowadzić tę procedurą w celu skonfigurowania Gene Pulser Xcell i podłączenia
komory ShockPod. Podczas działania naleŜy być pewnym, Ŝe jednostka główna Gene Pulser
Xcell jest wyłączona.
1.
Przymocuj przewód zasilający do odpowiedniego potrójnego gniazda na odwrocie
jednostki głównej Gene Pulser Xcell (Rysunek 2.1 A). Wprowadź przewód jednostki
do odpowiedniego gniazdka elektrycznego albo rozgałęziacza. Na spodniej części
jednostki głównej Gene Pulser Xcell znajduje się nóŜka, która moŜe zostać ustawiona
tak, aby zmienić kąt patrzenia na ekran LCD pokazu (Rysunek 2.1 B).
2.
Wprowadź czarną wtyczkę komory ShockPod do lewego i środkowego wyjścia
znajdującego się na przedniej części pulpitu Gene Pulser Xcell (Rysunek 2.2);
polarność nie jest waŜna dla procesu elektroporacji. Prawe gniazdo wtykowe nie jest
uŜyte do podłączenia komory ShockPod.
3.
Aby włączyć Gene Pulser Xcell, naciśnij wyłącznik zasilania po prawej stronie aparatu
(Rysunek 2.2).
4
Rysunek 2.1 A Tylny panel jednostki głównej Gene Pulser Xcell z gniazdami zasilania,
Modułu CE i Modułu PC.
Rysunek 2.1 B Dolny panel jednostki głównej Gene Pulser Xcell posiada nóŜkę, która moŜe
zostać ustawiona tak, aby zmienić kąt patrzenia na ekran LCD pokazu.
Rysunek 2.2 Podłączenie komory ShockPod do jednostki głównej Gene Pulser Xcell.
2.1.2
Podłączenie Modułu PC do jednostki głównej Gene Pulser Xcell (nr kat
165-2660, 165-2662, i 165-2668)
Moduły PC i CE mogą zostać podłączone do jednostki głównej Gene Pulser Xcell w dowolnej
kolejności i mogą zostać podłączone jednocześnie. Przed łączeniem Modułu PC do Gene
Pulser Xcell, naleŜy mieć pewność, Ŝe Gene Pulser Xcell jest wyłączony. Na Module PC nie
5
ma Ŝadnego wyłącznika zasilania; jest on całkowicie kontrolowany jednostkę główną przez
Gene Pulser Xcell.
1. Moduł PC naleŜy umieścić w pobliŜu jednostki głównej Gene Pulser Xcell i upewnić się,
Ŝe są stabilne; Moduł PC i jednostka główna Gene Pulser Xcell mogą zostać
umieszczona jedna na drugiej. NóŜki modułu znajdującego się na górze powinny
znajdować się na krawędziach modułu znajdującego się na dole, tak aby ściśle tworzyły
jedną stabilną całość.
2. Umieść czerwono / czarną wtyczkę, która jest trwale przymocowana do przewodu
wychodzącego z tylnej części Modułu PC do właściwego gniazda na odwrocie jednostki
głównej Gene Pulser Xcell odpowiednio oznaczonego (zobacz Rysunek 2.3). Wtyczka
jest tak skonstruowana, Ŝe pasuje tylko do właściwego gniazda i tylko we właściwej
pozycji czerwono / czarnej.
Rysunek 2.3 Widok z tyłu podłączenie Modułu PC do jednostki głównej Gene Pulser Xcell.
2.1.3
Podłączenie Modułu PC do jednostki głównej Gene Pulser Xcell (nr kat
165-2660, 165-2661, i 165-2667)
Moduły PC i CE mogą zostać podłączone do jednostki głównej Gene Pulser Xcell w dowolnej
kolejności i mogą zostać podłączone jednocześnie. Przed łączeniem Modułu CE do Gene
Pulser Xcell, naleŜy mieć pewność, Ŝe Gene Pulser Xcell jest wyłączony. Na Module CE nie
ma Ŝadnego wyłącznika zasilania; jest on całkowicie kontrolowany jednostkę główną przez
Gene Pulser Xcell.
1.
Moduł CE naleŜy umieścić w pobliŜu jednostki głównej Gene Pulser Xcell i upewnić
się, Ŝe są stabilne; Moduł CE i jednostka główna Gene Pulser Xcell mogą zostać
umieszczone jedna na drugiej. NóŜki modułu znajdującego się na górze powinny
znajdować się na krawędziach modułu znajdującego się na dole, tak aby ściśle
tworzyły jedną stabilną całość.
2.
Umieść czerwono / czarną wtyczkę, która jest trwale przymocowana do przewodu
wychodzącego z tylnej części Modułu CE do właściwego gniazda na odwrocie
jednostki głównej Gene Pulser Xcell odpowiednio oznaczonego (zobacz Rysunek
2.4). Wtyczka jest tak skonstruowana, Ŝe pasuje tylko do właściwego gniazda i tylko
we właściwej pozycji czerwono / czarnej.
6
Rysunek 2.4 Widok z tyłu podłączenie Modułu PC do jednostki głównej Gene Pulser Xcell.
2.1.4
Komora ShockPod (nr kat. 165-2660, 165-2661, 165-2662, i 165-2669)
Komora ShockPod jest przeznaczona do obsługi jedną ręką. Naciśnij przycisk na przedniej
części komory aby uwolnić zatrzask i zwolnić przycisk. Delikatnie naciśnij wieczko aby
zamknąć komorę. Bezpieczne zaprojektowanie systemu nakazuje, zamknięcie wieczka
zanim nastąpi zwolnienie pulsowania (podania impulsu). Dodatkowo, aby zmierzyć oporność
roztworów elektroporacyjnych wieczko komory ShockPod równieŜ musi być zamknięte,
(zobacz Rozdział 3.9.1). Z powodu wbudowanych zabezpieczeń w komorze ShockPod, gdy
wieko jest otwarte Ŝaden impuls nie będzie dostarczony do kuwety.
Szczelina na kuwety ma takie rozmiary, Ŝe pasują do niej wszystkie komercyjnie dostępne
kuwety do elektroporacji. Kuwety produkowane przez Bio-Rad poprzez nacięcie z jednej
strony są tak zaprojektowane Ŝe mogą zostać wstawione do szczeliny tylko we właściwej
orientacji.
Rysunek 2.5 Komora ShockPod z kuwetą.
Plastikowy panel przykrywający elektrodę moŜe zostać usunięty na czas przeprowadzenia
procesu oczyszczania. Aby wyczyścić jednostkę naleŜy:
1. Odłączyć komorę ShockPod od jednostki głównej Gene Pulser Xcell.
2. Nacisnąć przycisk w celu otwarcia komory.
7
3. UŜywając śrubokręta phillips, poluzować śrubę utrzymującą panel bezpieczeństwa
(Rysunek 2.5). Podnieść śrubę i panel bezpieczeństwa z komory ShockPod przez kołnierz
na przedniej części panelu.
4. Obszar dookoła elektrod moŜe zostać wyczyszczony za pomocą bawełnianej szmatki i
ciepłej, mydlanej wody. NaleŜy wysuszyć elektrody uŜywając suchej bawełnianej szmatki.
5. Ponownie zmontować jednostkę przez wycentrowanie panelu bezpieczeństwa na
podstawie komory ShockPod i dociśnięcie śrubą.
Rysunek 2.6 Widok na rozmontowaną komorę ShockPod elektroporatora Gene Pulser Xcell.
8
Rozdział 3 Instrukcja Obsługi Gene Pulser XcellTM
3.1
Przegląd rozdziału
W rozdziale tym jest opisany sposób funkcjonowania Gene Pulser Xcell.
Skrót organizacji rozdziału.
Rozdział 3.2 przedstawiony poniŜej, opisuje funkcje poszczególnych kluczy znajdujących się
na głównym pulpicie ekranu LCD oraz funkcje pomocy wbudowane do Gene Pulser Xcell.
• Klucze na pulpicie jednostki głównej kontrolującej Gene Pulser Xcell. Rozdział 3.2.1 opisuje
sposób, w jaki klucze te powinny być uŜywane.
• Ekran główny zapewnia łatwy dostęp do programów wbudowanych do Gene Pulser Xcell
jak równieŜ bezpośredni dostęp do ręcznego wprowadzenia parametrów pulsu, który będzie
przyłoŜony do próbki poddanej elektroporacji. Programy te opisuje Rozdział 3.2.2 .
• Pomoc dostępna z ekranu jest wbudowana do oprogramowania Gene Pulser Xcell. Dostęp
do tej funkcji moŜe być uzyskana z dowolnego ekranu, jak to opisano w Rozdziale 3.2.3.
Gene Pulser Xcell posiada trzy tryby operacji: operacja ręczna, protokoły zaprogramowane
(pre-set) i protokoły uŜytkownika.
Rozdział 3.3 opisuje tryb ręczny (manual), który moŜe zostać uŜyty, aby szybko
zaprogramować parametry niezbędne dla dostarczania wykładniczego albo kwadratowego
rozkładu pulsu fali.
• Rozdział 3.3.2 opisuje dostarczanie pulsu o rozkładzie wykładniczym.
• Rozdział 3.3.3 opisuje dostarczanie pulsu o rozkładzie wykładniczym z określeniem stałej
czasowej, a potem ewentualnie określając pojemność i wartość oporu.
• Rozdział 3.3.4 opisuje dostarczanie pulsu o rozkładzie kwadratowym fali.
• Rozdział 3.3.6 wyjaśnia jak zaprogramowane ustawienia mogą zostać zapisane jako
protokoły uŜytkownika.
Rozdział 3.4 opisuje tryb protokołów wcześniej zaprogramowanych (Pre-set), w których
parametry pulsu zostały zoptymalizowane dla kilku popularnych i najczęściej stosowanych
linii komórek bakteryjnych i kilku gatunków grzybów oraz linii komórek ssaczych.
• Protokoły wcześniej zaprogramowane mogą zostać wywołane i uŜyte bezpośrednio
(Rozdział 3.4.2) albo mogą zostać zmodyfikowane przed uŜyciem (Rozdział 3.4.3).
• Zmodyfikowany Protokół moŜe zostać zapisany jako Protokół uŜytkownika (Protocol User)
(Rozdział 3.4.4).
Rozdział 3.5 opisuje tryb zwykły – protokoły uŜytkownika (Protocols User), katalogi w których
uŜytkownicy mogą zapisywać własne protokoły zawierające zoptymalizowane parametry.
• Protokoły uŜytkownika mogą zostać utworzone na jeden z czterech sposobów:
• Z menu protokoły uŜytkownika (Protocols User) jako nowy protokół (Rozdział 3.5.3).
• Z menu protokoły uŜytkownika (Protocols User) jako edytowany (modyfikowany)
program (Rozdział 3.5.4)
• Z Manual menu jako nowy protokół (Rozdział 3.3.4).
• Z Menu protokołów wcześniej zaprogramowanych (Menu Protocol) jako zmodyfikowany
protokół (Rozdział 3.4.4).
• Protokoły uŜytkownika (Protocols User), raz utworzone i zapisane, mogą zostać wywołane i
uŜyte bezpośrednio jako protokoły wcześniej zaprogramowane (Pre-set) (Rozdział 3.5.1).
9
3.2
Pulpit główny oraz ekran wyjściowy
3.2.1 Opis klawiatury
Zobacz Rysunek 3.1 pokazujący pulpit główny Gene Pulser Xcell.
Klucze alfa-numeryczne
wybór tego klucza pozwala wprowadzanie cyfr oraz liter do
Gene Pulser Xcell. Naciskając klawisz shift dokonuje się zmiany
pomiędzy alfabetyczną i numeryczną klawiaturą. Aby
alfabetyczny charakter klawiatury został uruchomiany, naciśnij
klawisz zmiany trybu, a następnie wybierz odpowiednią literę.
Aby napisać literę a, naciśnij klucz 2 raz; aby wprowadzić literę
b, naciśnij klucz 2 dwa razy; aby napisać c, naciśnij klucz 2 trzy
razy. Aby uŜyć tego samego klucza dwa razy, na przykład
napisać a, a potem b, przewiń pozycję kursora za pomocą
klawisza prawej strzałki. Oprogramowanie Gene Pulser Xcell
będzie automatycznie przeprowadzać zapis pomiędzy
alfanumerycznym i numerycznym w zaleŜności od istoty
wprowadzanego parametru. Na ekranach protokołów i
głównych ekranach, jest miejsce na wprowadzenie dwucyfrowej
liczby. Jeśli druga cyfra nie zostanie wprowadzona w ciągu 2
sekund po wprowadzeniu pierwszej, na ekranie zostanie
wyświetlona liczba jednocyfrowa.
Home key
wybór tego klucza pozwala na powrót do ekranu głównego
niezaleŜnie od aktualnie zajmowanej pozycji w programie
Back key
wybór tego klucza pozwala na powrót o jeden poziom wyŜej w
kierunku ekranu głównego
Help key
wyświetla na ekranie tekstu pomocy
Save key
zapisuje nazwy uŜytkownika oraz protokołu uŜytkownika
Delete key
usuwa ostatnio wprowadzone zmiany w linii oraz usuwa nazwę
uŜytkownika i protokół uŜytkownika
Clear key
usuwa całą linię w polu
Enter key
zatwierdza wybór i przemieszcza kursor do następnej pozycji
Arrow keys
Klawisze strzałek do góry i na dół przesuwają kursor w dół lub
do góry o jeden rząd. W zaleŜności od ekranu i pozycji kursora,
Klawisze strzałek w prawo i w lewo (1) moŜe przemieścić kursor
w prawo lub w lewo o jedną pozycję, (2) przełącza ekran do
przodu lub do tyłu jeśli dla ten samego menu jest kilka ekranów,
albo (3) powoduje podwyŜszenie lub obniŜenie wartości
numerycznej.
Pulse button
Uwalnia impuls. W tym czasie na ekranie LCD wyświetlany jest
"Pulsing”. Dostarczeniu pulsu towarzyszy dźwięk. Kiedy
zaprogramowane są wielokrotne pulsy, dźwięk pojawia się, gdy
dostarczony zostanie ostatni puls. Puls jest rozładowany
pomiędzy elektrodami, jeśli wieko komory ShockPod jest
10
zamknięte. W przeciwnym razie impuls jest bezpiecznie
rozładowany w aparacie.
Rysunek 3.1. Panel główny Gene Pulse Xcell. Zobacz rozdział 3.2.1 w celu uzyskania
objaśnień dla kluczy funkcyjnych.
3.2.2 Home Screen (ekran główny)
Po włączeniu jednostki głównej Gene Pulser Xcell, przeprowadzona zostanie seria próbnych
algorytmów, włącznie z systemem Pulse Trac (zobacz Rozdział 3.11) i oprogramowanie
sprzętu. Podczas tego czasu na ekranie LCD zostanie wyświetlone logo Bio-Rad, nazwa
produktu i wersja oprogramowania sprzętowego. Po tym rozgrzaniu aparatu, wyświetlany
jest ekran główny (Home Screen) (Rysunek 3.2). Z tego ekranu łatwo jest uzyskać dostęp do
programów opisanych poniŜej. Poprzez naciśnięcie przycisku Home z dowolnej pozycji w
programie moŜna wrócić do ekranu głównego.
Pulpit główny Home składa się z dwóch ekranów. Pierwszy zawiera najczęściej uŜywane
programy. Drugi zawiera bardziej zaawansowane funkcje. Klawisze strzałek Prawa i Lewa
mogą zostać uŜyte do przewijania pomiędzy nimi.
Aby wybrać program, kiedy ekran główny jest pokazany na ekranie LCD, na klawiaturze
cyfrowej naleŜy wybrać numery od 1 do 10, a następnie przycisnąć Enter. Alternatywnie,
moŜna uŜyć klawiszy strzałek „góra” i „dół” i przewijać do poŜądanej pozycji protokołu;
naleŜy przycisnąć Enter, aby wybrać program.
1. Protokoły ekspotencjalne
dostarcza puls o rozkładzie wykładniczym; umoŜliwia
uŜytkownikowi ustawienie parametrów i dostarczenie
pulsu
2. Protokół stałej czasowej
dostarcza puls o rozkładzie wykładniczym z określeniem
stałej czasowej; umoŜliwia uŜytkownikowi ustawienie
parametrów i dostarczenie pulsu
3. Protokoły fali kwadratowej
dostarcza puls o rozkładzie kwadratowym; umoŜliwia
uŜytkownikowi ustawienie parametrów i dostarczenie
pulsu
4. Protokoły zaprogramowane
zoptymalizowane parametry pulsu dla kilku popularnych
i najczęściej stosowanych linii komórek bakteryjnych i
kilku gatunków grzybów oraz linii komórek ssaczych.
11
5. Protokoły uŜytkownika
program pozwala na przechowywanie 144 protokołów
wraz z ustawieniami aparatu i warunkami dostarczenia
pulsu
6. Ostatni puls
pozwala na przywołanie i ponowne uruchomienie
ostatnio podanego impulsu
7. Optymalizacja
pozwala programowanie warunków elektroporacji z
przerwami w przyłoŜeniu napięcia, które moŜe być
zmieniane po kaŜdym pulsie w celu optymalizacji
8. Zarządzanie danymi
umoŜliwia dostęp do parametrów i wyników 100
ostatnich pulsów uporządkowanych daty i czasu
9. Pomiary
umoŜliwia dokonanie pomiaru pojemności w Gene
Pulser Xcell lub oporności próbki w jednostce CE
10. Preferencje uŜytkownika
pozawala ustawić funkcje zegara, intensywność
świecenia ekranu oraz funkcje „uśpienia” ekranu LCD
Strzałki „prawa” i „lewa” (> i <) ukaŜą się odpowiednio na dole pierwszego ekranu i na
szczycie drugiego ekranu. Strzałki te wskazują, Ŝe klawisze strzałek „prawej” i „lewej” mogą
zostać uŜyte aby przełączyć ekran na następny.
12
Ekran główny
Rysunek 3.2 Ekran główny Gene Pulser Xcell. Z tego ekranu moŜliwe jest łatwe wejście do
poszczególnych funkcji menu. Powrót do ekranu głównego jest moŜliwe z dowolnej pozycji w
programie poprzez naciśnięcie przycisku Home. Klawisze strzałek Prawa i Lewa umoŜliwiają
przewijanie pomiędzy ekranami.
3.2.3 Ekrany pomocy
Ekrany pomocy są dostępne przy wyświetlonym dowolnym ekranie przez naciskanie klucza
Help. KaŜde menu pomocy opisuje klawisze które mogą być wybrane z danej pozycji aby
wybrać następną funkcję albo kontynuować aktualną operację. Jeśli jest więcej niŜ jeden
ekran pomocy, klawisze strzałek Prawa i Lewa umoŜliwiają przewijanie pomiędzy ekranami.
Aby wrócić do ekranu programu, naciśnij klucz Back.
3.3
Czynności ręczne
3.3.1 Czynności ręczne (szybki przewodnik)
• Z ekrany głównego:
• Naciśnij Enter, aby wybrać rozkład wykładniczy;
• Naciśnij 2, następnie Enter, aby wybrać rozkład wykładniczy z określeniem stałej
czasowej;
• Naciśnij 3, następnie Enter, aby wybrać rozkład kwadratowy fali.
• UŜyj klawiszy strzałek „góra” i „dół”, aby przewinąć wartości parametru na ekranie. Kiedy
wartość parametru jest podświetlona, uŜywają klawiatury pomocniczej, wejdź do wartości i
wtedy naciskając Enter zatwierdź tę wartość.
• Kiedy niezbędne wartości parametrów zostaną wprowadzone, przycisk „Pulse” na ekranie
Gene Pulser Xcell będzie aktywny.
• Naciśnij przycisk „Pulse” w celu uruchomienia elektroporacji próbki.
• Naciśnij przycisk Back, aby wrócić do ekranu protokołu i podać inny impuls.
13
3.3.2 Elektroporacja pulsami o rozkładzie ekspotencjalnym
Zobacz rozdział 4.1 w celu dyskusji elektroporacji pulsami o rozkładzie ekspotencjalnym.
Kiedy ekran główny (Home) (Rysunek 3.2) jest wybrany, jako domyślny wybór jest
podświetlony numer 1, odpowiadający "Protokołowi Wykładniczemu”. Naciśnij Enter, aby
obejrzeć szczegóły protokołów. Jeśli numer 1 na ekranie nie jest podświetlony, naciskając 1
albo uŜywając klawiszy strzałek „góra” „dół” podświetl „Protokół Wykładniczy”, a następnie
naciśnij Enter, aby wybrać protokół. Wyświetlony zostanie ekran ze szczegółami protokołu
(Rysunek 3.3).
• wprowadzone mogą być następujące kombinacje parametrów:
Pojemność + Napięcie
Pojemność + Napięcie + Oporność
Trzy zmienne parametry mogą zostać wybrane w dowolnej kolejności, jednak określenie
wartości napięcia decyduje, czy ma zostać uŜyty obwód wysokiego czy niskiego napięcia,
oraz ogranicza zakres pojemności jak wskazuje Tabela 3.1. Jeśli wartość pojemności jest tak
wybrana i określona, Ŝe znajduje się poza zakresem skali systemu, domyślnie uŜyta zostanie
najbliŜsza dopuszczalna przez aparat wartość.
Określenie wartości oporności wymaga podłączenia modułu PC. UŜycie tego modułu jest
polecane z zastosowaniem roztworów o wysokiej oporności (tj > 600 Ω) takie jak woda,
cukier, glicerol (alkohol glicerynowy), sorbitol, albo polietylen glikolu. Moduł PC aby
zmniejszyć opór obwodu zawiera oporniki umieszczone równolegle w stosunku do próbki. W
ten sposób, stała czasowa próbki o wysokiej oporności moŜe zostać zmniejszona i
skontrolowana.
Kiedy wartość oporności wskazuje nieskończoność, oznacza to, Ŝe w Module PC nie zostały
uŜyte Ŝadne oporniki. Funkcje pomiarowe Gene Pulser Xcell umoŜliwiają określenie
oporności próbki (zobacz Rozdział 3.9).
Szczegółowy ekran protokołu o rozkładzie ekspotencjalnym
Rysunek 3.3 Szczegółowy ekran protokołu o rozkładzie ekspotencjalnym. Ekran ten
pokazuje parametry, które mogą zostać wyszczególnione dla rozkładu wykładniczego
elektroporacji. Wprowadzenie średnicy uŜytej kuwety jest opcjonalne i jest tylko dla informacji
uŜytkownika.
Tabela 3.1 Zakresy pojemność i napięcia dla obwodów wysokiego napięcia / niskiej
pojemności i niskiego napięcia / wysokiej pojemności dla Gene Pulser Xcell z dostarczanym
wykładniczym rozkładem pulsu.
14
Pojemność (µ
µF)
HV obwód
10 –
wysokiego napięcia
LV obwód niskiego 25 –
napięcia
50
Rpróbki
200 –
Napięcie (V)
< 600
Rsample
2500
200 –
> 600
3000
3275
10 –
500
500
10 –
* uŜycie obwodu niskiego napięcia nakazuje, aby podłączony był Moduł CE.
• UŜyj strzałek „góra” i „dół” aby przewinąć kolejne linie, a następnie podświetl przestrzenie,
w które zostaną wpisane wartości pojemności, napięcia albo oporu. UŜyj klawiatury
alfanumerycznej do wprowadzenia wymaganej wartości, albo uŜyj strzałek „prawo” i „lewo”
aby powiększyć albo zmniejszyć wartość parametru. UŜyj przycisku Delete albo Clear, aby
zmienić wartość. Kiedy wartość wymagana zostanie wprowadzona, przyciśnij przycisk
Enter. Jeśli wartość jest tak wybrana i określona, Ŝe znajduje się poza zakresem skali
elektroporatora, domyślnie uŜyta zostanie najbliŜsza dopuszczalna przez aparat wartość.
Wprowadzenie średnicy uŜytej kuwety jest opcjonalne i słuŜy tylko dla informacji
uŜytkownika.
• Kiedy niezbędne wartości parametrów zostaną wpisane, oznaczenie "P” zostanie
wyświetlone w dolnym prawym rogu ekranu LCD wskazując, Ŝe przycisk impulsu na Gene
Pulsator Xcell jest aktywny i impuls moŜe zostać dostarczony.
• Naciśnij przycisk „puls” aby dostarczyć impuls do próbki. Kiedy przycisk Pulse jest
włączony, na ekranie LCD będzie wyświetlana komenda "Pulsing”. Po zakończeniu,
zostanie wydany sygnał dźwiękowy i wynik pomiaru zostanie pokazany na ekranie jako
protokół wynikowy (zobacz Rysunek 3.6, Rozdział 3.3.5).
• UŜyj strzałek Lewa i Prawa aby przełączyć pomiędzy ekranem zawierającym wyniki
(Results Protocol) i ostatnim ekranem zawierającym szczegóły protokołu (Ekran Detail).
• Przy wybranym ekranie Detail Protocol na LCD moŜe zostać wybrany i dostarczony puls o
innych lub tych samych parametrach. Aby zmienić warunki pulsu, przyciśnij przycisk Enter;
w miejscu, gdzie naleŜy wpisać wartość napięcia zostanie wyświetlony kursor. Wszystkie
parametry mogą zostać zmienione jak opisano powyŜej. Aby zapisać parametry pulsu,
zobacz Rozdział 3.3.6.
• Aby przejrzeć parametry poprzednio dostarczonych impulsów, zobacz Rozdział 3.8.
3.3.3 Elektroporacja z określoną stałą czasową
Zobacz rozdział 4.1 w celu dyskusji elektroporacji pulsami o rozkładzie ekspotencjalnym.
Aby dostarczyć impuls o rozkładzie wykładniczym z określoną stałą czasową, uŜyj
elektroporatora Gene Pulser Xcell, jak następuje.
• Kiedy ekran główny (Home) (Rysunek 3.2) jest wybrany, naciśnij 2 lub uŜywając klawiszy
strzałek „góra” „dół” podświetl „Time Constant Protocol”, a następnie naciśnij Enter, aby
wybrać protokół. Wyświetlony zostanie ekran ze szczegółami protokołu (Rysunek 3.4).
• wprowadzone mogą być następujące kombinacje parametrów:
Stała czasowa + Napięcie
15
W trybie stałej czasowej, aby maksymalizować energię dostarczoną do próbki, Gene Pulser
Xcell zwiększa opór równoległy (i maksymalnie pomniejsza pojemność). Moduł PC jest
niezbędny do dostarczenia pulsów za pomocą obwodu wysokiego napięcia, podczas gdy
zarówno Moduł CE i PC muszą być podłączone, aby dostarczyć pulsy za pomocą obwodu
niskiego napięcia. Wprowadzona wartość napięcie decyduje, który z obwodów: wysokiego
czy niskiego napięcia zostanie uŜyty. Wprowadzona wartość napięcia ogranicza równieŜ
zakres pojemności, jak to pokazano w Tabeli 3.2. Jeśli wartość napięcia została tak dobrana,
Ŝe mieści się w zakresie zarówno niskiego jaki i wysokiego napięcia, Gene Pulser Xcell
domyślnie uŜyje obwodu niskiego napięcia. Jako pokazano w Tabeli 3.2, zadowalające
wartości stałej czasowej są funkcją oporu próbki i zastosowanego napięcia obwodu.
Bezpośrednio przed dostarczaniem pulsu, Gene Pulser Xcell określa oporność próbki w celu
ustalenia, czy dany puls o zadanych parametrach stałej czasowej i napięcia moŜe zostać
dostarczony. Jeśli ustalona stała czasowa przekracza zakres skali o więcej niŜ 20%, Gene
Pulser Xcell wyświetli informację wskazując przybliŜoną wartość stałej czasowej, która moŜe
zostać dostarczona i poprosi o potwierdzenie dostarczenia pulsu poprzez ponowne
naciśnięcie przycisku „puls”. Aby za pomocą Gene Pulser Xcell oszacować oporność próbki,
zobacz Rozdział 3.9.
Tabela 3.2. Zakresy stałej czasowej, które mogą być dostarczone przez Gene Pulser Xcell
przy róŜnych opornościach próbki.
Oporność próbki
20 Ω
200 Ω
>1000 Ω
zakres stałej czasowej (msec)
LV Obwód niskiego napięcia* HV Obwód wysokiego
napięcia**
0.5 – 65.5
0.2 – 1.0
5.0 – 655
2.0 – 10
25 – 3275
10 – 50
* LV zakres obwodu: 10 – 500 V
** HV zakres obwodu: 200 – 3000 V
Ekran szczegółowy protokołu stałej czasowej
Rysunek 3.4. Ekran szczegółowy protokołu stałej czasowej. Na ekranie tym wyświetlane są
parametry, które mogą być określane dla wykładniczego rozkładu elektroporacji z ustaloną
stałą czasową. Wprowadzenie wielkości kuwety jest opcjonalna i pozostaje tylko dla
informacji uŜytkownika.
• UŜyj strzałek „góra” i „dół” aby przewinąć linie, a następnie podświetl przestrzenie w które
zostaną wpisane wartości pojemności, napięcia albo oporu. UŜyj klawiatury
16
alfanumerycznej do wprowadzenia wymaganej wartości, albo uŜyj strzałek „prawo” i „lewo”
aby powiększyć albo zmniejszyć wartość parametru. UŜyj przycisku Delete albo Clear, aby
zmienić wartość. Kiedy wartość wymagana zostanie wprowadzona, przyciśnij przycisk
Enter. Jeśli wartość jest tak wybrana i określona, Ŝe znajduje się poza zakresem skali
elektroporatora, domyślnie uŜyta zostanie najbliŜsza dopuszczalna przez aparat wartość.
Wprowadzenie średnicy uŜytej kuwety jest opcjonalne i słuŜy tylko dla informacji
uŜytkownika.
• Kiedy niezbędne wartości parametrów zostaną wpisane, oznaczenie "P” zostanie
wyświetlone w dolnym prawym rogu ekranu LCD wskazując, Ŝe przycisk pulsu na Gene
Pulsator Xcell jest aktywny i Ŝe impuls moŜe zostać dostarczony.
• Naciśnij przycisk „puls” aby dostarczyć impuls do próbki. Kiedy przycisk Pulse jest
włączony, na ekranie LCD będzie wyświetlana komenda "Pulsing”. Po zakończeniu,
zostanie wydany sygnał dźwiękowy i wynik pomiaru zostanie pokazany na ekranie jako
protokół wynikowy (zobacz Rysunek 3.7, Rozdział 3.3.5).
• UŜyj strzałek Lewa i Prawa aby przełączyć pomiędzy ekranem zawierającym wyniki
(Results Protocol) i ostatnim ekranem zawierającym szczegóły protokołu (Ekran Detail).
• Przy wybranym ekranie Detail Protocol na LCD moŜe zostać wybrany i dostarczony puls o
innych lub tych samych parametrach. Aby zmienić warunki pulsu, przyciśnij przycisk Enter;
w miejscu, gdzie naleŜy wpisać wartość napięcia zostanie wyświetlony kursor. Wszystkie
parametry mogą zostać zmienione jak opisano powyŜej.
• Aby zapisać parametry pulsu, zobacz Rozdział 3.3.6.
• Aby przejrzeć parametry poprzednio dostarczonych pulsów, zobacz Rozdział 3.8.
3.3.4 Elektroporacja przy uŜyciu pulsu fali kwadratowej
Zobacz rozdział 4.2 w celu dyskusji elektroporacji pulsami o rozkładzie kwadratowym. Aby
dostarczyć puls o rozkładzie kwadratowym, uŜyj elektroporatora Gene Pulser Xcell, jak
następuje.
• Kiedy ekran główny (Home) (Rysunek 3.2) jest wybrany, naciśnij 3 lub uŜywając klawiszy
strzałek „góra” „dół” podświetl „Square wave protocol”, a następnie naciśnij przycisk Enter,
aby wybrać protokół. Wyświetlony zostanie ekran ze szczegółami protokołu (Rysunek 3.5).
• wprowadzone mogą być następujące kombinacje parametrów:
Długość pulsu + Napięcie
Długość pulsu + Napięcie + Liczba pulsów + Odległość pomiędzy pulsami
Ekran szczegółowy protokołu fali kwadratowej
17
Rysunek 3.5 Ekran szczegółowy protokołu fali kwadratowej. Na ekranie tym wyświetlane są
parametry, które mogą być określane dla rozkładu kwadratowego elektroporacji.
Wprowadzenie wielkości kuwety jest opcjonalna i pozostaje tylko dla informacji uŜytkownika.
Elektroporacja korzystająca z fali kwadratowej moŜe zostać uŜyta, w celu dostarczenia do
komórek serii wielokrotnych pulsów. Jest ona określana przez „ilość pulsów”. Czas pomiędzy
poszczególnymi pulsami jest to "odstęp pulsu.” Wartości domyślne dla ilości pulsów i
odstępu pulsu wynoszą odpowiednio 1 i 0. Jeśli więcej niŜ jeden puls ma zostać dostarczony
do próbki, naleŜy wprowadzić inne wartości. Rozdział 4.2 dla dyskusji parametrów pulsu.
Parametry pulsu mogą zostać wprowadzone w dowolnej kolejności. JednakŜe, wprowadzona
wartość napięcia zdecyduje, czy zostanie uŜyty obwód wysokiego, czy niskiego napięcia. W
konsekwencji, ustalone napięcie ograniczy zakresy długości pulsu i odstępu pulsu jak
pokazano w Tabeli 3.3. Jeśli wartości dla drugiego i trzeciego parametru zostaną tak
wybrane, Ŝe znajdą się poza zakresem systemu, domyślnie zostaną zaproponowane
najbardziej zbliŜone i dopuszczalne wartości.
Tabela 3.3 Długość pulsu i zakresy odstępów pulsu dla obwodu wysokiego napięcia / niskiej
pojemności i niskiego napięcia / wysokiej pojemności dla pulsu kwadratowej fali w Gene
Pulsator Xcell.
Napięcie (V) Długość Pulsu Odległość Pulsu Ilość Pulsów
(max)
LV Obwód*
10–500
0.05–100 ms
0.1–10 s
10
HV Obwód
200–3000
0.05–5 msec
5–30 s
2
*UŜycie obwodu niskiego Napięcia wymaga podłączenia Modułu CE.
UŜyj strzałek „góra” i „dół” aby przewinąć linie, a następnie podświetl przestrzenie w które
zostaną wpisane wartości pojemności, napięcia albo oporu. UŜyj klawiatury alfanumerycznej
do wprowadzenia wymaganej wartości, albo uŜyj strzałek „prawo” i „lewo” aby powiększyć
albo zmniejszyć wartość parametru. UŜyj przycisku Delete albo Clear, aby zmienić wartość.
Kiedy wartość wymagana zostanie wprowadzona, przyciśnij przycisk Enter. Jeśli wartość jest
tak wybrana i określona, Ŝe znajduje się poza zakresem skali elektroporatora, domyślnie
uŜyta zostanie najbliŜsza dopuszczalna przez aparat wartość. Wprowadzenie średnicy uŜytej
kuwety jest opcjonalne i słuŜy tylko dla informacji uŜytkownika.
Kiedy niezbędne wartości parametrów zostaną wpisane, oznaczenie "P” zostanie
wyświetlone w dolnym prawym rogu ekranu LCD wskazując, Ŝe przycisk pulsu na Gene
Pulsator Xcell jest aktywny i Ŝe impuls moŜe zostać dostarczony.
18
Naciśnij przycisk „puls” aby dostarczyć impuls do próbki. Kiedy przycisk Pulse jest włączony,
na ekranie LCD będzie wyświetlana komenda "Pulsing”. Po zakończeniu, zostanie wydany
sygnał dźwiękowy i wynik pomiaru zostanie pokazany na ekranie jako protokół wynikowy
(zobacz Rysunek 3.8, Rozdział 3.3.5).
UŜyj strzałek Lewa i Prawa aby przełączyć pomiędzy ekranem zawierającym wyniki (Results
Protocol) i ostatnim ekranem zawierającym szczegóły protokołu (Ekran Detail).
Przy wybranym ekranie Detail Protocol na LCD moŜe zostać wybrany i dostarczony puls o
innych lub tych samych parametrach. Aby zmienić warunki pulsu, przyciśnij przycisk Enter; w
miejscu, gdzie naleŜy wpisać wartość napięcia zostanie wyświetlony kursor. Wszystkie
parametry mogą zostać zmienione jak opisano powyŜej.
Aby zapisać parametry pulsu, zobacz Rozdział 3.3.6.
Aby przejrzeć parametry poprzednio dostarczonych pulsów, zobacz Rozdział 3.8.
3.3.5 Ekrany uzyskanych wyników
Po dostarczeniu impulsu, wyniki zostaną wyświetlone na ekranie LCD jako: "Protocol
Results". Ekran ten pokazuje wyniki zarówno w formie rysunków jak i w formie tabelek.
Rysunki 3.6, 3.7 i 3.8 pokazują przykładowe wyniki wykładniczego rozkładu impulsu,
wykładniczego rozkładu impulsu w którym czas został wcześniej określony oraz odpowiednio
rozkład kwadratowej fali impulsu. Zarówno wyniki ostatnich 100 impulsów jak i parametry
impulsów są przechowywane w pamięci Gene Pulser Xcell. Są one dostępne dzięki
oprogramowaniu Data Management (Rozdział 3.8).
Rozkład wykładniczy: Ekran wyników
Rys.3.6. Ekran protokołu wyników dla rozkładu wykładniczego. Rysunek pokazuje
wykładniczy rozkład impulsu. W tabeli pokazane są przeliczone wartości stałego czasu oraz
dostarczonego napięcia (Voltage).
Stała wartość czasu: Ekran wyników
19
Rys. 3.7 Ekran wyników dla protokołu z określoną wartością stałej czasowej. Wykres
pokazuje ekspotencjalny rozkład impulsu. W tabeli przedstawione są dostarczane wartości
stałej czasowej (TC), napięcia (Voltage), a równieŜ pojemności (Capaticance) i oporności
(Resistance).
Fala kwadratowa: Ekran wyników
Rys. 3.8. Ekran wyników dla protokołu przedstawionego za pomocą fali o rozkładzie
kwadratowym. Wykres przedstawia kwadratową falę impulsu; oś x moŜe nie znaleźć się w tej
skali. Tabela przedstawia rzeczywistą długość fali (Pulse Length), dostarczone napięcie
prądu elektrycznego (Voltage), obliczone nachylenie (% Droop), odstęp pomiędzy impulsami
(Interval) i liczbę impulsów (Number) w przypadku gdy dostarczane są wielokrotne impulsy.
3.3.6 Ochrona programu przed Operacjami Ręcznymi.
Protokół utworzony w trybie ręcznym moŜe być zapisywany jako protokół uŜytkownika, w
następujący sposób:
• Utwórz protokół jak to było opisane w Rozdziale 3.3.2, 3.3.3 albo 3.3.4.
• Kiedy otworzysz ekran szczegółowy protokołu, wciśnij „Save”.
• Na ekranie pojawi się katalog pierwszego uŜytkownika (Rysunek 3.9); drugi rząd
proponuje wybrane połoŜenie dla protokołu (Choose location for protocol).
• UŜyj klawiszy prawej i lewej strzałki, aby przełączać pomiędzy dwoma ekranami
katalogu. Aby podświetlić nazwę uŜytkownika, który będzie przechowywał protokół
wciśnij przyciski 1–12 albo wykorzystaj przyciski "góra" lub "dół". Aby wybrać nazwę
uŜytkownika naciśnij klawisz "enter". Pojawi się ekran protokołów uŜytkownika (Rysunek
3.10); drugi rząd przeczyta to jako wybrane połoŜenie dla zapisania protokołu. Gdyby
20
•
•
zaistniała potrzeba aby stworzyć nową nazwę uŜytkownika, naleŜy ją wprowadzić,
zobacz Rozdział 3.5.2.
UŜyj przycisków prawej i lewej strzałki, aby przełączać pomiędzy dwoma kolejnymi
ekranami uŜytkownika. Naciśnij przyciski 1–12 albo wykorzystaj przyciski "góra" lub "dół"
aby podświetlić połoŜenie dla nowego protokołu. Protokół moŜe być przechowywany na
danej pozycji bez Ŝadnego wchodzenia (zobacz Rozdział 3.3.6A) albo w pozycji z
wejściem (zobacz Rozdział 3.3.6B). Jeśli jest to konieczne, skasuj protokół uŜytkownika
jak to było opisane w Rozdziale 3.5.5.
Aby skorzystać z zapisanego protokołu, naciśnij klawisz "Enter" - aby zobaczyć ekran
szczegółowy protokołu. Wciśnij klawisz "Pulse" aby przeprowadzić elektroporację próbki.
21
Ekran katalogu uŜytkownika
Rys 3.9. Ekran katalogu uŜytkownika. To jest przykład ekranu katalogu pierwszego
uŜytkownika. UŜywając strzałek "lewo" i "prawo” przełączaj pomiędzy tym ekranem, a
kolejnym, aŜ do katalogów dla uŜytkowników 7-12. Dla fabrycznie nowego aparatu,
początkowy ekran katalogu uŜytkownika będzie posiadał tylko liczby bez Ŝadnych nazw.
Ekran protokołów uŜytkownika
Rys. 3.10. Ekran protokołów uŜytkownika. To jest przykład pierwszego ekranu protokołów
uŜytkownika. Przełączaj pomiędzy tym a drugim ekranem z protokołami 7–12 uŜywając lewej
i prawej strzałki . Dla fabrycznie nowego aparatu, początkowy ekran katalogu uŜytkownika
będzie posiadał tylko liczby bez Ŝadnych nazw.
3.3.6.A. Zapisywanie protokołu w
Protokołu UŜytkownika.
•
•
•
wybranym połoŜeniu bez określonego
Kiedy na ekranie LCD zostaną wyświetlone Protokoły UŜytkownika, naciskając klawisze
1-12 albo uŜywając strzałek "góra", "dół", "lewo" i "prawo" bez wchodzenia moŜesz
podświetlić wybrany protokół (np. pozycje 4, 5, albo 6 na ekranie, tak jak pokazano na
rysunku 3.10 ).
Naciśnij przycisk "Enter" aby wybrać protokół.
Wprowadź nazwę za pomocą klawiatury alfa-numerycznej (wprowadzane znaki
alfabetyczne będą rozpoznawane jako luka; naciśnij Shift aby przełączyć pomiędzy
wprowadzaniem alfabetycznym a numerycznym; maksymalna długość opisu to 10
znaków; aby uŜyć tego samego klawisza dwa razy, przesuń kursor uŜywając prawej
strzałki; wolne przestrzenie nie są dozwolone). Naciskaj przycisk „Save” lub „Enter”.
Protokół zostanie w Protokołach UŜytkownika.
22
•
MoŜna uŜyć juŜ wcześniej zapisanego protokołu, naciśnij klawisz "Enter" aby zobaczyć
ekran szczegółowy protokołu. Naciśnij przycisk „Pulse”, aby dostarczyć impuls i
rozpocząć doświadczenie.
3.3.6.B Zapisywanie protokołu w wybranym połoŜeniu z nazwanym Protokołem
UŜytkownika
•
•
•
Kiedy na wyświetlaczu LCD wyświetli się ekran Protokołów UŜytkownika, naciśnij któryś z
przycisków 1-12 albo uŜyj strzałek "góra", "dół", "lewo" i "prawo" aby podświetlić
konkretny protokół uŜytkownika, (np. pozycje 1, 2, albo 3 na ekranie na rysunku 3.10).
Wciśnij klawisz " Enter "aby wybrać protokół.
Ekran ostrzegawczy pojawi się z pytaniem czy chcesz nadpisać (zapisać obecny protokół
na juŜ istniejącym protokole) zaznaczony protokół uŜytkownika (Rysunek 3.11).
Ekran ostrzegawczy : nadpisanie protokołu.
Rys. 3.11. Ekran ostrzegawczy: nadpisanie protokołu.
•
•
•
3.4
Domyślny wybór jest oznaczony: “No”. Naciśnij klawisz "Enter" jeśli nie chcesz
nadpisać tych danych. Program automatycznie powróci do poprzedniego ekranu
Protokołu UŜytkownika.
Naciśnij przycisk strzałki "lewo" aby wybrać “Yes”, a następnie naciśnij klawisz " Enter",
aby nadpisać dane. Protokół UŜytkownika będzie miał taką samą nazwę i będzie
zawierał wszystkie z parametrów określonych w nowym Protokole UŜytkownika.
Program powróci do ekranu Protokołu UŜytkownika z kursorem podświetlającym
pozycję (ilości) zaznaczonych protokołów.
Aby skorzystać z zapisanego protokołu, naciśnij klawisz "Enter", aby zobaczyć ekran
szczegółowy protokołu. Naciśnij przycisk "Pulse" aby dostarczyć impuls i rozpocząć
doświadczenie.
Wcześniej zaprogramowane protokoły
Gen Pulser Xcell posiada wstępnie zaprogramowane protokoły, które zawierają ustawienia
zoptymalizowane ze względu na liczbę powszechnie uŜywanych bakterii, grzybów i komórek
ssaczych. Ustawienia zostały podane w tabeli 3.4. Ustawienia mogą równieŜ zostać
wyświetlone na ekranie LCD, jak opisano poniŜej (zobacz Rozdział 3.4.2). MoŜliwe jest takie
ustawienia protokołu, Ŝe przed poddaniem próbki działaniu impulsu elektrycznego nie będzie
moŜna wprowadzić Ŝadnych zmian. śadne trwałe zmiany nie mogą być wprowadzone do
protokołu wcześniej zaprogramowanego, ale mogą być zapisane jako Protokół UŜytkownika
(zobacz Rozdziały 3.4.4).
23
3.4.1 UŜywanie wcześniej zaprogramowanego protokołu (krótki przewodnik).
•
•
•
•
•
Z ekranu głównego, naciśnij 4, aby wyświetlić ekran wcześniej zaprogramowanych
protokołów (pre-set).
Naciskaj przyciski numeryczne 1–3, aby wybrać pomiędzy komórkami bakterii, grzybów
albo ssaków; naciśnij klawisz "Enter", aby wybrać typ komórek i pokazać listę dostępnych
organizmów. Dla wybrania któregoś z wcześniej zaprogramowanych protokołów
bakteryjnych lub ssaczych, uŜyj strzałki "prawo" lub "lewo" aby przełączyć pomiędzy
dwoma kolejnymi ekranami.
Aby wybrać dany protokół naciśnij numer protokołu, a zostanie on podświetlony, naciśnij
przycisk "Enter" aby wybrać i pokazać ekran szczegółowy protokołu.
Naciśnij przycisk "Pulse" aby spowodować elektroporację próbki.
Naciśnij klawisz "Back" aby powrócić do ekranu szczegółowego protokołu i dostarczyć
kolejny impuls.
3.4.2 Przeprowadzenie elektroporacji uŜywając nastawiania protokołów.
Dostępnych jest dziewięć wcześniej zaprogramowanych protokołów dla bakterii, sześć
protokołów dla grzybów oraz 12 protokołów dla ssaków. Protokoły są wstępnie
zaprogramowane z optymalnymi parametrami określonymi dla danego organizmu.
UŜyj wcześniej zaprogramowanych protokołów jak następuje:
• Na głównym ekranie naciśnij 4 albo wykorzystaj przyciski " góra " lub " dół " aby podświetlić
zaprogramowany protokół, następnie wciśnij "Enter" albo wybierz odpowiedni typ protokołu i
podświetl go na ekranie ( Rysunek 3.12).
•Naciśnij 1-3, albo wykorzystaj przyciski "góra" lub "dół", aby podświetlić zaprogramowane
protokoły dla bakterii, grzybów lub ssaków, następnie wciśnij przycisk "Enter" aby potwierdzić
doknany wybór.
• Wykorzystaj klawiaturę alfanumeryczną albo klawiszy "góra", "dół" aby przewinąć przez
listę nazw. Wybierając protokoły dla bakterii i ssaków, uŜyj klawiszy " Prawo", "Lewo" aby
przechodzić pomiędzy tymi dwoma ekranami. Kiedy liczba odpowiadająca Ŝądanej nazwie
jest podświetlona, naciśnij przycisk "Enter" aby wybrać i aby pokazać ekran szczegółowy
protokołu, przedstawiający parametry elektroporacji dla tego protokołu. Migające “P” w
lewym dolnym rogu w oznaczonym miejscu wyświetlacza LCD, wskazuje na to, Ŝe przycisk
"Pulse" jest włączony.
• Na przykład, podczas wyświetlania ekranu wcześniej zaprogramowanych protokołów,
naciśnij 3 aby podświetlić “Mammalian”, wtedy naciśnij przycisk "Enter" aby wybrać i
potwierdzić wybór pierwszego ekranu zaprogramowanych protokołów dla ssaków, które
zawierają sześć zaprogramowanych protokołów (Rys. 3.13). Naciśnij strzałki "lewo", "prawo"
aby przełączać pomiędzy dwoma ekranami zaprogramowanych protokołów ssaczych. UŜyj
klawiatury alfa -numerycznej albo strzałek "góra", "dół" aby przewijać listę nazw. Kiedy
Ŝądana nazwa zostanie podświetlona, naciśnij przycisk "Enter". Aby zaznaczyć wybrany
protokół i aby obejrzeć ekran szczegółowy protokołu, pokazującego parametry elektroporacji
dla danego protokołu. Dla przykładu, podczas działania ekranu protokołu ssaczego , naciśnij:
1, następnie wciśnij przycisk "Enter" aby wybrać ekran szczegółowy protokołu dla komórek
CHO, znajdujących się w kuwecie o średnicy 2 mm ( Rysunek 3.14 )
• Naciśnij przycisk "Pulse" aby dostarczyć impuls. Kiedy przycisk "Pulse" jest wciśnięty,
wyświetlacz LCD będzie pusty, potem na ekranie pokaŜe się komunikat: "Pulsing". Zaraz po
zakończeniu procesu, pojawi się sygnał dźwiękowy oraz wyniki pomiaru impulsu na ekranie
wynikowym protokołu ( zobacz Rozdział 3.3.5 ) .
• UŜywaj strzałek "lewo", "prawo", aby przełączyć pomiędzy ekranem wyników protokołu, a
ekranem szczegółowym protokołu .
• Podczas wyświetlania ekranu szczegółowego protokołu, moŜe być dostarczony inny impuls
za pomocą tych samych parametrów impulsu. Aby zmienić warunki wysyłania impulsu,
24
naciśnij przycisk "Enter", kursor pojawi się na miejscu, w które naleŜy wpisać wartość
napięcia. Protokoły mogą one być zmienione na takich samych warunkach jak w rozdziale
3.4.3.
•Aby powtórzyć wcześniej dostarczony impuls, zobacz Rozdział 3.8.
Ekran nastawiania protokołu.
Rys. 3.12. Ekran wyboru protokołu zaprogramowanego. W katalogu zapisane są wcześniej
zaprogramowane protokoły dla komórek bakterii, grzybów i ssaków. Aby dokonać selekcji z
katalogów z podanej listy uŜywaj powyŜszego ekranu.
Ekran nastawianych protokołów ssaczych ( ekran numer 1 )
Ekran nastawianych protokołów ssaczych ( ekran numer 2 )
Rys. 3.13. Ekran zaprogramowanych protokołów ssaczych. Protokoły są dostarczane dla 12
linii komórek ssaczych . Nazwy pierwszych sześciu są pokazywane na ekranie numer 1; zaś
nazwy kolejnych sześciu są pokazywane na ekranie numer 2 .
25
Nastawianie protokołu dla CHO .
Rys 3.14. Ekran szczegółowy protokołu dla komórek CHO w menu nastawiania protokołów .
Tabelka 3.4. Zoptymalizowane ustawienia, zapisane w protokołach Gene Pulser Xcell
Określenie
nastawienia
protokołu
Mammalian 1
Komórki
Rodzaj Impulsu
PL
(msec)
CHO
kwadratowy
15
Mammalian 2
COS7
kwadratowy
20
Mammalian 3
3T3
Ekspotencjalny
Mammalian 4
293
kwadratowy
Mammalian 5
HeLa
Ekspotencjalny
Mammalian 6
BHK21
kwadratowy
Mammalian 7
A549
Mammalian 8
C
(µF)
160
Kuweta
(cm)
0.2
Napięcie
Komórki
(µl)
100
110
0.2
100
160
0.2
100
110
0.2
100
160
0.2
100
25
140
0.2
100
kwadratowy
10
150
0.2
100
CV1
kwadratowy
25
100
0.2
100
Mammalian 9
K562
Ekspotencjalny
155
0.2
100
Mammalian 10
HL60
kwadratowy
140
0.2
100
Mammalian 11
Jurkat
Ekspotencjalny
140
0.2
100
Mammalian 12
HuT78
kwadratowy
130
0.2
100
Bacterial 1
E coli
Ekspotencjalny
500
PC
(ohm)
∞
25
500
1000
∞
∞
25
1000
∞
25
V
25
200
1800
0.1
20
Bacterial 2
25
200
2500
0.2
20–40
Bacterial 3
25
200
3000
0.2
20–40
Bacterial 4
A tumefaciens
Ekspotencjalny
25
200
2400
0.1
20
Bacterial 5
P aeruginosa
Ekspotencjalny
25
200
2500
0.2
100
Bacterial 6
S aureus
Ekspotencjalny
25
100
2900
0.2
50
26
Bacterial 7
B cereus
Ekspotencjalny
50
200
1000
0.2
100
Bacterial 8
S pyogenes
Ekspotencjalny
25
200
2100
0.2
200
Bacterial 9
L plantarum
Ekspotencjalny
25
400
2000
0.2
40
Fungal 1
S cerevisiae
Ekspotencjalny
25
200
1500
0.2
40
25
200
2500
0.4
80
Ekspotencjalny
25
200
2300
0.2
80
Fungal 2
Fungal 3
Fungal 4
S pombe
Ekspotencjalny
25
200
1500
0.2
40
Fungal 5
P pastoris
Ekspotencjalny
25
200
2000
0.2
40
Fungal 6
D discoideum
Ekspotencjalny
1000
0.4
800 (2
pulses)*
1.0
10
*- 2 pulses – dwa impulsy ,
Mammalian – ssaczy,
Bacterial – bakteryjny ,
Fungal – grzybowy,
Square wave – fala kwadratowa,
Exponential decay – rozpad wykładniczy,
3.4.3 Modyfikowanie parametrów nastawiania protokołu
Parametry dla wcześniej zaprogramowanego protokółu mogą zostać zmienione jak
następuje:
• Podczas działania ekranu szczegółowego protokołu, naciśnij strzałkę "góra", "dół" aby
podświetlić wartość dla jednego z parametrów (napięcie, pojemność, opór dla impulsów
rozkładu wykładniczego; napięcie albo stała wartość czasowa dla trybu stałego czasu;
długość impulsu, napięcie, liczba impulsów albo przerwa w dostarczaniu impulsu dla
kwadratowej fali impulsu). (ZauwaŜ: forma fali nie moŜe by zmieniona w trybie wcześniej
zaprogramowanego protokołu.) Gdy Ŝądany parametr zostanie wybrany, uŜyj alfanumerycznej klawiatury aby wprowadzić nową wartość. Ewentualnie, uŜyj strzałki "prawo",
"lewo" aby zmienić stopniowy przyrost albo obniŜenie odpowiedniej wartości parametru. UŜyj
klawiszy "Delete", "Clear" aby poprawić zapis. Kiedy wprowadzony zostanie właściwy zapis,
naciśnij przycisk "Enter" aby potwierdzić swój wybór. JeŜeli wyznaczona wartość będzie
przekraczać maksymalną wartość moŜliwą dla Gene Pulser Xcell to zostanie zasugerowana
nowa wartość - najbliŜsza dozwolona. UŜyj strzałek 'Góra", "Dół" aby wybrać inne wartości
parametrów, które mają zostać zmienione, następnie aby wprowadzić Ŝądaną wartość uŜyj
klawiatury alfa-numerycznej albo strzałek "Lewo", "Prawo".
• Impuls moŜe być dostarczony jedynie wtedy gdy wszystkie parametry zostały wprowadzone
w odpowiednie miejsca na ekranie szczegółowy protokołu. Kolejnym warunkiem dla wysłania
impulsu jest pojawienie się migoczącego znaku "P" w dolnym lewym rogu na wyświetlaczu
LCD
• Aby powrócić do ekranu szczegółowego protokołu, naciśnij przycisk " Back" albo strzałkę
"Lewo". UŜywając tych samych parametrów wyświetlonych na ekranie LCD moŜna
spowodować dostarczenie kolejnego impulsu. Aby powrócić do ekranu wyników protokołu,
naciśnij strzałkę "Prawo". (ZauwaŜ, Ŝe powracając do ekranu szczegółowego protokołu,
powracasz do protokołu ze zmodyfikowanymi parametrami. Aby powrócić do wcześniej
27
zaprogramowanego protokołu, naciśnij ponownie przycisk „Back". Czynność ta doprowadzi
do wymazania wszystkich wcześniej dokonanych zmian .)
• Aby zmienić warunki wysyłania impulsu, będąc na ekranie szczegółowym naciśnij klawisz
"Enter" ; spowoduje to pojawienie się kursora , który będzie wskazywał wartość parametru
napięcia . Dane parametry mogą ulec zmianie - jak to było opisane powyŜej .
• Aby dokonać przeglądu wcześniej dostarczonych impulsów , zobacz Rozdział 3.8.
3.4.4 Zapisywanie zmian dla protokołu nastawianego .
Zmiany zaprowadzone w obrębie protokołu nastawionego mogą być zapisane jako protokół
uŜytkownika w następujący sposób :
• Zmień protokół nastawiony tak jak to było opisane w Rozdziale 3.4.3.
• Podczas działania ekranu szczegółowego protokołu , naciśnij " Save " .
• Pojawi się ekran katalogu pierwszego uŜytkownika ( Rysunek 3.9 ); druga linijka będzie
proponowała miejsce na którym ma być zapisany protokół .
• UŜyj strzałek "Lewo", "Prawo" aby przewinąć pomiędzy dwoma ekranami katalogu
uŜytkownika. Naciskaj przyciski 1-12 albo uŜyj klawiszy "Góra", "Dół" aby podświetlić nazwę
uŜytkownika znajdującą się pod właściwą nazwą , którą zamierzamy wybrać aby ją zapisać w
protokole . Naciśnij " Enter " aby wybrać nazwę uŜytkownika . Pojawi się ekran protokołów
uŜytkownika ( Rysunek 3.10 ); druga linijka będzie proponowała miejsce, w którym ma być
zapisany protokół. Jeśli jest to potrzebne to stwórz nową nazwę uŜytkownika, zobacz
Rozdział 3.5.2.
• UŜyj strzałek "Prawo", "Lewo" aby przełączyć pomiędzy dwoma ekranami protokołów
uŜytkownika .Naciskaj przyciski 1-12 albo uŜyj strzałek "Góra" , "Dół" aby podświetlić
połoŜenie dla protokołu . Protokół moŜe być zapisany bez wejścia (zobacz Rozdział 3.3.6A)
albo na pozycji z wejściem ( zobacz Rozdział 3.3.6B ) . Jeśli jest to konieczne , usuń protokół
uŜytkownika, tak jak było to opisane w Rozdziale 3.5.5.
• Aby uŜyć zapisanego protokołu, naciśnij "Enter" po to aby zobaczyć ekran szczegółowy
protokołu. Naciśnij przycisk "Pulse" aby dostarczyć impuls.
3.5
Protokoły uŜytkownika.
Protokoły uŜytkownika Gene Pulser Xcell zezwalają na przechowywanie własnego protokołu
uŜytkownika. Zaprogramowanych i przechowywanych w pamięci tego urządzenia moŜe być
nawet do 144 elektroporacji (12 nazw uŜytkowników w katalogu uŜytkownika). Nowy protokół
moŜe być stworzony przez:
• Stworzenie nowego protokołu przez wprowadzenie całkowicie nowych parametrów w trybie
ręcznym ( Rozdziały 3.3.2, 3.3.3 i 3.3.4 ) .
• Modyfikowanie protokołu wcześniej zaprogramowanego ( Rozdział 3.4.3 ) .
• Stworzenie nowego protokołu jako protokołu uŜytkownika ( Rozdział 3.5.3 ) .
• Modyfikowanie istniejącego juŜ protokołu ( Rozdział 3.5.4 ) .
Protokoły stworzone albo zmodyfikowane w menu protokołów uŜytkownika mogą być uŜyte
bez potrzeby ich zapisywania ( Rozdział 3.5.4) .
3.5.1 UŜywanie protokołu uŜytkownika .
• Podczas działania głównego ekranu, naciśnij 5 a potem klawisz "Enter" aby otworzyć menu
protokołów uŜytkownika i aby pokazał się ekran katalogu pierwszego uŜytkownika. UŜywaj
strzałek "Lewo", "Prawo" aby przełączać pomiędzy tymi dwoma ekranami .
• Naciskaj przyciski 1-12 aby podświetlić Ŝądaną nazwę; naciśnij przycisk "Enter" aby wybrać
nazwę i aby pokazał się ekran protokołów pierwszego uŜytkownika. UŜywaj strzałek "Lewo" ,
"Prawo" aby przełączać pomiędzy tymi dwoma ekranami.
28
• Naciskaj przyciski 1-12 aby podświetlić Ŝądaną nazwę protokołu ; naciśnij wtedy klawisz
Enter" aby potwierdzić ten protokół i wyświetlić go na ekranie. W tym momencie jest aktywny
przycisk "Pulse".
• Naciśnij przycisk "Pulse" aby elektroporować próbkę .
• Naciśnij przycisk "Back" aby powrócić do ekranu szczegółów protokołu i dostarczyć kolejny
impuls.
3.5.2 Tworzenie nowej nazwy uŜytkownika .
Nowa nazwa uŜytkownika moŜe być stworzona, jedynie wtedy gdy w bezpośrednim
sąsiedztwie wybranego numeru tego katalogu uŜytkownika znajduje się wolne miejsce
(Rysunek 3.15). Jeśli jest to potrzebne to usuń nazwę uŜytkownika albo protokół
uŜytkownika, zobacz Rozdział 3.5.5.
Aby stworzyć nazwę uŜytkownika na ekranie nazwy uŜytkownika postępuj jak następuje.
• Podczas działania głównego ekranu ( Rysunek 3.2 ) , naciśnij 5 albo uŜyj strzałek "Góra" ,
"Dół" aby podświetlić "User Protocols", następnie naciśnij przycisk "Enter" aby pokazał się
ekran katalogu uŜytkownika ( Rysunek 3.15 ).
• UŜywaj strzałek "Prawo", "Lewo" aby przełączać pomiędzy dwoma ekranami katalogu
uŜytkownika. Naciskaj przyciski 1-12 albo strzałki "Góra", "Dół" aby podświetlić miejsce bez
zapisu. Przyciśnij klawisz "Enter" aby wybrać właściwe połoŜenie.
• UŜywaj klawiatury alfa-numerycznej aby wpisać poŜądaną nazwę w nazwie uŜytkownika.
KaŜda nazwa moŜe mieć do dziesięciu znaków. naciśnij "Save" kiedy zakończysz. Nowa
nazwa uŜytkownika jest zapisana.
3.5.3 Tworzenie nowego protokołu uŜytkownika .
Rozdział ten jest poświęcony tworzeniu nowego protokołu uŜytkownika, zaczynając od
ekranu protokołów uŜytkownika i zapisanego protokołu. Nowy protokół uŜytkownika moŜe
być stworzony kiedy jest wolne miejsce obok tego protokołu na ekranie protokołu
uŜytkownika ( Rysunek 3.16 ). Rozdział 3.5.4 opisuje jak stworzyć albo zmienić istniejący juŜ
protokół uŜytkownika i zapisać poczynione zmiany .
• Aby z ekranu głównego wejść do ekranu protokołów uŜytkownika ( Rysunek 3.2 ) :
• Naciśnij klawisz 5 albo uŜywaj strzałek " Góra " , " Dół " aby podświetlić " User Protocols " ,
następnie przyciśnij klawisz " Enter " aby pokazał sie ekran katalogu pierwszego uŜytkownika
( Rysunek 3.15 ).
• UŜywaj strzałek "Prawo" , "Lewo" aby przewijać pomiędzy dwoma ekranami katalogu
uŜytkownika . Naciskaj przyciski 1-12 albo uŜywaj strzałek "Góra" , "Dół" aby podświetlić
odpowiedni numer dla Ŝądanej nazwy uŜytkownika .
• Naciśnij "Enter" aby wybrać odpowiednią nazwę i aby pokazał sie ekran protokołów
uŜytkownika ( Rysunek 3.16 ) .
• Naciskaj przyciski 1-12 albo uŜywaj strzałek "Góra" , "Dół" , "Lewo" , "Prawo" aby
podświetlić protokół uŜytkownika bez wpisu . Jeśli jest to potrzebne , usuń protokół
uŜytkownika , tak jak było to opisane w Rozdziale 3.5.5. Następnie naciśnij przycisk "Enter"
aby pokazał się ekran wyboru metody ( Rysunek 3.17 ) .
• Naciskaj przyciski 1-3 albo uŜywaj strzałek "Góra" , "Dół" aby podświetlić numer
odpowiadający dostarczonemu impulsowi wykładniczego rozpadu ( protokół wykładniczy ) ,
impulsowi wykładniczego rozpadu o wyznaczonej stałej wartości czasu ( protokół stałego
czasu ). Naciśnij przycisk "Enter" aby potwierdzić swój wybór i aby pokazał się właściwy
ekran szczegółów protokołu .
29
Protokół uŜytkownika : ekran katalogu uŜytkownika ( ekran numer 1 )
Protokół uŜytkownika : ekran katalogu uŜytkownika ( ekran numer 2 )
Rys. 3.15 Ekran katalogu uŜytkownika .
Ekran protokołu uŜytkownika
Rys. Ekran protokołu uŜytkownika .
Wybieranie ekranu metody
30
Rys. Wybieranie ekranu metody .
• Kiedy zostanie wybrany "Exponential protocol" (protokół wykładniczy), na LCD pojawi się
ekran szczegółowego protokółu wykładniczego ( Rysunek 3.18 ) z nazwą uŜytkownika w
pierwszej linii .
Ekran szczegółowego protokołu wykładniczego rozpadu
Rys. 3.18 Ekran szczegółowego protokołu wykładniczego rozpadu .
• Kiedy zostanie wybrany "Time constant protocol" , na LCD pojawi się ekran szczegółowego
protokołu dla stałej wartości czasu ( Rysunek 3.19 ) z nazwa uŜytkownika w pierwszej linii .
Ekran szczegółowego protokołu dla stałej wartości czasu
Rys. 3.19 Ekran szczegółowego protokołu dla stałej wartości czasu .
• Kiedy zostanie wybrany "Square wave protocol" , na LCD pojawi się ekran szczegółowego
protokołu dla fali kwadratowej ( Rysunek 3.20 ) z nazwą uŜytkownika w pierwszej linii .
31
Ekran szczegółowego protokołu dla fali kwadratowej
Rys. 3.20 Ekran szczegółowego protokołu dla fali kwadratowej .
• UŜywaj strzałek "Góra" , "Dół" aby przewijać pomiędzy przestrzeniami na wartości
parametrów na odpowiednim ekranie szczegółowego protokołu . UŜyj klawiatury alfanumerycznej do wprowadzenia poŜądanych wartości , albo wykorzystaj strzałek "Lewo" ,
"Prawo" do stopniowego podwyŜszenia lub obniŜenia wartości parametru . UŜyj , jeśli
wyniknie taka potrzeba , klawiszy "Delete" albo "Clear" do skorygowania wprowadzonych
wartości . Kiedy będziesz pewien wpisanych wartości , naciśnij dla potwierdzenia klawisz
"Enter" . Jeśli wyznaczona wartość parametru przekroczy dopuszczalny limit , to wartość ta
zostanie domyślnie skorygowana do najbliŜszej dozwolonej jednostki zaprogramowanej dla
Gene Pulser Xcell ( zobacz Tabelkę 3.1,3.2 i 3.3) . Wprowadzanie wymiaru dla kuwety jest
dowolne i pozostaje ono jedynie do informacji osoby korzystającej z tego urządzenia .
• Kiedy zostaną juz wprowadzone parametry niezbędne do przeprowadzenia badania , to
pojawi się migające "P" w lewym dolnym rogu wyświetlacza LCD . Oznacza to , Ŝe moŜna
uŜyć przycisku "Pulse" i dostarczyć impuls badanej próbce .
• Naciśnij przycisk "Pulse" aby dostarczyć próbce impuls . Wyświetlacz LCD będzie czysty
gdy przycisk "Pulse" będzie wciśnięty , potem zaś na wyświetlaczu pojawi się napis "Pulsing"
. Dźwięk oznajmi zakończenie badania a w chwilę potem na ekranie wyników protokołu
pokaŜą wyniki testu ( zobacz Rozdział 3.3.5 ).
• Aby zapisać parametry impulsu podczas działania ekranu szczegółów protokołu na
wyświetlaczu LCD naciśnij przycisk "Save".
• Pojawi się wtedy ekran protokołów uŜytkownika z migającym kursorem na pierwszym
znaku wyznaczonego połoŜenia . Za pomocą klawiatury alfa-numerycznej odpowiednią
nazwę (pamiętaj Ŝe wpisy alfabetyczne są uznawane jako wpisy domyślne ; naciśnij klawisz
"Shift" aby przełączyć pomiędzy wpisami alfabetycznymi a numerycznymi ). Przyciśnij
klawisz "Save" albo "Enter" kiedy ukończysz dokonywania wpisu . Protokół jest zapisany w
nazwanej wcześniej pozycji na ekranie protokołów uŜytkownika .
3.5.4 Modyfikowanie protokołu uŜytkownika
Protokół moŜe być zmodyfikowany jak następuje .
• Aby wejść ekranu protokołów uŜytkownika z ekranu głównego ( Rysunek 3.2 ) :
• Naciśnij przycisk 5 albo uŜyj strzałek "Góra" , "Dół" aby podświetlić "User Protocols" ,
naciśnij wtedy przycisk "Enter" aby pokazał się ekran katalogu pierwszego uŜytkownika (
Rysunek 3.15 ) .
• UŜywaj strzałek "Prawo", "Lewo" aby przełączać pomiędzy dwoma ekranami katalogu
uŜytkownika . Naciskaj przyciski 1-12 albo uŜywaj strzałek "Góra" , "Dół" aby podświetlić
poŜądaną nazwę uŜytkownika . Naciśnij klawisz "Enter" aby wybrać nazwę i aby pokazał się
ekran protokołów pierwszego uŜytkownika ( Rysunek 3.16 ) .
32
• Naciskaj przyciski 1-12 albo uŜywaj strzałek "Góra" , "Dół" , "Lewo" , "Prawo" aby
podświetlić protokół uŜytkownika , który ma być edytowany . Naciśnij klawisz "Enter" aby
pokazał się ekran szczegółów protokołu .
Labguy: Protocol:
Voltage (napięcie) (V) XXXX
Pulse length (długość impulsu) (msec) XXX.XX
Number of pulses ( liczbę impulsów) 1
Pulse interval (odstępy pomiędzy impulsami)(sec) 00.0
Cuvette (rozmiar kuwety) (mm) X
• UŜywaj strzałek "Góra" , "Dół" aby podświetlić wartość pierwszy parametr , którego wartość
ma ulec zmianie . UŜywaj klawiatury alfa-numerycznej aby wpisać nową wartość .
Ewentualnie , skorzystaj z przycisków "Prawo" , "Lewo" aby stopniowo zmniejszyć lub
zwiększyć wartość danego parametru . UŜyj klawiszy "Delete" , "Clear" aby skorygować stary
wpis .
• Naciśnij przycisk "Enter" kiedy Ŝądana wartość zostanie określona . Jeśli wpisana wartość
przekroczy dozwolone limity określone dla Gene Pulser Xcell , to zostanie ona domyślnie
zmieniona do najbliŜszej dozwolonej wartości .
• UŜywaj strzałek "Góra" , "Dół" aby podświetlić parametr , który ma być zmieniony i powtórz
dwa poprzednie kroki . Przycisk "Pulse" będzie aktywny gdy zostaną wprowadzone do
ekranu szczegółów protokołu wszystkie parametry niezbędne dla poprawnego działania
Gene Pulser Xcell . Tak przetworzony protokół moŜe być uŜywany bez zapisywania .
• Aby zapisać edytowany protokół , podczas działania ekranu szczegółowego protokołu na
wyświetlaczu LCD naciśnij przycisk "Save" . Pojawi się ekran ostrzegawczy , pytający o to
czy chcesz ponownie zapisać protokół ( Rysunek 3.21 ). Nie podjęcie wyboru będzie
jednoznaczne z odrzucenie ponownego zapisu .
• JeŜeli nie chcesz ponownie zapisać nazwy , naciśnij przycisk "Back" aby powrócić do
ekranu szczegółów protokołu . Przyciśnij klawisz "Enter" aby powrócić do katalogu
uŜytkownika i aby wybrać nowe połoŜenie ( Rysunek 3.9 ). Zobacz rozdział 3.3.6 aby
dowiedzieć się więcej o wybieraniu połoŜenia dla nowego protokołu .
• Aby zapisać ponownie dany protokół , naciśnij strzałkę "Lewo" aby wybrać "Yes" ,
następnie naciśnij klawisz "Enter" aby nadpisać dane . Protokół uŜytkownika będzie miał taką
samą nazwę jak stare dane i będzie posiadał parametry określone w nowym protokole .
Wyświetlacz LCD będzie wyświetlał ekran protokołów uŜytkownika z kursorem wskazującym
połoŜenie ( numer ) protokołu .
Ekran ostrzegawczy : nadpisywanie protokołu
Rys. 3.21 Ekran ostrzegawczy: nadpisywanie protokołu .
33
3.5.5 Usuwanie nazwy oraz protokołu uŜytkownika .
Zanim przystąpisz do usuwania nazwy uŜytkownika, musisz usunąć wszystkie protokoły
uŜytkownika znajdujące się w katalogu pod tą nazwą. Usuwanie protokołu przeprowadź w
następujący sposób:
• Aby wejść do ekranu protokołu uŜytkownika z ekranu głównego (Rysunek 3.2):
• Naciśnij przycisk 5 albo uŜyj strzałek "Góra" "Dół" aby podświetlić "User Protocols",
następnie naciśnij przycisk "Enter" aby pokazał się ekran pierwszego uŜytkownika (Rusunek
3.15). UŜywaj strzałek "Prawo", "Lewo" aby przełączać pomiędzy ekranami katalogu
uŜytkownika.
• Wprowadź numer właściwy dla Ŝądanej nazwy uŜytkownika albo uŜyj strzałek "Góra" ,
"Dół" aby podświetlić wybraną nazwę uŜytkownika .
• Naciśnij klawisz "Enter" aby wybrać nazwę i aby pokazał się ekran protokołów
uŜytkownika.
Do you want to overwrite the
protocol ?
YES NO
Czy chcesz nadpisać dany protokół ?
Press BACK or ENTER to return to the previous screen.
Naciśnij klawisz "Back" albo "Enter" aby powrócić do poprzedniego ekranu.
Press the LEFT arrow then ENTER to overwrite the name.
Naciśnij strzałkę "Lewo" a następnie klawisz "Enter" aby nadpisać nazwę .
Do you want to overwrite the protocol?
YES NO
Czy chcesz nadpisać dany protokół ?
Press BACK or ENTER to return to the previous screen.
Naciśnij albo klawisz “Back” albo “Enter” aby powrócić do poprzedniego ekranu.
Press the LEFT arrow then ENTER to overwrite the name.
Naciśnij strzałkę ”Lewo” albo przycisk “Enter” aby nadpisać nazwę .
• UŜywaj klawiatury alfa-numerycznej albo strzałek "Góra", "Dół" aby wybrać połoŜenie z
którego ma zostać usunięty protokół .
• Naciśnij klawisz "Delete". Na ekranie pojawi się ekran ostrzegawczy pytający Cię o to czy
chcesz usunąć wybrany protokół ( Rysunek 3.22 ). Domyślnym wyborem będzie decyzja o
nie kasowaniu protokołu.
• Jeśli nie chcesz aby dany protokół został usunięty, naciśnij jeden z klawiszy "Back", "Enter"
aby powrócić do poprzedniego ekranu protokołu .
• Aby usunąć protokół, przyciśnij strzałkę "Lewo" aby wybrać napis "Yes" , następnie naciśnij
klawisz "Enter" dla potwierdzenia swojej decyzji . W tym momencie zostanie usunięta nazwa
protokołu jak i wszystkie parametry zapisane w tym protokole . Program powróci do ekranu
protokołów uŜytkownika z wybranym ale usuniętym protokołem uŜytkownika .
34
Ekran ostrzegawczy: usuwanie protokołu
Rys. 3.22 Ekran ostrzegawczy: usuwanie protokołu .
Aby usunąć nazwę uŜytkownika postępuj w następujący sposób :
• Podczas działania ekranu katalogu uŜytkownika na wyświetlaczu LCD, naciskaj strzałki
"Góra", "Dół" albo uŜywaj klawiatury alfanumerycznej aby wybrać nazwę , która ma zostać
usunięta. UŜywaj strzałek "Lewo", "Prawo" aby przełączać pomiędzy dwoma ekranami
katalogu uŜytkownika.
• Naciśnij klawisz "Delete". Jeśli w danych nazwy uŜytkownika nie będzie Ŝadnego protokołu
to pojawi się ekran ostrzegawczy z pytaniem czy chcesz usunąć wybraną nazwę
uŜytkownika ( Rysunek 3.23 ). Brak wyboru będzie jednoznaczny z odpowiedzią "Nie" .
• Jeśli nie chcesz usunąć zaznaczonych danych naciśnij "Enter". Program automatycznie
powróci do ekranu katalogu uŜytkownika.
• Aby usunąć nazwę uŜytkownika, naciśnij strzałkę "Lewo", aby wybrać "Yes", następnie
naciśnij klawisz "Enter". Program powróci do katalogu uŜytkownika z wybraną, usuniętą
nazwą uŜytkownika.
• JeŜeli w danych nazwy uŜytkownika znajdują się protokoły, pojawi się następujący
komunikat: "All User Protocols under this name must be deleted before this user name can
be deleted "( Wszystkie protokoły uŜytkownika znajdujące się powyŜej tej nazwy muszą
zostać usunięte jeŜeli chcesz wymazać daną nazwę uŜytkownika ). Przestrzegaj powyŜej
wymienionych kroków przy usuwaniu protokołów uŜytkownika.
Ekran ostrzegawczy : usuwanie nazwy
3.23. Ekran ostrzegawczy : usuwanie nazwy .
3.5.6 Zmienianie nazwy uŜytkownika lub protokołu
35
Zmienianie nazwy uŜytkownika albo protokółu przeprowadź w następujący sposób:
• Aby z ekranu katalogu uŜytkownika albo odpowiednio z ekranu protokołu uŜytkownika
przemianować protokół uŜytkownika lub nazwę uŜytkownika, musisz je wybrać spośród
ekranów katalogu uŜytkownika bądź ekranu protokół uŜytkownika .
• Naciśnij klawisz "Clear" . Pojawi się komunikat alarmowy pytający się czy będziesz chciał
zmienić wybraną nazwę ( Rysunek 3.24 ). Brak wyboru będzie jednoznaczny z odpowiedzią
"Nie".
• Jeśli nie chcesz zmieniać nazwy, naciśnij przycisk "Enter". Program powróci odpowiednio
albo do ekranu katalogu uŜytkownika albo do ekranu protokołów uŜytkownika.
• Aby zmienić nazwę, naciśnij strzałkę "Lewo". Zostanie wybrana komenda "Yes", którą
potwierdź przyciskając klawisz "Enter". Pojawi się poprzedni ekran ale z kursorem
umieszczonym w pustej luce. UŜywaj klawiatury alfa-numerycznej, aby wpisać w lukę
odpowiednią nazwę. Nowa nazwa moŜe mieć do dziesięciu znaków. Skorzystaj z klawisza
Shift aby przełączać pomiędzy wpisami alfabetycznymi a numerycznymi. Naciśnij przycisk
"Save" kiedy ukończysz zapis. Nowa nazwa została zapisana.
Ekran ostrzegawczy : zmienianie nazwy
Rys. 3.24 Ekran ostrzegawczy: zmienianie nazwy.
3.6
Ostatni impuls
Podczas działania głównego ekranu ( Rysunek 3.2 ), naciśnij klawisz 6 albo uŜyj strzałek
"Góra", "Dół" aby wybrać "Last pulse", następnie naciśnij klawisz "Enter" aby wyświetlił się
ekran szczegółowego protokołu, pokazujący ostatni dostarczony impuls. Jest to takŜe
moŜliwe w sytuacji kiedy Gene Pulser Xcell został wyłączony i ponownie włączony .
3.7
Optymalizowanie operacji
Tryb optymalizowania pozwala uŜytkownikowi zaprogramować, poprzez przytrzymywanie
strzałek "Lewo" bądź w "Prawo", stopniowy wzrost lub spadek napięcia. Tryb ten działa w
podobny sposób jak protokoły manualne (ręczne) ( Rozdział 3.3.2 , 3.3.3 i 3.3.4 ), ale
wymaga aby wzrost napięcia był określony.
• Wejdź do tego ekranu z wyświetlacza głównego ( Rysunek 3.2 ) poprzez naciśnięcie
klawisza 7 albo uŜywanie strzałek "Góra", "Dół" do podświetlenia "Optimize", następnie dla
potwierdzenia naciśnij przycisk "Enter". Pojawi się ekran metod ( Rysunek 3.17 ).
• Naciskaj przyciski 1-3 lub uŜywaj strzałek "Góra", "Dół", aby podświetlić numer
odpowiadającemu optymalizowanemu napięciu dostarczonemu przez (i) impuls
wykładniczego rozpadu ( protokół wykładniczy ), (ii) impuls wykładniczego rozpadu z
określoną stałą wartością czasu ( protokół stałego czasu ) , albo (iii) impuls kwadratowej fali (
protokół fali kwadratowej ). Naciśnij klawisz "Enter" aby potwierdzić swój wybór i aby pokazał
się odpowiedni ekran optymalizowania.
36
Wybieranie ekranu metody
Rys. 3.17 Ekran wybierania metody .
• Kiedy zostanie wybrany protokół wykładniczy "Exponential protocol", pojawi się ekran
optymalizowania impulsu wykładniczego rozpadu ( Rysunek 3.25 ).
• Kiedy zostanie wybrany protokół stałej wartości czasu (Time constant protocol ), pojawi się
ekran optymalizowania protokołu dla stałej wartości czasu ( Rysunek 3.26).
• Kiedy zostanie wybrany protokół kwadratowej fali ( Square wave protocol ), pojawi się
ekran optymalizowania protokołu kwadratowej fali ( Rysunek 3.27).
Ekran optymalizowania protokołu wykładniczego rozpadu
Rys. 3.25 Ekran optymalizowania protokołu wykładniczego rozpadu
Ekran optymalizowania protokołu dla stałej wartości czasu
Rys. 3.26 Ekran optymalizowania protokołu dla stałej wartości czasu
37
Ekran optymalizowania protokołu kwadratowej fali
Rys. 3.27 Ekran optymalizowania protokołu kwadratowej fali
UŜywaj strzałek "Góra" , "Dół" aby przewijać pomiędzy miejscami na wartości parametrów.
Kiedy odpowiednia wartość parametru zostanie podświetlona , uŜyj klawiatury alfanumerycznej do wprowadzenia poŜądanej wartości ( pamiętaj Ŝe dopuszczalne są tylko
wpisy o charakterze numerycznym ). Ewentualnie , uŜywaj strzałek "Lewo" , "Prawo" aby
stopniowo zmniejszyć lub zwiększyć wartość danego parametru . UŜyj przycisków "Delete"
lub "Clear" aby zmienić wartość . Kiedy wartość parametru zostanie juŜ określona , dla
potwierdzenia naciśnij przycisk "Enter" . jeŜeli wprowadzona wartość będzie przekraczała
limity określone dla Gene Pulser Xcell to zostanie ona domyślnie zmieniona na najbliŜszą
wartość dozwoloną .
• kiedy niezbędne wartości parametrów zostaną określone , pojawi się migające "P" i
odpowiednim miejscu w prawym , dolnym miejscu wyświetlacza LCD . Znak ten wskazuje na
aktywność przycisku "Pulse" i na to , Ŝe impuls moŜe być juŜ dostarczony .
• Aby uŜyć programu :
• Naciśnij przycisk "Pulse", aby dostarczyć próbce impulsu o określonym parametrze
napięcia.
• Po dostarczeniu impulsu, zostanie wyświetlony ekran wyników protokołu ; uŜywaj strzałek
"Lewo" , "Prawo" aby przełączać pomiędzy ekranem wyników protokołu i ostatnim ekranem
szczegółowego protokołu .
• Podczas działania ekranu szczegółowego protokołu, moŜna dostarczyć kolejny impuls, przy
tym samym napięciu, poprzez naciśnięcie klawisza "Pulse". Naciśnij klawisz "Enter"
sprowadzić kursor na ekran; kursor pojawi się na prawym znaku pierwszego parametru
(napięcie). Aby zwiększyć wartość napięcia o określony przyrost jego wartości, naciśnij
strzałkę "Prawo" ; aby zmniejszyć parametr napięcia o określoną wartość, naciśnij strzałkę
"Lewo" naciśnij przycisk "Pulse" aby dostarczyć kolejny impuls .
3.8
Zarządzanie danymi
Ta część programu daje uŜytkownikowi wgląd do wartości parametrów i danych wyjściowych
ze stu ostatnich impulsów. Dane dla kaŜdego parametru z osobna są zapisane na
pojedynczym ekranie; przykłady są dane poniŜej. Poszczególne dane zawierają datę i czas
wysłania impulsu , identyfikator jak impuls został zaprogramowany, ustawione parametry i
dostarczony impuls . Impulsy są pokazywane w porządku chronologicznym bądź w odwrotny
sposób, są one rejestrowane według czasu i daty. ( Sprawdź to, data i czas są ustawione
według preferencji uŜytkownika). Jeśli zostanie wybrany porządek chronologiczny to
pierwszym impulsem zarejestrowanym w bazie danych będzie najwcześniejszy impuls z
określonego czasu. Dane te są jedynie do odczytu, nie są dopuszczalne Ŝadne ewentualne
zmiany .
38
• Podczas działania ekranu ( Rysunek 3.2 ) naciśnij przycisk 8 albo uŜywaj strzałek "Góra”,
"Dół" aby podświetlić "Data Management", następnie naciśnij "Enter" aby wyświetlił się ekran
zarządzania danymi ( Rysunek 3.28) .
• Przyciśnij przycisk 1-4 , wtedy naciśnij klawisz "Enter" aby wybrać dane, które mają zostać
wyświetlone. Wybranie przycisków 3 lub 4 spowoduje przywołanie ekranu danych (Rysunek
3.29). UŜyj klawiatury pomocniczej do wprowadzenia daty, potem dla potwierdzenia naciśnij
przycisk "Enter" aby wybrać tę datę i aby dane zostały wyświetlone. JeŜeli Ŝadne dane nie
zostały przyporządkowane do tej daty, to pojawi się ekran z informacją, Ŝe Ŝadne dane nie
znajdują się pod wprowadzoną datą .
Ekran zarządzania danymi
Rys. 3.28 Ekran zarządzania danymi .
Ekran daty
ZauwaŜ: ekran domyślny ma domyślnie ustawiony zegar na MM/DD/YY (MM/DD/RR), jeŜeli
uŜytkownik zmieni ustawienie zegara na DD/MM/YY (DD/MM/YY), to zegar będzie miał
kolejność dzień, miesiąc, rok.
Rys. 3.29 Ekran daty.
• Naciskaj strzałki "Lewo", "Prawo" aby pokazywały się odpowiednio wcześniejsze i
późniejsze dane impulsu. Naciśnij klawisz "Back" aby powrócić do ekranu zarządzania
danymi. Ekran ten będzie zawierał następujące informacje :
Line 1: Date and Time
Linia 1: Data i czas
Line 2: Identification of how pulse was programmed (e.g., Manual, Pre-set, User)
Linia 2: Zidentyfikowanie, który impuls został zaprogramowany ( np. manualny , nastawiony,
uŜytkownika )
Line 3: Type of pulse
Linia 3:Rodzaj impulsu
39
Lines 4–8: Pulse conditions
Linia 4: Warunki dostarczenia impulsu
Będą tu przedstawione przykłady ekranów danych. Nie jest moŜliwe aby zredagować ekran
danych.
Ekran danych ( protokół uŜytkownika , fala kwadratowa )
Ekran danych ( tryb manualny , wykładniczy rozpad )
Ekran danych (tryb manualny , stała wartość czasu )
Ekran danych (protokół standardowy, ustawienia S. Pombe )
40
Rys. 3.30. Przykładowe ekrany danych.
3.9
Pomiary
Program ten pozwala uŜytkownikowi na wcześniejsze zmierzenie oporności próbki przed
dostarczaniem impulsów przez Gene Pulser Xcell oraz na zmierzenie wartości pojemności
elektrycznej dla kondensatora zawartego w Capacitace Extender. Urządzenie to jest
dołączone.
• Podczas działania ekranu głównego, naciśnij klawisz 9 albo uŜywaj strzałek "Góra", "Dół"
aby podświetlić "Measurements", następnie naciśnij przycisk "Enter" aby pokazał się ekran
pomiarów ( Rysunek 3.31 ) .
Ekran pomiarów
Rys. 3.31 Ekran pomiarów .
3.9.1 Pomiary oporności próbki
Umieszczenie kuwety zawierającej próbkę w komorze wstrząsowej (ShockPod) pozwoli na
przeprowadzenie pomiaru oporu próbki. Pomiar oporu moŜna przeprowadzić dla próbek,
których opór mieści się w przedziale od 5 do 1100 ohmów. Dla próbek, których opór jest
mniejszy od 5-ciu ohmów, pomiar będzie zawsze równy "5 ohmów", co będzie zresztą
wyświetlone na ekranie. Zaś dla próbek, których opór jest większy niŜ 1100 ohmów, na
ekranie pojawi się ">1100 ohmów".
• Gdy zostanie wybrany ekran pomiarów ( Rysunek 3.31 ), na wyświetlaczu pojawi się numer
1, odpowiadający podświetlonemu komunikatowi "Sample Resistance" jako wybór domyślny.
Naciśnij klawisz "Enter", aby pokazał się ekran wyświetlający oporność próbki. JeŜeli numer
1 nie jest podświetlony na ekranie pomiarów, naciśnij przycisk 1 lub uŜywaj strzałek "Góra",
"Dół" aby podświetlić 1, a następnie naciśnij przycisk "Enter", aby potwierdzić swój wybór. Na
wyświetlaczu LCD pojawi się ekran oporności próbki ( Rysunek 3.32 ).
41
Ekran oporu próbki
Rys. 3.32 Ekran oporu próbki.
• Umieść próbkę pomiędzy elektrodami aby pozwolić Gene Pulser Xcell na monitorowanie
oporu próbki. Zamknij wieko komory wstrząsowej i naciśnij przycisk "Enter". W tym
momencie na wyświetlaczu LCD będzie pokazywany przebieg badania oporności. Skala
pomiaru wynosi od 5-1100 ohmów.
3.9.2 Kalibrowanie i pomiar kondensatorów w module CE
PoniewaŜ kondensatory elektryczne zmieniają swoją wartość bardzo powoli, staraj się
utrzymać fabryczne ustawienia. Kondensatory powinny być kalibrowane najlepiej co miesiąc
ale dopuszcza się nawet robienie tego co trzy miesiące lub wtedy gdy jest obawa, Ŝe
kondensatory działają niepoprawnie. Funkcja pomiaru daje uŜytkownikowi moŜliwość
bardziej dokładnego określenia wartości pojemności kondensatora, przez dokonywanie
pomiaru w jednostkach pojemności (faradach F). Funkcja ustawienia i pomiaru kondensatora
moŜe być przeprowadzone w następujący sposób :
• Odłącz przewody elektryczne komory wstrząsowej z Gene Pulser Xcell. Podłącz moduł CE
do Gene Pulser Xcell.
• Podczas działania ekranu pomiarów naciśnij klawisz 2 albo uŜyj strzałek "Góra", "Dół" do
podświetlenia "Capacitator", a następnie naciśnij klawisz "Enter", aby pokazał się ekran
pomiarowy pojemności kondensatora ( Rysunek 3.33 ).
• Aby skalibrować kondensator, naciśnij na klawiaturze alfa-numerycznej przecinek ( , ).
Główna jednostka Gene Pulser Xcell rozpocznie kalibrowanie kondensatorów znajdujących
się w dwóch modułach CE i w jednostki głównej. Kalibrowanie będzie trwało około dwóch
minut. Po zakończeniu testu na górze ekranu wyświetli się dwanaście cyfr. Liczby znajdujące
się w pierwszym rzędzie oraz w dwóch niŜszych są aktualnymi wartościami pojemności
kondensatorów w module CE. Kondensatory w połączeniu równoległym są uŜywane do
ustawiania pojemności elektrycznej w trybach wykładniczego rozpadu oraz trybie pomiaru
stałej wartości czasu. W trybie ustawienia fali kwadratowej podczas wysyłania impulsów
uŜywane jest niskie napięcie, wtedy to są uŜywane wszystkie kondensatory z modułu CE;
przy wysokim napięciu uŜywanym podczas wysyłania impulsów w trybie pomiaru przy uŜyciu
fali kwadratowej, uŜywa się kondensatora µF znajdującego się w jednostce głównej Gene
Pulser Xcell .
• Aby dokładnie zmierzyć pojemność elektryczną, podczas działania ekranu pomiaru
kondensatora Capacitor Meaasurement na wyświetlaczu LCD, uŜywaj klawiatury alfanumerycznej aby wprowadzić wartość pojemności elektrycznej, która ma być zmierzona.
Ewentualnie, uŜywaj strzałek "Prawo", "Lewo" aby odpowiednio zwiększy lub zmniejszyć
wartość pojemności elektrycznej. Naciśnij klawisz "Enter", aby potwierdzi a później przycisk
"Pulse".
Aktualna wartość pojemności elektrycznej pojawi się w linii zmierzonej pojemności
elektrycznej. (Podczas tego procesu próbka nie powinna znajdować się na swoim miejscu w
komorze elektroporacyjnej i Ŝaden impuls nie powinien na nią działać.)
42
Ekran pomiarów kondensatora
Rys. 3.33. Ekran pomiarów kondensatora.
3.10 Preferencje uŜytkownika
• Podczas działania głównego ekranu naciśnij przycisk 10 albo uŜywaj strzałek "Góra", "Dół"
aby podświetlić "User preferences", następnie naciśnij klawisz "Enter" aby wyświetlił się
ekran preferencji uŜytkownika ( Rysunek 3.34 ).
Ekran preferencji uŜytkownika
Rys. 3.34 Ekran preferencji uŜytkownika .
3.10.1 Nastawianie zegara
Ta część programu zezwala uŜytkownikowi na wybieranie sposobu w jaki zegar będzie
wyświetlany, oraz wprowadzenie poprawnej daty i poprawnego czasu. Domyślnymi
ustawieniami dla daty jest Miesiąc/Data/Rok, takie ustawienie moŜe być zmienione na
ustawienie Data/Miesiąc/Rok . Zegar ma formę dwudziesto-cztero godzinną .
• Gdy zostanie wybrany ekran preferencji uŜytkownika ( Rysunek 3.34 ), numer 1 będzie
podświetlony i będzie on odpowiadał domyślnie podświetlonemu napisowi "Clock". Naciśnij
klawisz "Enter" aby pokazał się ustawiania zegara. JeŜeli numer 1 nie jest podświetlony na
ekranie preferencji uŜytkownika to naciśnij klawisz 1 albo uŜywaj strzałek "Góra", "Dół" aby
podświetlić numer 1. Następnie naciśnij przycisk "Enter", aby potwierdzić swój wybór. Pojawi
się ekran ustawiania zegara ( Rysunek 3.35 ).
Ekran nastawiania zegara
43
ZauwaŜ Ŝe domyślnym ustawieniem zegara jest MM/DD/YY (MM/DD/RR).
Rys. 3.35 Ekran nastawiania zegara.
• Naciśnij strzałki "Lewo", "Prawo", aby przełączać pomiędzy formatami zegara: MM/DD/YY a
DD/MM/YY. Naciśnij przycisk "Enter" aby potwierdzić swój wybór i aby sprowadzić kursor do
pola znajdującego się poniŜej , gdzie mogą zostać dokonane wpisy .
• Jeśli nie ma potrzeby zmieniania daty, naciśnij klawisz "Enter" ponownie. UŜyj
wydzielonego bloku klawiszy aby wprowadzić poprawną datę i godzinę ( pamiętaj o tym, Ŝe
dozwolone są jedynie opisy o charakterze numerycznym ). "0" musi być wpisane do
wszystkich pól, łącznie z liczbami 1-9 ( np. 01-09 ). UŜyj przycisków "Delete", "Clear", aby
skorygować dokonanych wpisów. Naciśnij klawisz "Enter" kiedy ukończysz wpisywanie lub
poprawianie dokonanych wpisów. Następnie, kursor ustawi się w polu ustawiania nowego
czasu (XX:XX).
• Jeśli nie potrzeba zmieniać ustawień czasu, naciśnij przycisk "Save". W innym przypadku,
gdy potrzeba zmienić ustawienie czasu, uŜyj klawiatury alfa-numerycznej aby wprowadzić
nową wartość czasu. Zegar ma format dwudziesto cztero godzinny. Po zakończeniu naciśnij
przycisk "Save", wtedy automatycznie powrócisz do ekranu preferencji uŜytkownika.
3.10.2 Ustawianie intensywności ekranu
• Podczas działania ekranu preferencji uŜytkownika naciśnij klawisz 2 albo uŜywaj strzałek
"Góra", "Dół" aby wybrać "Screen intensity", następnie dla potwierdzenia naciśnij przycisk
"Enter". Pojawi się ekran jaskrawości (Brightness) (Rysunek 3.36).
Ekran ustawiania jaskrawości wyświetlacza LCD
Rys. 3.36 Ekran ustawiania jaskrawości wyświetlacza LCD .
• Naciskaj strzałki "Góra" , "Dół" aby stopniowo zwiększyć lub zmniejszyć jaskrawość ekranu.
44
• Naciśnij przycisk "Enter" aby potwierdzić swój wybór. Wyświetlacz LCD powróci do ekranu
preferencji uŜytkownika.
3.10.3 Ustawianie funkcji snu
Funkcja snu jest trybem oszczędzania energii uŜywanej we wszelakich operacjach. Ma to na
celu wydłuŜenie Ŝywotności uŜywanych baterii i wyświetlacza LCD. Według ustawień
domyślnych wyświetlacz LCD wyłącza się gdy Gene Pulser Xcell nie jest uŜywany przez 30
minut. Naciśnięcie dowolnego klawisza klawiatury alfa-numerycznej, spowoduje powrót do
ostatnio wyświetlanego ekranu i operacji dokonywanej na Gene Pulser Xcell. UŜytkownik
moŜe zmienić ustawienia czasu przed tym jak urządzenie wejdzie w tryb snu uŜywając
ustawień funkcji snu.
LCD BRIGHTNESS ( jaskrawość wyświetlacza LCD )
Press UP/DOWN arrow keys to change the brightness of the LCD display.
( naciskaj strzałki "Góra" , "Dół" aby zmienić jaskrawość wyświetlacza LCD )
Press ENTER to select.
( Naciśnij klawisz "Enter" aby potwierdzić swój wybór )
• Podczas działania aparatu naciśnij przycisk 3 albo uŜywaj strzałek "Góra", "Dół" aby
podświetlić "Sleep function", następnie naciśnij klawisz "Enter" aby potwierdzić swój wybór i
aby wyświetlony został ekran funkcji czuwania sleep ( Rysunek 3.37 ).
Ekran funkcji czuwania
Rys. 3.37. Ekran funkcji czuwania
• UŜywaj strzałek "Prawo", "Lewo" aby zmieniać ustawienia czasu przed wejściem
wyświetlacza LCD do trybu czuwania.
• Naciśnij klawisz "Enter" aby potwierdzić swój wybór. Wyświetlacz LCD powróci do ekranu
preferencji uŜytkownika.
3.11 System Pulse Trac™
Gene Xcell Pulser uŜywa systemu Pulse Trac waveform delivery jest to system do
generowania najlepiej dobranych impulsów wykładniczego rozkładu dla optymalnego
przekształcenia komórki. System Pulse Trac dokładnie wylicza stałą wartość czasu i
amplitudę kaŜdego impulsu, bazując na impulsach aktualnie dostarczanych do próbki.
JednakŜe, funkcją o większym znaczeniu Pulse Track System jest kompensowanie zmian
amplitudy, spowodowane róŜną opornością próbek i wzrostem dokładności pomiaru
pojemności kondensatorów o niskim napięciu. Program ten zapewnia:
• Pomiar przewodności właściwej zintegrowanej z wysyłanym impulsem dla prawdziwych
form fali dostarczanej dla próbki, której oporność mieści się w przedziale od 10 do 1000
ohmów;
45
• Wewnętrzne strojenie i program zapewniający cyrkulacyjne monitorowanie dla właśnie
dostarczanego impulsu w ciągu całego okresu działania tego urządzenia ;
• Pomiary stałej czasowej oraz amplitudy napięcia, aby moŜna było zweryfikować
dostarczanie impulsów.
3.11.1 Opis systemu Trac System
System Pulse Trac monitoruje i reguluje dla wewnętrznego systemu odporności uŜywanego
do limitowania natęŜenia prądu i oporności próbki znajdującej się w kuwecie. Opornośćr
próbki zaleŜy od jej przewodności właściwej, odległości pomiędzy elektrodami w kuwecie i
objętości roztworów badanych wewnątrz kuwety. Pulse Track cyrkulacyjnie monitoruje
oporność próbki i dostarcza poŜądane napięcie pomimo objętości próbki i jej przewodności
właściwej. Gdy optymalizujesz przeprowadzanie elektroporacji za pomocą Pulse Trac
system, powstałe róŜnice elektryczne są kontrolowane z wymagającą tego precyzją po to
aby otrzymane wyniki odzwierciedlały w danym doświadczeniu tylko zmienne biologiczne.
Diagnostyczny algorytm Pulse Trac bada, czy cykl elektryczny był kompletny. Dodatkowo
przeprowadza on elektroniczny dobór właściwego połączenia kondensatorów aby dostarczyć
najdokładniejszy i powtarzalny impuls dla optymalnego i ciągłego przeprowadzania
elektroporacji przez cały okres uŜytkowania Gene Pulser Xcell.
3.11.2 Diagnostyczny algorytm Pulse Track
Ten testowy algorytm sprawdza i wybiera optymalny cykl kondensatora Gene Pulser Xcell i
modułu CE w zakresie 25–3,275 µF. Moduł CE jest bardzo częścią urządzenia zawierającą
kondensatory uŜywane przy podawaniu niskiego napięcia / wysokiej pojemności elektrycznej
precyzyjne dostarczanego impulsu. Test algorytmu zwęŜa juŜ rygorystyczną tolerancję
kondensatora od ±20% do ±10% (inne projekty mogą mieć niezgodność kondensatora
najwyŜej na poziomie ±40%) przy rozpiętości 200–1075 µF. Wysokie napięcie
kondensatorów znajdujących się w Gene Pulser Xcell nie jest uznawane przez system
dopóki nie nastawi się tolerancję napięcia na 10%, czyli tyle na ile pozwala ten test
argumentu.
Test algorytmu Pulse Trac jest uruchamiany kiedy moduł Capacitator Extender jest
instalowany.
46
Rozdział 4 Ogólny zarys teorii elektroporacji
Elektroporacja jest procesem fizycznym, w którym komórki są poddawane działaniu pola
elektrycznego o wysokiej wartości napięcia elektrycznego, co powoduje chwilowe zmiany w
organizacji błony komórkowej. W efekcie, znacznie zwiększa się przepuszczalność błony
komórkowej, dzięki czemu do cytoplazmy komórkowej mogą przedostawać się roztwory ze
środowiska zewnątrzkomórkowego, a wraz z nimi kwasy nukleinowe, białka, węglowodany
oraz małe cząsteczki. ChociaŜ wiele pracy włoŜono w określenie, w jaki sposób podczas
procesu elektroporacji komórka staje się przepuszczalna, zmiany zachodzące w błonie
komórkowej są niewyjaśnione, a proces elektroporacji ciągle pozostaje w sferze
hipotetycznych wyjaśnień ( zobacz Chang, i inni., 1992).
Gen Pulser Xcell jest instrumentem zdolnym do dostarczania zarówno impulsów o
rozkładzie wykładniczym, jak i impulsów o kwadratowym charakterze fali (Rysunek 4.1).
System składa się z generatora impulsu (jednostki głównej z jednym albo dwoma modułami
CE i PC), komorą wstrząsową (ShockPod) i kuwetą zawierającą elektrody (zobacz Rozdział
2). Aktywowanie klawisza "Pulse" znajdującego się na Gene Pulser Xcell spowoduje
naładowanie się kondensatorów znajdujących się w jednostce głównej oraz w module CE jeśli tylko jest on dołączony do wysokiego napięcia; następnie urządzenie spowoduje
rozładowanie kondensatorów przekazując impuls elektryczny do próbki umieszczonej w
kuwecie. Wyładowywanie naładowanego kondensatora wytworzy albo impuls o rozkładzie
wykładniczym albo impuls fali kwadratowej.
Dwa parametry fizyczne opisują zmiany, którym jest poddawana komórka podczas
elektroporacji. Pierwszym z nich jest natęŜenie pola elektrycznego E, mierzone w voltach/cm.
NatęŜenie pola elektrycznego E opisuje otoczenie elektryczne w komorze elektroporacyjnej.
Elektrody standardowo uŜywane w elektroporacji składają się z dwóch równoległych płyt
oddalonych od siebie o odległość d (cm); dlatego,
E = V / d,
gdzie V jest zastosowanym napięciem prądu elektrycznego, a d jest odległością pomiędzy
elektrodami. W praktyce, natęŜenie pola jest regulowane przez zmianę przykładanego
napięcia prądu elektrycznego albo przez zmianę odległości pomiędzy elektrodami. PoniewaŜ
przewodnictwo elektryczne cytoplazmy komórkowej jest znacznie wyŜsze niŜ przewodnictwo
samej błony komórkowej, umieszczenie komórki w polu elektrycznym spowoduje powstanie
róŜnicy potencjałów na błonie komórkowej.
W miarę wzrostu wartości natęŜenia pola elektrycznego następuje wzrost róŜnicy
potencjałów przez błonę komórkową, co powoduje wytworzenie porowatości błony, a nawet
moŜe doprowadzić do zniszczenia dwuwarstwy lipidowej. Poprzez wytworzone w
dwuwarstwie pory, drobne molekuły mogą przedostawać się do wnętrza komórki z jej
zewnętrznego środowiska (Hui, 1995; Neumann, i inni, 2000).
Drugim parametrem fizycznym, który wpływa na zachowanie komórki jest czas, podczas
którego komórka jest wystawiona na działanie pola elektrycznego. Dla impulsów o rozkładzie
wykładniczym czas jest kontrolowany przez pojemność elektryczną urządzenia oraz przez
oporność wewnątrz obwodu. Dla impulsów o kwadratowym rozkładzie fali, długość impulsu
jest bezpośrednio kontrolowana przez ustawienia czasu, w jakim komórki będą poddane
działaniu pola elektrycznego. KaŜdy z wymienionych rozkładów fali będzie opisany poniŜej.
47
4.1 Impulsy o rozkładzie wykładniczym
Obwód o rozkładzie wykładniczym Gene Pulser Xcell generuje impulsy poprzez
rozładowywanie kondensatora. W momencie, gdy kondensator jest rozładowywany do
próbki, napięcie (róŜnica potencjałów) pomiędzy elektrodami gwałtownie wzrasta, aŜ do
osiągnięcia szczytowej wartości, a następnie zmniejsza się w czasie, t, zgodnie z rozkładem
ekspotencjalnym (Rysunek 4.1 A) i następującym równaniem:
Vt = V0 [e-(t/RC)],
gdzie, V0 jest początkową wartością napięcia na kondensatorze, Vt jest napięcie po czasie =
t (ms) pulsu, e jest podstawą logarytmu naturalnego, R jest opornością obwodu (wyraŜoną w
omach Ω), C jest pojemnością kondensatora (wyraŜoną w mikrofaradach µF). Czas
wymagany do tego, aby początkowe napięcie zmieniło się o V0/e jest wyraŜony w postaci
stałej czasowej τ, jako wygodny sposób opisania długości trwania pulsu (wyraŜony w msec).
W momencie, gdy t = τ = R x C, napięcie osiągnie wartość równą 1/e (∼37%) początkowej
wartości, V0 (Vt = V0 / e).
Wartość stałej czasowej moŜe być zmieniana poprzez zmiany pojemności w aparacie lub
poprzez zmiany oporności obwodu. Jeśli korzysta się z modułu PC, który kontroluje
oporność obwodu poprzez umieszczenie oporników równolegle do mierzonej próbki naleŜy
stosować roztwory o wysokiej oporności (np. roztwory słabej jonowej rozciągłości dla
większości bakterii i droŜdŜy). Dla oporników połączonych równolegle, całkowity opór
obwodu moŜe być obliczany z równania:
RT = (Rpróbki * RPC) / (Rpróbki + RPC).
Jeśli oporność próbki jest znacznie większa niŜ oporności zastosowanej w module PC (Rpróbki
>> RPC), ta druga wartość jest określona przez oporność obwodu i RT ∼ RPC. Dlatego Moduł
PC redukuje oporność obwodu, a przez to stałą czasową obwodu.
Jeśli zastosowano roztwory o niskiej oporności (np. roztwory o wysokim stopniu rozciągłości
jonowej, jak PBS lub roztwory uŜywane do wzrostu większości komórek ssaczych) wartość
stałej czasowej moŜe być w prosty sposób zmieniana poprzez dobór właściwego
kondensatora w obwodzie przy zastosowaniu jednostki CE. Dodatkowo, zmieniając objętość
roztworu (o niskiej oporności) w kuwecie moŜna wywoływać zmiany oporności obwodu
(oporność jest odwrotnie proporcjonalna do objętości).
4.2 Impulsy fali o rozkładzie kwadratowym
Poprzez ścięcie wierzchołka impulsu pochodzącego z kondensatora po jego rozładowaniu
do próbki generowany jest impuls fali kwadratowej. Idealny impuls o rozkładzie kwadratowym
posiada taką samą wartość napięcia na początku jak i na końcu trwania pulsu. (Rysunek 4.1
B). JednakŜe zastosowanie naładowanych kondensatorów do wytwarzania tego rodzaju
rozkładu fali (jak to jest rozwiązane w komercyjnie dostępnych aparatach do elektroporacji)
powoduje, Ŝe napięcie pod koniec pulsu Vt, zawsze jest niŜsze niŜ napięcie na początku
pulasu V0. Dzieje się tak dlatego, Ŝe w momencie osiągania stanu, w którym kondensator
jest naładowany przez obwód przepływa prąd o maksymalnym natęŜeniu, a następnie
stopniowo maleje do zera. Aby wygenerować impuls fali kwadratowej, puls jest ograniczany
po czasie t następującym po rozładowaniu kondensatora. Czas t określa długość pulsu. Przy
większej długości trwania impulsu, większa jest róŜnica pomiędzy napięciem na jego
początku i na końcu. Rozkład napięcia moŜe być obliczony z równania:
48
ln (V0 / Vt) = t / (R C).
Spadek napięcia, jaki moŜe pojawić się podczas impulsu fali o rozkładzie kwadratowym jest
odwrotnie proporcjonalny zarówno do pojemności aparatu jak i oporności próbki. Częściowa
zmiana napięcia w końcowej części impulsu jest funkcją początkowej wartości napięcia Vo i
jest określona równaniem:
Wielkość zmiany (droop) = (V0 – Vt) / V0.
Łącząc oba równania otrzymamy:
ln [1 / (1 – wielkość zmiany (droop))] = t / (R C).
W celu przedstawienia impulsu w postaci jak najbardziej zbliŜonej do postaci kwadratowej,
wielkość ta zmiany musi zostać zminimalizowana ( np. Vt = V0 i V0 – Vt = 0). Doświadczalnie
moŜe to zostać osiągnięte poprzez zastosowanie najwyŜszych wartości dla R i C. Dla kaŜdej
z próbek, R moŜe być traktowane jako wielkość stała. W aparacie Gene Pulser Xcell, dla
obwodów o wysokim napięciu jest zastosowany kondensator o pojemności 50 µF, natomiast
dla obwodów niskonapięciowych zastosowano kondensator o pojemności 3275 µF. Dla
kaŜdego z tych obwodów C moŜe równieŜ zostać określone jako stałe. Wtedy, dla tej samej
próbki, wraz z wydłuŜaniem czasu trwania impulsu, wielkość zmiany napięcia równieŜ rośnie.
Jednak, wzrost oporności próbki redukuje wielkość zmiany napięcia przy dowolnej długości
trwania impulsu. Wzrost oporności próbki moŜe zostać osiągnięte przez: (1) obniŜenie
temperatury próbki, (2) zmniejszenie stęŜenia jonowego roztworów, (3) zmniejszenie
objętości roztworu w kuwecie elektroporacyjnej zawierającej roztwory o niskiej oporności.
Nigdy nie naleŜy uŜywać modułu PC przy generowaniu impulsów o rozkładzie fali
kwadratowej poniewaŜ opornik zastosowany w tym module jest ustawiony równolegle w
stosunku do próbki i spowoduje wzrost wielkości zmiany napięcia (droop) pulsu. W tabeli 4.1
przedstawiono długość pulsu odpowiedniej wielkości zmiany (droop) jako funkcja oporności
w skalach wysokiego i niskiego napięcia. Na przykład, puls przy oporności 200 Ω - długość
impulsu wyniesie 0.510 msec z 5% wielkością zmiany (droop) w skali wysokiego napięcia, a
33.4 msec z 5% wielkością zmiany (droop) w skali niskiego napięcia.
Tabela 4.1
Wielkość zmiany (droop)związana z długością pulsu przy róŜnych opornościach próbki dla w
skali wysokiego napięcia, i skali niskiego napięcia, Gene Pulser Xcell.
Droop %
Obwód wysokiego napięcia
10
20
5
Obwód niskiego napięcia
10
20
Oporność
Próbki (Ω
Ω)
długość impulsu (msec)
długość impulsu (msec)
0.051
0.510
2.55
8.93
3.34
33.4
167
585
20
200
1000
3500
0.109
1.09
5.45
19.1
0.223
2.23
11.2
39.0
7.14
71.4
357
1249
14.6
146
730
2556
49
Rysunek 4.1. (A) Ekspotencjalny rozkład impulsu – rozładowywanie kondensatora. Kiedy
kondensator, naładowany do początkowej wartości V0, jest rozładowywany do komórki,
napięcie przykładane do komórek maleje w czasie w sposób ekspotencjalny i zgodnie z
równaniem: Vt = V0 [e-(t/RC)]. W szczególnym przypadku, gdy t = RC, wtedy Vt = V0 / e.
Wartość RC jest znana jako stała czasowa rozkładu napięcia. Jeśli stała czasowa ma
mniejszą wartość, wówczas rozkład napięcia w czasie jest szybszy. (B) Kwadratowy rozkład
fali systemu rozładowującego kondensator. Długość pulsu to czas, w jakim komórki są
poddawane rozładowywaniu. Podczas impulsu napięcie ponownie maleje w sposób
ekspotencjalny, dlatego końcowa wartość napięcia w pulsie jest niŜsza niŜ wartość
początkowa. Ten spadek napięcia jest nazywany „wielością zmiany” (droop) pulsu i jest
przedstawiana jako wartość procentowa wielkości napięcia początkowego przyłoŜonego
impulsu.
50
Rozdział 5 Czynniki wpływające na elektroporację:
Optymalizacja Elektroporacji
Warunki elektryczne dla elektroporacji komórek zostały zweryfikowane przez lata badań
(zobacz Shigekawa i Dower, 1988, Change, i inni, 1992 i Nickoloff, 1995a,b, w artykule
zamieszczono wiele protokołów do elektroporacji komórek pochodzących z róŜnorodnych
gatunków). W celu określenia optymalnych warunków elektroporacji poleca się następujące
artykuły: Calvin i Hanawalt, 1988, Dower, al et., 1988 (dla komórek bakteryjnych); Shillito, i
inni., 1985, Fromm, i inni., 1987, Dekeyser, i inni., 1990, Joersbo i Brunstedt, 1991 (dla
komórek roślinnych); Chu, i inni, 1987, Knutson i Yee, 1987, Andreason i Evans, 1989,
Anderson, i inni, 1989, i Heiser, 1999 (dla komórek świnki morskiej). Dla drobnoustrojów,
optymalne warunki elektro-transformacji otrzymuje się przy zastosowaniu impulsu o
rozkładzie wykładniczym z zachowaniem warunków elektrycznych podobnych do tych
uŜytych dla coli E. i cerevisiae S., (dwa gatunki najczęściej stosowane podczas badań tego
rodzaju). Warunki pulsu składają się z pojemności o niskich wartościach (krótkie trwanie
pulsu) przy wysokim napięciu. Dla coli E., optymalne warunki to takie, które powodują
wytworzenie pola ~ 18 kV / cm ze stałą czasową ~ 5 mili sekund (ms). Dla wielu innych
gatunków bakteryjnych, takich jak: Salmonella, Borrelia, Lactococcus i Enterococcus,
warunki dla elektroporacji są w ogólnym zarysie identyczne do tych uŜytych dla coli E.. Dla
wielu innych bakteryjnych gatunków, podwyŜszanie siły pola powoduje zwiększeniem
elektro-transformacji. Dla cerevisiae S., optymalne warunki to takie, które powodują
wytworzenie pola ~ 7.5 kV / cm ze stałą czasową ~ 5 mili sekund (ms). Podobne warunki są
równieŜ optymalne dla róŜnych gatunków droŜdŜy.
Efektywna elektroporacja protoplastów roślinnych następuje zarówno przy zastosowaniu
impulsów o niskiej pojemności i wysokim napięciu, jak i wysokiej pojemności (długi czas
trwania impulsu) i niskim napięciu. Typowe warunki elektroporacji to takie, gdzie stała
czasowa znajduje się w przedziale: 10 – 100 µs a wytworzone pole ~ 2.5 kV / cm lub stała
czasowa wynosi 2 - 5 mili sekund (ms), a wytworzone pole ~ 500 kV / cm.
Dla komórek ssaczych optymalne warunki elektroporacji otrzymano zarówno przy
zastosowaniu impulsów o rozkładzie wykładniczym, jak i o rozkładzie kwadratowym. Typowe
warunki przy zastosowaniu obu rodzajów impulsów określają długość impulsów lub stałą
czasową 10 – 40 s i pole 400 – 900 V/cm. Pole elektryczne w określonym zakresie jest
odwrotnie proporcjonalne do długości trwania impulsu albo stałej czasowej. Jeśli wartość
jednej z tych wielkości fizycznych zostanie powiększona to druga zostanie zmniejszona, tak,
aby utrzymać optymalne warunki elektroporacji. Dodatkowo, jeśli rozmiary komórek
powiększają się, maleje siła pola, w którym warunki elektroporacji określono jako optymalne.
Inne warunki, które są waŜne dla zmaksymalizowania efektywności elektroporacji są
dyskutowane w następnych rozdziałach.
5.1 Wzrost komórek
Odpowiednie dobranie warunków wzrostu komórek zaleŜy od ich typu. Podczas
przygotowywania hodowli komórek kompetentnych nowego gatunku najlepiej jest
zastosować warunki uŜyte juŜ wcześniej do tego samego rodzaju komórek. Sugestie dla
czynników, które muszą zostać wzięte pod uwagę podczas przygotowywania metody
wytwarzania komórek elektrokompetentnych są dyskutowane w artykułach przez Dower, i
inni (1992) oraz Trevors, i inni (1992). Dla większości komórek bakteryjnych, najwyŜsze
współczynniki efektywności transformacji są otrzymane wtedy, gdy komórki były zebrane we
wczesnej lub środkowej fazie wzrostu. Gdy komórki Coli E. osiągają fazę stadium
stacjonarnego, współczynnik efektywności transformacji odmawia precipitously (Dower,
1990). W przeciwieństwie, większość gatunków droŜdŜy jest zazwyczaj zbierana w
51
środkowej - do późnej – fazy wzrostu. Dla cerevisiae S., efektywność transformacji wzrasta
60 razy od wczesnej do późnej fazy wzrostu (Becker i Guarente, 1991). Dla komórek
ssaczych, najwyŜszy współczynnik elektroporacji otrzymuje się gdy komórki są w środkowym
stadium wzrostu (Anderson, al et., 1991).
5.2 DNA
ChociaŜ większość aplikacji opisuje w jaki sposób do komórek naleŜy wprowadzić plazmid
DNA, to przez elektroporację, do komórki moŜe zostać wprowadzony dowolny rodzaj
cząsteczki, włączając RNA, białka, węglowodany i małe cząsteczki, takie jak trójfosforany
nukleotydów i cząsteczki fluorescencyjne. Z małymi wyjątkami, najwyŜszą efektywność
transformacji otrzymuje się kiedy do komórki są wprowadzane kołowe plazmidy; jest to
słuszne dla drobnoustrojów, komórek roślinnych i komórek zwierzęcych.
Integracja plazmidu poddawanego elektroporacji z genomem gospodarza jest zazwyczaj
bardziej efektywna, jeśli do transformacji uŜywa się plazmidów liniowych, takich jak
wyizolowane stałe transformanty komórek ssaczych (Barsoum, 1995), albo badanie
homologicznych rekombinantów Candida (Thompson, i inni., 1998), Pichia (Cregg i Russell,
1998) i Tetrahymena (Gaertig i Gorovsky, 1995). Udowodniono, Ŝe u niektórych linii
komórkowych, dodanie nośnika, takiego jak DNA spermy łososia albo plazmidu powoduje
wzrost ekspresji genu (Chu, i inni., 1987; Showe, i inni 1990).
Transformacja większości typów komórek została dokonana za pomocą plazmidu, z którego
dokonywano izolacji DNA róŜnorodnymi metodami. Czystość plazmidu ma ogromny wpływ
na sprawność i jakość transformacji. Znacząco niŜszą efektywność transformacji osiąga się
przy uŜyciu nie oczyszczonego plazmidu DNA niŜ po zastosowaniu plazmidu, który został
wcześńiej oczyszczony. Plazmidy otrzymane przy uŜyciu matrycy Bio Rad Aurum są tak
skuteczne jak plazmidy oczyszczone CsCl – są one stosowane zarówno do transformacji
drobnoustrojów jak i komórek ssaczych. Tak długo, jak plazmidy będą otrzymywane i
podczyszczane w taki sam sposób, wszelkie zmiany w poziomie eksprasji będą wynikały z
róŜnic w transkrypcji albo translacji interesującego nas genu.
Pokoazano, Ŝe podczas elektroporacji mieszaniny ligandów dla coli E., komponenty
reakcyjne mają wpływ na transformację (Dower, 1990). Efektywność transformacji DNA
zancząco wzrasta po ogrzaniu mieszaniny ligandów (przy 65 ° C przez 15 min), po którym
następuje rozcieńczenie wodą (Willson i Gough, 1988), dializa (Heery i Dunican, 1989; i inni
Jacobs., 1990), albo strącanie etanolem (Böttger, 1988; Zabarovsky i Winberg, 1990).
5.3 Roztwory do elektroporacji
Wiele typów drobnoustrojów jest najskuteczniej transformowana w roztworach o wysokiej
oporności (opór > 3000 oma). Z tego powodu, przed poddaniem komórek elektroporacji
naleŜy je dokładnie przepłukać w celu usunięcia wszelkich śladów jonów obecnych w
roztworach wzrostowych. Niedokładne usunięcie z komórek roztworów wzrostowych moŜe
doprowadzić do zakrzywienia pola elektrycznego podczas elektroporacji przy wysokim
napięciu. Komórki powinny zostać przepłukane co najmniej trzy razy wodą albo roztworem
nie - jonowym, takim jak glukoza, glicerol, sacharoza, albo sorbitol. Dla wielu
drobnoustrojów, glicerol 10 – 15% jest bardzo dobrym roztworem elektroporacyjnym i poleca
się go jako substancję osłaniającą komórki podczas ich przechowywania.
Współczynnik sprawności transformacji wzrasta u gatunków bakteryjnych, zawierających
niskie (~ 1 mM) ilości MgCl2 w buforze elektroforetycznym. U niektórych bakterii jony
magnezu, Mg2+ prawdopodobnie uczestniczą w utrzymywaniu strukturalnej integralności
błony komórkowej. Na przykład, Pseudomonas aeruginosa jest bardzo wraŜliwy na
dwuwartościowe chelatory kationów; inkubowanie komórek w obecności EDTA destabilizuje
zewnętrzną błonę komórkową (Haque i Russell, 1974). W przypadku braku jonów Mg2+,
52
błona komórkowa nie będzie w stanie powrócić do struktury, którą posiadała przed
elektroporacją.
Rysunki 5.1 A i B pokazują wpływ stęŜenia kilku biologicznie waŜnych roztworów jonowych
na oporność próbki. ZauwaŜ Ŝe: (1) objętość roztworu w kuwecie ma znaczący wpływ na
oporność próbki — dla roztworów jonowych, oporność próbki jest odwrotnie proporcjonalna
do objętości roztworu w kuwecie; (2) oporność roztworu zawierającego dwuwartościowe jony
jest niŜsza niŜ roztworów zawierające to sam stęŜenie jonów jednowartościowych; i (3)
oporność roztworu buforowanego jest zaleŜna od jego pH.
Dodanie nawet małej ilości jonów o niskim stęŜeniu znacząco zmniejsza oporność roztworów
o wysokiej oporności i moŜe spowodować zakrzywienie pola elektrycznego. Sól pozostała po
strącaniu DNA w etanolu powinna zostać usunięta przez płukanie czy wymycie zawiesiny
DNA przed jej rozpuszczeniem w woda albo Tris - EDTA. Tabela 5.1 pokazuje dodanie
roztworu z plazmidem w 10 mM Tris, pH 8.0 – 1 mM EDTA, do wody zmniejsza oporność
próbki. Powinno to zostać wzięte pod uwagę gdy próbki baktryjne są poddawane
elektroporacji w roztworach o wysokiej oporności. DNA moŜe bezpośrednio zostać uŜyte z
reakcji enzymatycznej do transformacji, ale w doświadczeniach, w których będą podawane
wysokie napięcia, końcowe stęŜenie soli w próbce elektroporacyjnej powinno zostać
trzymane poniŜej ~ 5 meq.
5.4 Temperatura
Oczekuje się, Ŝe temperatura, w której komórki są utrzymane podczas procesu elektroporacji
ma wpływ na współczynnik sprawności tego procesu z kilku powodów. Po pierwsze,
poddawanie komórek działaniu impulsu elektrycznego powoduje ogrzewanie się próbki;
utrzymywanie komórek w niskiej temperaturze podczas pulsu mogłoby zmniejszyć wzrost
temperatury i przez to znacząco zwiększyć przeŜywalność komórek. Po drugie, podczas
procesu elektroporacji błona komórkowa poddawana jest przejściowym zmianom
konformacyjnym i w błonie komórki tworzone są pory; utrzymywani komórek w niskiej
temperaturze, po dostarczeniu impulsu pozwoli na dłuŜsze otwarcie porów, dzięki czemu
DNA zawarte w roztworze uzyska więcej czasu na wejście do komórek. Alternatywnie,
wyŜsza temperatura moŜe przyspieszać zamknięcie porów błonowych i zwiększyć Ŝywotność
komórki. Po trzecie, zmiana temperatury roztworu doświadczalnego powoduje zmiany jego
przewodnictwa. Przewodnictwo roztworów wzrasta wraz ze zwiększaniem temperatury,
powodując spadek oporności roztworu i stałej czasowej τ. W końcu, tempo dyfuzji, czyli
rozprzestrzeniania się cząsteczek w roztworze jest wysoce zaleŜne od temperatury;
utrzymywanie komórek w niskiej temperaturze zmniejszy dyfuzję cząsteczek przez błonę
komórkową. Wartość temperatury roztworów, w których najskuteczniejszej będzie przebiegał
proces elektroporacji musi zostać określona doświadczalnie. Większość komórek
bakteryjnych jest staje się najlepiej elektrokompetentna gdy są utrzymywane w temperaturze
< 4 °C od czasu przygotowania do podania impulsu. W spółczynnik sprawności transformacji
E. coli spada około ~ 100 -krotnie, gdy temeratura roztworów podczas podawania impulsu
wynosi 20 °C (Shigekawa i Dower, 1988); jednak Ŝe, elektrokompetentne S. aureus przed
poddaniem ich procesowi elektroporacji powinny być inkubowane w temperaturze pokojowej
(Lee, 1995). Dla większości komórek ssaczych, elektroporacja jest najskuteczniejsza gdy
komórki są utrzymane w temperaturze pokojowej zarówno przed jak i po podaniu impulsu
(Chu, i inni., 1987), chociaŜ niektóre typy komórek są skuteczniej przekształcane w niskiej
temperaturze (Potter, i inni., 1984).
53
Rysunek 5.1. Oporności roztworów NaCl (A) i MgCl2 (B) buforowanych NaPO4 przy pH 6,1 i
7,3 oraz HEPES przy 7,5. Oporność była mierzona kuwetach o średnicy 0,2 cm
zawierających 40 lub 200 µl roztworu w temperaturze pokojowej.
54
Tabela 5.1. Oporność wody w kuwetach 0.2 cm do których dodano TE1
PRÓBKA
Rpróbki (ohm)
(objętość 40 µl)
Rpróbki (ohm)
(objętość 200 µl)
Woda
> 600,000
> 600,000
Woda + 1 µl TE
> 600,000
35,000
Woda + 5 µl TE
11,200
8,700
Woda + 10 µl TE
4,850
4,700
Oporność była mierzona kuwetach o średnicy 0,2 cm zawierających 40 lub 200 µl wody
oraz określoną ilość TE (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA) mierzone przy 1 000 V.
1)
Rozdział 6 Literatura
Anderson, M.L.M., Spandidos, D.A., and Coggins, J.R., Electroporation of lymphoid cells:
factors affecting the efficiency of transfection, J. Biochem. Biophys. Meth., 22, 207 (1991)
Andreason, G.L. and Evans, G.A., Optimization of electroporation for transfection of
mammalian cell lines, Anal. Biochem. 180, 279 (1989)
Apolinario, E., Nocero, M., Jin, M., and Hoffman, C.S., Cloning and manipulation of the
Schizosaccharomyces pombe his7+ gene as a new selectable marker for molecular genetic
studies, Curr. Genet. 24, 491 (1993)
Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Struhl,
K. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1987)
Barsoum, J., “Stable integration of vectors at high copy number for high-level expression in
animal cells,” in Methods in Molecular Biology, vol. 48, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press,
Totowa, NJ, 225 (1995)
Becker, D.M. and Guarente, L., High-efficiency transformation of yeast by electroporation,
Methods Enzymol. vol. 194, Academic Press, San Diego, CA, 182 (1991)
Böttger, E. C., High-efficiency generation of plasmid cDNA libraries using electrotransformation, BioTechniques 6, 878 (1988)
Bringel, F. and Hubert, J.-C., Optimized transformation by electroporation of Lactobacillus
plantarum strains with plasmid vectors, Appl. Microbiol. Biotechnol., 33, 664 (1990)
Calvin, N.M. and Hanawalt, P.C., High-efficiency transformation of bacterial cells by
electroporation, J. Bacteriol. 170, 2796 (1988)
Chaffin, D.O. and Rubens, C.E., Blue/white screening of recombinant plasmids in Grampositive bacteria by interruption of alkaline phosphatase gene (phoZ) expression, Gene 219,
91 (1998)
Change, D.C., Chassy, B.M., Saunders, J.A., and Sowers, A.E. (eds.) Guide to
Electroporation and Electrofusion, Academic Press, Inc., San Diego (1992)
Chu, G., Hayakawa, H., and Berg, P., Electroporation for the efficient transfection of
mammalian cells with DNA, Nuc. Acids Res. 15, 1311 (1987)
Cregg, J.M. and Russell, K.A., “Transformation,” in Methods in Molecular Biology, vol. 103,
Higgins, D.R. and Cregg, J.M. (eds.), Humana Press, Totowa, NJ, 27 (1998)
DeBacker, M.D., Maes, D., Vandoninck, S., Logghe, M., Contreras, R., and Luyten,
W.H.M.L., Transformation of Candida albicans by electroporation, Yeast 15, 1609 (1999)
Dekeyser, R.A., Claes, B., deRycke, R.M.U., Habets, M.E., vanMontagu, M.C., and Caplan,
A.B., Transient gene expression in intact and organized rice tissues, The Plant Cell 2, 591
(1990)
Dennis, J.J. and Sokol, P.A., “Electrotransformation of Pseudomonas,” in Methods in
Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 125 (1995)
55
Dower, W. J., “Electroporation of bacteria: a general approach to genetic transformation,” in
Genetic Engineering—Principles and Methods, vol 12, Plenum Publishing Corp., NY, 275
(1990)
Dower, W. J., Miller, J. F., and Ragsdale, C. W., High efficiency transformation of E. coli by
high voltage electroporation, Nuc. Acids Res. 16, 6127 (1988)
Dower, W.J., Chassy, B.M., Trevors, J.T., and Blaschek, H.P., “Protocols for the
transformation of bacteria by electroporation,” in Guide to Electroporation and Electrofusion,
Change, D. C., Chassy, B. M., Saunders, J. A., and Sowers, A. E. (eds.), Academic Press
Inc., 485, San Diego (1992) 72
Fromm, M., Callis, J., Taylor, L.P., and Walbot, V., “Electroporation of DNA and RNA into
plant protoplasts”, in Methods Enzymol., vol. 153, Academic Press Inc., San Diego, 351,
(1987)
Gaertig, J. and Gorovsky, M.A., “Gene transfer by electroporation in Tetrahymena,” in
Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 331
(1995)
Haque, H. and Russell, A. D., Effect of ethylene-diamine-tetraacetic acid and related
chelating agents on whole cells of gram-negative bacteria. Antimicrob. Agents Chemother.,
5, 447 (1974)
Heery, D. M., and Dunican, L. K., Improved efficiency M13 cloning using electroporation,
Nuc. Acids Res. 17, 8006 (1989)
Heiser, W.C., “Optimizing electroporation conditions for the transformation of mammalian
cells,” in Methods in Molecular Biology, vol. 130, Tymms, M.J. (ed.), Humana Press, Totowa,
NJ, 117 (1999)
Hui, S.W., “Effects of pulse length and strength on electroporation efficiency,” in Methods in
Molecular Biology, vol. 48, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 195 (1995)
Howard, P.K., Ahern, K.G., and Firtel, R.A., Establishment of a transient expression system
for Dictyostelium discoideum, Nuc. Acids Res. 16, 2613 (1988)
Jacobs, M., Wnendt, S., and Stahl, U., High-efficiency electro-transformation of Escherichia
coli with DNA from ligation mixtures, Nuc. Acids Res. 18, 1653 (1990)
Joersbo, M. and Brunstedt, J., Electroporation: mechanism and transient expression, stable
transformation and biological effects in plant protoplasts, Physiol. Plant 81, 256 (1991)
Knecht, D. and Pang, K.M., “Electroporation of Dictyostelium discoideum,” in Methods in
Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 321 (1995)
Knutson, J.C. and Yee, D., Electroporation: parameters affecting transfer of DNA into
mammalian cells, Anal. Biochem. 164, 44 (1987)
Lee, J.C., “Electrotransformation of Staphylococci,” in Methods in Molecular Biology, vol. 47,
Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 209 (1995)
Lin, J.-J., “Electrotransformation of Agrobacterium,” in Methods in Molecular Biology, vol. 47,
Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 171 (1995)
Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., “Escherichia coli electrotransformation,” in Methods in
Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995)
Neumann, E., Kakorin, S., and Toensing, K., “Principles of membrane electroporation and
transport of macromolecules,” in Methods in Molecular Medicine vol 37, Jaroszeski, M.J.,
Heller, R., and Gilbert, R. (eds.), Humana Press, Totowa, NJ, 1 (2000)
Nickoloff, J.A. (ed.) Methods in Molecular Biology, vol. 47, Humana Press, Totowa, NJ,
(1995a)
Nickoloff, J.A. (ed.) Methods in Molecular Biology, vol. 48, Humana Press, Totowa, NJ,
(1995b)
Prentice, H.L., High efficiency transformation of Schizosaccharomyces pombe by
electroporation, Nuc. Acids Res., 20, 621 (1991)
Potter, H., Weir, L., and Leder, P., Enhancer-dependent expression of human k
immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation, Proc.
Nat. Acad. Sci. 81, 7161 (1984)
Shigekawa, K. and Dower, W.J., Electroporation of eukaryotes and prokaryotes: A general
approach to the introduction of macromolecules into cells, Biotechniques 6, 742 (1988)
56
Shillito, R.D., Saul, M.W., Paszkowski, J., Muller, M., and Potrykis, I., High efficiency direct
gene transfer to plants, Bio/Technology 3, 1099 (1985)
Showe, M.K., Williams, D.L., and Showe, L.C., Quantitation of transient gene expression
after electroporation, Nuc. Acids Res. 20, 3153 (1990) 73
Silo-Suh, L.A., Lethbridge, B.J., Raffel, S.J., He, H., Clardy, J., and Hanelsman, J., Biological
activities of two fungistatic antibiotics produced by Bacillus cereus UW85, Appl. Environ.
Microbiol. 60, 2023 (1994)
Simon, D. and Ferretti, J.J., Electrotransformation of Streptococcus pyogenes with plasmid
and linear DNA, FEMS Micobiol. Lett. 82, 219 (1991)
Smith, A.W. and Iglewski, B.H., Transformation of Pseudomonas aeruginosa by
electroporation, Nuc. Acids Res. 17, 10509 (1989)
Thompson, J.R., Register, E., Curotto, J., Kurtz, M., and Kelly, R., An improved protocol for
the preparation of yeast cells for transformation by electroporation, Yeast 14, 565 (1998)
Trevors, J.T., Chassy, B.M., Dower, W.J., and Blaschek, H.P., “Electrotransformation of
bacteria by plasmid DNA,” in Guide to Electroporation and Electrofusion, Change, D. C.,
Chassy, B. M., Saunders, J. A., and Sowers, A. E. (eds.), Academic Press Inc., San Diego,
265, (1992)
Willson, T. A., and Gough, N. M., High voltage E. coli electro-transformation with DNA
following ligation, Nuc. Acids Res. 16, 11820 (1988)
Zabarovsky, E. R., and Winberg, G., High efficiency electroporation of ligated DNA into
bacteria, Nuc. Acids Res. 18, 5912 (1990)
57
Specyfikacja i Informacje o produkcie
Specyfikacja
165-2660 Gene Pulser Xcell Kompletny System
Zawiera jednostkę główną, Moduł CE, moduł PC
Charakter fali wyjściowej:
Napięcie:
Pojemność
Oporność (równoległa)
Oporność próbki
Czasy dla fali kwadratowej
rozkład wykładniczy lub kwadratowy rozkład fali
10–3,000 Voltów
10–500 V, 25–3275 mF w odstępach 25 mF
500–3000 V, 10, 25, 50 mF.
50–1,000 Ω w odstępach pulsu 50Ω oraz
nieskończoność.
20 Ω minimum, przy 10–2,500 V
600 minimum, przy 2,500–3,000 V
10–500 V: 0.05–100 ms dł pulsu, 1–10 pulsy,
0.1–10 s odstęp pomiędzy kolejnymi pulsami
500–3,000 V: 0.05–5 ms dł pulsu, 1–2 pulsy,
5–30 s odstęp pomiędzy kolejnymi pulsami
165-2661 Gene Pulser Xcell System Eukariotyczny
Zawiera jednostkę główną, Moduł CE
Wyjście takie samo jak dla kompletnego systemu z równolegle ustawionymi opornikami
165-2662 Gene Pulser Xcell System Microbial – dla komórek bakteryjnych i grzybów
Zawiera jednostkę główną, Moduł PC
Charakter fali wyjściowej:
Napięcie:
Pojemność
Oporność (równoległa)
Oporność próbki
Czasy dla fali kwadratowej
165-2666 Gene Pulser Xcell Main Unit
Charakter fali wyjściowej:
Napięcie:
Pojemność rozładowania
Oporność próbki
Czasy dla fali kwadratowej
General
Zasilanie
Moc
Środowisko
Certyfikaty
Wymiary
rozkład wykładniczy lub kwadratowy rozkład fali
200–3,000 Voltów
10, 25, 50 µF
50–1,000 Ω w odstępach pulsu 50Ω oraz
nieskończoność
20 Ω minimum, przy 200–2,500 V
600 Ω minimum, przy 2,500–3,000 V
0.05–5 ms dł pulsu, 1–2 pulsów,
5–30 s odstęp pomiędzy kolejnymi pulsami
rozkład wykładniczy lub kwadratowy rozkład fali
200–3,000 Voltów
10, 25, 50 µF.
20 Ω minimum, przy 200–2,500 V
600 Ω minimum, przy 2,500–3,000 V
0.05–5 ms dł pulsu, 1–2 pulsów,
5–30 s odstęp pomiędzy kolejnymi pulsami
100–120 VAC lub 220–240 VAC, 50/60 Hz
Max 240 W (During short charging periods)
Temp. 0–35°C, wilgotno ść 0–95%, brak
kondensacji
BezpieczeństwaEN61010,EMC EN61326 KlasaA
Jednostka Główna: 31x30x14 cm, waga 6.62 kg
Moduł CE: 31 x 28 x 9 cm, weight 3.08 kg
Moduł PC: 31x28x5 cm, waga 1.90 kg
58
Informacja o produkcie
Numer Katalogowy
165-2660
Opis Produktu
Gene Pulser Xcell Kompletny System dla komórek
eukariotycznych i prokariotycznych 100–240 V, 50/60
Hz, rozkład wykładniczy lub kwadratowy rozkład fali,
zawiera jednostkę główną, Moduł CE, Moduł PC,
komorę ShockPod, 15 sterylnych kuwet (po 5 o
szczelinach 0.1, 0.2, 0.4 cm), Instrukcję Obsługi
165-2661
Gene Pulser Xcell System Eukariotyczny, 100/240 V,
50/60 Hz, rozkład wykładniczy (zakres: 25–3,275 µF) lub
kwadratowy rozkład fali, zawiera: jednostkę główną,
Moduł CE, komorę ShockPod, 5 kuwet sterylnych
(szczelina 0.4cm), Instrukcję Obsługi
165-2662
Gene Pulser Xcell System Prokariotyczny, 100/240 V,
50/60 Hz, rozkład wykładniczy lub kwadratowy rozkład
fali, zawiera: jednostkę główną, Moduł PC, komorę
ShockPod, 10 sterylnych kuwet (po 5 o szczelinach: 0.1
i 0.2 cm), Instrukcję Obsługi
165-2666
Gene Pulser Xcell, jednostka główna,100/240 V,50/60Hz
165-2667
Gene Pulser Xcell Moduł CE, 25–3,275 µF zakres
kontrolowany przez jednostkę główną, odp przewody
165-2668
Gene Pulser Xcell PC Module, 50–1,000 ohm zakres
kontrolowany przez jednostkę główną, odp przewody
165-2669
Gene Pulser Xcell ShockPod komora pulsacyjna,
zawiera zakres kontrolowany przez jednostkę główną,
odpowiednie przewody podłączeniowe do Gene Pulser
Xcell, Gene Pulser II, lub MicroPulser.
165-2095
Gene Pulser stelaŜ na kuwety
165-2094
Gene Pulser protokoły do elektroporacji
165-2088
Gene Pulser Kuwety, 0.4 cm szczelina, 50, sterylne
165-2086
Gene Pulser Kuwety, 0.2 cm szczelina, 50, sterylne
165-2089
Gene Pulser Kuwety, 0.1 cm szczelina, 50, sterylne
165-2091
Gene Pulser Kuwety, 0.4 cm szczelina, 500, sterylne
165-2092
Gene Pulser Kuwety, 0.2 cm szczelina, 500, sterylne
165-2093
Gene Pulser Kuwety, 0.1 cm szczelina, 500, sterylne
165-2081
Gene Pulser Kuwety, 0.4 cm szczelina, 5, sterylne
165-2082
Gene Pulser Kuwety, 0.2 cm szczelina, 5, sterylne
59
165-2083
Gene Pulser Kuwety, 0.1 cm szczelina, 5, sterylne
60