Streszczenie rozprawy lek. M. Marcinkiewicz

Lek. Małgorzata Marcinkiewicz
Ekspresja peptydów przeciwdrobnoustrojowych
u pacjentów z Epidermodysplasia verruciformis
Rozprawa na stopień naukowy doktora nauk medycznych
Promotor: Prof. dr hab. n. med. Sławomir Majewski
Katedra i Klinika Dermatologii i Wenerologii
Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego
Warszawa 2016
Streszczenie
Peptydy przeciwdrobnoustrojowe (ang. animicrobial peptides, AMPs) stanowią istotną
część wrodzonej odpowiedzi immunologicznej organizmu. Wykazują szerokie spektrum
aktywności przeciwko bakteriom Gram-dodatnim jak i Gram-ujemnym, wirusom, grzybom
oraz przeciw pasożytom. Oprócz wspomnianego bezpośredniego działania mają właściwości
chemotaktyczne, modulują działanie układu immunologicznego oraz biorą udział w procesach
angiogenezy i gojenia ran. Są ważnym elementem obrony przeciwzakaźnej skóry i błony
śluzowej u ludzi. Niektóre AMPs są produkowane konstytutywnie przez komórki skóry,
np. psoriazyna (białko S100A7) czy rybonukleaza 7 (RNaza 7), inne, m.in. defensyny hBD-2
i hBD-3, pod wpływem różnych bodźców.
Epidermodysplasia verruciformis (EV) jest uznawana za rzadką genodermatozę
charakteryzującą się nadmiernie wyrażoną podatnością na zakażenie swoistymi dla niej typami
wirusa brodawczaka ludzkiego (ang. human papilloma virus, HPV) zwanymi EV HPV i
obarczona wysokim ryzykiem rozwoju raków skóry wywołanych onkogennymi typami HPV.
EV uważana jest za pierwszy ludzki model genetycznie uwarunkowanego raka skóry
związanego z HPV. Pod wpływem czynników immunogenetycznych i środowiskowych,
szczególnie
promieniowania
ultrafioletowego,
układ
immunologiczny
pacjentów
z EV nie rozpoznaje prawidłowo wirusa HPV. Klinicznie choroba objawia się mnogimi
zmianami brodawkowymi, rumieniowymi i przebarwieniami, zwłaszcza w okolicach
narażonych na działanie promieniowania słonecznego. Choroba objawia się w młodym wieku,
a wraz z jej trwaniem dochodzi do rozwoju zmian przednowotworowych jak rogowacenie
słoneczne (ang. actinic keratosis, AK) i choroba Bowena (łac. morbus Bowen, MB) oraz
nowotworowych przede wszystkim typu raka kolczystokomórkowego skóry (ang. squamous
cell carcinoma, SCC), które w wielu przypadkach są usuwane operacyjnie. Obserwacje
kliniczne wskazują jednak na przyspieszone gojenie ran i brak skórnych ko-infekcji
bakteryjnych u tych pacjentów.
W przypadku wielu schorzeń dermatologicznych takich jak łuszczyca, atopowe
zapalenie skóry, czy raki skóry badania wykazały zmienioną ekspresję peptydów
przeciwbakteryjnych, sugerując ich potencjalną rolę w opracowaniu nowych metod
terapeutycznych. Badania z ostatnich lat wskazują, że rybonukleaza 7 może mieć znaczenie
w supresji nowotworzenia, zaś defensyny hBD-2 i hBD-3 mogą je promować. Udowodniono
także znaczenie AMPs w procesie gojenia ran. Psoriazyna została zidentyfikowana
2
w wymazach z ran, hBD-2 i hBD-3 w ostrych niezakażonych ranach, gdzie ich ekspresja była
zwiększona.
Dotychczas nie badano ekspresji peptydów przeciwdrobnoustrojowych u pacjentów
z Epidermodysplasia verruciformis. Nie jest wiadome czy odgrywają one rolę w procesie
nowotworzenia jaki ma miejsce u pacjentów z EV. Interesującym zagadnieniem jest także brak
skórnych ko-infekcji bakteryjnych u pacjentów z EV i potencjalny związek z ekspresją
peptydów przeciwdrobnoustrojowych w skórze chorych a także ewentualny wpływ
na procesy gojenia.
Cele pracy:
-
Ocena ekspresji peptydów przeciwdrobnoustrojowych takich jak: ludzkie β-defensyny
hBD-2 i -3, psoriazyna (białko S100A7) i rybonukleaza 7 w zmianach przedi nowotworowch u pacjentów z Epidermodysplasia verruciformis w porównaniu
z podobnymi zmianami w populacji ogólnej bez defektu genetycznego EV oraz ze skórą
niezmienioną
-
Ocena związku między AMPs a progresją nowotworową u pacjentów z EV
-
Ocena związku między zmienioną ekspresją AMPs a obserwowanym brakiem skórnych
ko-infekcji bakteryjnych u pacjentów z EV
-
Zbadanie korelacji między ekspresją poszczególnych AMPs na przykładzie EV
Badaniom zostały poddane wycinki skórne pobrane od pacjentów z Epidermodysplasia
verruciformis (n=58) zachowane w formie bloczków parafinowych. Fragmenty tkanek, w tym
wycinki ze zmian nienowotworowych / łagodnych (n=13), zmian przednowotworowych jak
rogowacenie słoneczne i choroba Bowena (odpowiednio: AK n=14, MB n=22) oraz rakowych
jak rak kolczystokomórkowy (SCC n=9) zostały pozyskane od 10 pacjentów z EV. Wyniki
badania wycinków skórnych od pacjentów z EV (grupa badana) zostały porównane
z wynikami badania fragmentów marginesu tkankowego (zwanego dalej zdrową skórą)
wyciętego podczas zabiegów dermato-chirurgicznych wykonanych z różnych przyczyn
u pacjentów niechorujących na EV (grupa kontrolna 1 – K1). Wśród fragmentów zdrowej
skóry znalazło się 27 wycinków skórnych pobranych z miejsc narażonych na przewlekłe
działanie promieni UV (głowa i szyja) oraz 8 wycinków skórnych pobranych z miejsc
nienarażonych na przewlekłe działanie promieni UV jak klatka piersiowa i uda. Co więcej,
ekspresja AMPs w zmianach przednowotworowych i nowotworowych u pacjentów z EV
została porównana nie tylko z ekspresją AMPs w zdrowej populacji, ale również odpowiednio
3
z ekspresją AMP w zmianach przednowotworowych (AK n=10, MB n=20) i nowotworowych
(SCC n=7) u osób z populacji ogólnej bez współistniejącej EV (grupa kontrolna 2 – K2).
Wycinki skórne zostały dostosowane pod względem lokalizacji zmian, wieku oraz płci
pacjentów.
Analiza została przeprowadzona metodą immunohistochemiczną celem wizualizacji
peptydów przeciwdrobnoustrojowych, tj. rybonukleazy 7, psoriazyny (białka S100A7),
ludzkich β-defensyn hBD-2 i hBD-3 w skrawkach skórnych. Wszystkie próbki poddano ocenie
mikroskopowej. Opisano wzorzec ekspresji AMPs w naskórku u pacjentów z EV.
Przeprowadzono analizę porównawczą pod kątem głębokości i intensywności ekspresji AMPs
między grupą badaną a kontrolnymi, korelacji między ekspresją AMPs w naskórku
a wpływem przewlekłej ekspozycji na promieniowanie UV, różnic między grupami
oraz zależności między intensywnością ekspresji poszczególnych AMPs na przykładzie grupy
badanej (EV). Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej.
Po raz pierwszy opisano wzorzec ekspresji AMPs w naskórku u pacjentów z EV. Prawie
wszystkie badane preparaty skórne pozyskane od osób z EV (94,8%) wykazały dodatnią reakcję
na obecność AMPs. Wykazano statystycznie istotne zwiększenie ekspresji ludzkich β-defensyn
w
zmianach
przed-
i
nowotworowych
u
pacjentów
z
grupy
badanej
w stosunku do grupy K1 (skóry niezmienionej). Ekspresja RNazy 7 w zmianach skórnych
u osób z grupy badanej (EV) była zbliżona do ekspresji w naskórku osób z grupy K1,
za wyjątkiem zwiększonej intensywności ekspresji tego peptydu w grupie K1 w porównaniu
do zmian łagodnych w grupie EV. Nie odnotowano różnic w ekspresji badanych AMPs
w zmianach przednowotworowych w grupie badanej (EV) w stosunku do podobnych zmian
skórnych u pacjentów z ogólnej populacji (grupa K2). Jednakże wykazano zwiększenie
w zakresie głębokości ekspresji hBD-2 i hBD-3 w raku kolczystokomórkowym w grupie K2
w stosunku do pacjentów z EV. Stwierdzono zwiększoną głębokość i intensywność hBD-2,
hBD-3 oraz psoriazyny w naskórku pochodzącym ze zmian w lokalizacji eksponowanej
na przewlekłe działanie promieni UV w grupie badanej (EV) w stosunku do grupy K1.
Zanotowano zwiększoną ekspresję β-defensyn i psoriazyny w wycinkach skórnych u osób
z grupy K2 w stosunku do grupy K1 oraz brak różnic w ekspresji RNazy 7 w zmianach skórnych
u pacjentów z grupy K2 i K1. Wykazano dodatnią korelację między intensywnością ekspresji
RNazy 7 a intensywnością ekspresji pozostałych trzech peptydów oraz pomiędzy
intensywnością ekspresji hBD-2 a intensywnością ekspresji hBD-3 w zmianach skórnych
u chorych z EV.
4
Na podstawie uzyskanych wyników wysnuto następujące wnioski:
1.
Po raz pierwszy opisano wzorzec ekspresji peptydów przeciwdrobnoustrojowych
w naskórku u pacjentów z Epidermodysplasia verruciformis oraz stwierdzono
ich zwiększoną ekspresję w stosunku do zdrowej skóry.
2.
Zmieniona ekspresja peptydów przeciwdrobnoustrojowych w naskórku u pacjentów
z EV może wynikać zarówno z transformacji nowotworowej jak i przewlekłej infekcji
EV HPV czy działania promieniowania UV. Defensyny hBD-2 i hBD-3 mogą pełnić rolę
promotorów progresji nowotworowej.
3.
Bardziej powierzchowna ekspresja β-defensyn w SCC u pacjentów z EV w porównaniu
do ekspresji peptydów w SCC w ogólnej populacji jest zgodna z obserwacjami
klinicznymi o mniejszej złośliwości raka skóry w EV.
4.
Zmieniona ekspresja AMPs u pacjentów z EV w porównaniu do ekspresji
w zdrowym naskórku może wiązać się z obserwowanym klinicznie brakiem innych
niż EV HPV skórnych ko-infekcji wirusowych i bakteryjnych.
5.
Dodatnia korelacja między intensywnością ekspresji RNazy 7 a intensywnością ekspresji
pozostałych
badanych
AMPs
oraz
między
intensywnością
ekspresji
hBD-2
a intensywnością ekspresji hBD-3 na przykładzie pacjentów z EV może świadczyć
o synergistycznym działaniu peptydów przeciwdrobnoustrojowych.
6.
Dalsze badania nad ekspresją AMPs w korelacji z procesem nowotworzenia, zakażeniem
HPV
i
działaniem
promieniowania
UV
są
niezbędne
między
innymi
do poszerzenia metod diagnostyczno-terapeutycznych w rakach skóry innych
niż czerniak (nieczerniakowych rakach skóry).
5
Abstract
Antimicrobial peptides (AMPs) are an important part of the innate immune system
of humans. They are active against wide range of microorganisms: bacterias, viruses, fungi and
protozoa. Apart from their antimicrobial properties AMPs demonstrate the ability
to induce chemotaxis, influence the immune system functions, angiogenesis and wound
healing. They are a relevant element of skin and mucosa anti-infectious defence. Some of AMPs
are constitutively expressed in the skin like psoriasin (S100A7) and ribonuclease 7 (RNase 7),
whereas some (e.g. human β-defensins like hBD-2 and hBD-3) are induced upon contact with
pathogens.
Epidermodysplasia verruciformis (EV) is a rare genetic skin disorder characterized by
unusual susceptibility to infections caused by human β papillomaviruses (HPV) called EV
HPVs with a high risk of developing multiple HPV-associated skin malignancies. EV is
considered as a model of cutaneous viral oncogenesis. Influenced by immunogenetic and
environmental aspects, especially UV radiation, the immune system of patients with EV does
not recognise HPV virus properly. Clinically, the disease is characterised by multiple verrucous,
red and hyperpigmented lesions preferentially on the sun exposed areas. Typically, they have a
strong tendency to maintain throughout the life. EV begins during early childhod, but lesions
show a propensity to evolve with time into pre-malignancies like actinic keratosis (AK) and
Bowen's disease (MB) and malignancies, mainly squamous cell carcinoma (SCC), which are
surgically removed in most cases.
Previous studies showed the altered expression of several AMPs in skin diseases such
as psoriasis vulgaris, atopic dermatitis or skin cancers, suggesting that they could be a target
for development of new therapeutic methods. Lately, RNase 7 is thought to be involved
in skin oncogenesis suppression, and hBD-2 and hBD-3 in tumor progression. AMPs are
considered to play an important role in wound healing. Psoriasin was identified in wound
exudates, whereas β-defensins in acute surgical wounds, and their expression was elevated.
The expression of AMPs in patients with EV has never been studied before. Whether
AMPs play a role in skin tumorigenesis and influence the immune response in EV patients
is still not clear. Interestingly, individuals with EV are not prone to bacterial co-infections.
Therefore it is tempting to speculate that AMPs may be involved in this process and may
promote wound repair in EV patients as well.
6
The aim of the study was:
-
To analyze the expression of antimicrobial peptides like: human β defensins hBD-2 and
hBD-3, psoriasin (S100A7) and ribonuclease 7 in pre- and cancerous lesions
in patients with Epidermodysplasia verruciformis in comparison with adequate lesions
in general population without EV genetic defect and with healthy unchanged skin
-
To analyze the relationship between AMPs expression and tumorigenesis in EV patients
-
To analyze the relationship between altered AMPs expression and observed lack
of skin co-infections in EV patients
-
To investigate the correlations between different AMPs on the example of EV patients
The paraffin-embedded tissue speciments taken from patients with EV (EV group;
n=58) were studied. The EV samples included non-tumorous lesions (n=13), pre-malignancies
(AK n=14, MB n=22) and malignancies like SCC (n=9) and were obtained from 10 EV patients.
The expression of AMPs in EV speciments was compared with the expression
of AMPs in tumor-free margins (called healthy controls) excised during dermosurgical
procedures performed from different reasons in general population (control group 1 = K1). The
healthy specimens comprised of 27 chronically UV-exposed tissues taken from head and neck
and 8 non-chronically UV-exposed skin from the trunk and thighs. All EV specimens were
compared with age-, gender- and location-matched samples. Moreover, the expression
of AMPs in pre-malignancies and malignancies in EV group was compared not only
with the expression of AMPs in healthy controls but also correspondingly with the expression
of AMPs in pre-malignancies (AK n=10, MB n=20) and malignancies (SCC n=7) in non-EV
patients (control group 2 = K2).
To visualize the expression of different classes of AMPs, such as human ß-defensin
(hBD)-2 and -3, ribonuclease 7 (RNase7) and psoriasin (S100A7) in studied speciments
the immunohistochemistry was performed. The analysis covered the comparison of AMPs
expression’s depth and intensity in all samples taken from patients, correlation between
expression of AMPs in the skin and parts of the body exposed or not-exposed to UV radiation,
the differences between the groups, and correlation between the expression of AMPs
on the example of EV group. Statistical analysis was performed.
The expression pattern of AMPs in the skin of EV patients was described for the first
time. Almost all skin samples taken from EV patients (94,8%) showed expression of AMPs.
The expression of human β-defensins in pre- and malignant lesions in EV patients was
significantly higher in comparison with the expression of human β-defensins in healthy skin
7
(K1). The expression of RNase 7 in skin speciments in EV patients was similar
to the expression of RNase 7 in healthy skin (K1 group) with the exception of higher expression
intensity in skin samples of K1 group than in non-malignant lesions in EV group. There were
no differences in the expression of studied AMPs in premalignancies in EV group
in comparison with similar lesions in the general population without EV genetic defect (K2
group). However, higher expression depth of hBD-2 and hBD-3 in SCC in K2 group
than the expression of those peptides in SCC in EV group was noted. Higher expression depth
and intensity of hBD-2, hBD-3 and psoriasin in long-term UV exposed lesions in EV group
than in K1 group was observed. The expression of β-defensins and psoriasin in lesions from K2
group was higher than in K1 group, but no difference in RNase 7 expression between K2 and
K1 group was noted. Positive correlation between expression intensity of RNase 7
and other AMPs and between expression intensity of hBD-2 and hBD-3 in EV patients was
observed.
The following conclusions were drawn on the basis of obtained results:
1. The expression pattern of studied AMPs in epithelium of patients with EV and their
higher expression than in normal skin was described for the first time.
2. Altered expression of AMPs in the epidermis of EV patients might result from
malignant transformation, prolonged EV HPV infection or UV radiation. Defensins
hBD-2 and hBD-3 might act as promoters of cutaneous tumor progression.
3. More superficial expression of studied AMPs in SCC in EV patients compared
to expression of AMPs in SCC in the general population confirms clinical observation
that skin cancers in EV are less malignant.
4. Altered expression of AMPs in EV patients compared to expression in healthy skin
might explain the clinically observed absence of viral and bacterial co-infections
in EV.
5. Positive correlation between expression intensity of Rnase 7 and other AMPs observed
in EV patients might indicate the synergistic activity of AMPs.
6. Further studies on the expression of AMPs in correlation with tumorigenesis, HPV
infection and long-term UV radiation are necessary, inter alia, to extend diagnostic and
therapeutic methods in nonmelanoma skin cancer.
8