FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α

FLEX
Monoclonal Rabbit
Anti-Human
Estrogen Receptor α
Klon EP1
Gotowy do uŜycia
(Link)
Nr kat. IR084
Przeznaczenie
Do badań diagnostycznych in vitro.
FLEX Monoclonal Rabbit Anti-Human Estrogen Receptor α, klon EP1, Gotowy do uŜycia (Link) to przeciwciała
przeznaczone do stosowania w immunohistochemii razem z aparatami Autostainer Link do półilościowego
wykrywania ludzkiego receptora estrogenowego w utrwalanych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawkach
tkankowych ludzkiego raka sutka. Przeciwciała znakują komórki z ekspresją receptora estrogenowego α i są
przydatne przy określaniu obecności receptora estrogenowego w przypadkach ludzkiego raka sutka.
Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z
wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez wykwalifikowanego
patologa z uwzględnieniem historii klinicznej pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Synonimy antygenu
ER α
Podsumowanie
i wyjaśnienie
Receptory steroidowe wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla ligandów. Ludzki receptor estrogenowy
(ER) jest białkiem dimerycznym o masie 65 kDa, zlokalizowanym najczęściej w błonie jądrowej. NaleŜy do klasy
białek o działaniu trans – pobudzających transkrypcję przez wiązanie z określonymi elementami DNA,
określanymi równieŜ jako elementy odpowiedzi hormonalnej. PoniewaŜ po związaniu białka następuje indukcja
receptora ER i stymulacja transkrypcji genu, receptor estrogenowy określa się mianem indukowalnego czynnika
pobudzającego (1, 2).
W badaniach z ubiegłych lat wykazano pozytywną korelację stanu receptora estrogenowego ER z wynikami
przypadków nieleczonych (np. prognozowanie dobrze zróŜnicowanego inwazyjnego raka sutka) i odpowiedzią na
leczenie antyhormonalne, np. leczenie tamoksifenem (2). Stwierdzono, Ŝe estrogeny przede wszystkim
koncentrowały się w narządach docelowych estrogenu zwierząt i ludzkim raku sutka oraz udokumentowano w
stopniu dobrym mitogenny wpływ estrogenu za pośrednictwem receptora estrogenowego ER. Na podstawie
badań mechanizmu biologicznego wzrostu raka sutka stwierdzono, Ŝe szybkość wzrostu zaleŜy od obecności
estrogenu lub progesteronu oddzielnie lub razem w większości wystąpień raka sutka (2). Tak więc stan receptora
estrogenowego w przypadku raka sutka jest uwaŜany za potwierdzony czynnik prognostyczny i predykcyjny
podczas postępowania z pacjentami w leczeniu antyhormonalnym (2–4).
Patrz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z
zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Procedura barwienia, 6) Kontrola jakości,
7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Odczynnik
dostarczony
Gotowe do uŜycia monoklonalne przeciwciało królicze dostarczane w postaci płynnej w buforze zawierającym
białko stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/l.
Klon: EP1.
Immunogen
Rekombinowana proteina zawierająca aminokwasy ER α 1–300.
Swoistość
W testach Western blot lizatów komórkowych MCF7 przeciwciało barwi główny prąŜek o masie cząsteczkowej
ok. 67 kD odpowiadający oczekiwanej masie cząsteczkowej ER α. Nie stwierdzono reaktywności krzyŜowej z ER β.
Środki ostroŜności
((121936-002))
1.
Do badań diagnostycznych in vitro.
2.
Do stosowania przez wyszkolony personel.
3.
Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek
sodu, zastosowany w produkcie w stęŜeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŜe
reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie
wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŜą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się
azydku metalu w kanalizacji.
4.
Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŜy stosować
właściwe procedury postępowania.
5.
W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŜy nosić odpowiednie osobiste wyposaŜenie ochronne.
6.
Niewykorzystany roztwór utylizować zgodnie z lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi rozporządzeniami.
P01471PL_003_IR084/2015.11 s. 1/4
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na fiolce. Jeśli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane powyŜej, uŜytkownik musi zweryfikować takie
warunki. Nie ma oczywistych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem
próbek pochodzących od pacjenta naleŜy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne. W wypadku nieoczekiwanego
wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się
problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Przygotowanie próbek
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie preparatów cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) przy uŜyciu aparatu
Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101/PT200). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT
Link. Optymalne wyniki uzyskuje się po wstępnej obróbce tkanek poprzez 20-minutową inkubację w odczynniku
EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8000/K8004/K8023) w temperaturze 97°C , a
następnie 5-minutowe zanurzenie w buforze EnVision FLEX Wash Buffer (nr kat. K8007).
Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej skrawków tkankowych utrwalonych w formalinie i
zatopionych w parafinie zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem urządzenia Dako PT Link. Po przeprowadzeniu
barwienia skrawki muszą zostać odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie
szkiełek Dako Silanized Slides (nr kat. S3003).
Procedura barwienia
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH, (Link) (nr kat. K8000/K8023). W systemie
Autostainer Link wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Zalecana objętość aplikacji
odczynnika wynosi 1 x 200 µl lub 2 x 150 µl na jeden preparat. Szczegółowe informacje dotyczące wkładania
szkiełek mikroskopowych i odczynników przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer Link. Jeśli
protokoły nie są dostępne w uŜywanym systemie Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia
technicznego firmy Dako. Program instalacyjny słuŜący do uzupełniania oprogramowania DakoLink o dane
protokołu i odczynnika anty-ER α, klon EP1, moŜna znaleźć pod adresem www.dako.com\Installer. Wszystkie
procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i
powinny być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium (5). NaleŜy skontaktować się z działem
obsługi/obsługą techniczną firmy Dako w celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu.
NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe — w tym celu naleŜy ocenić, czy
odczyn jest taki jak opisany w części „Charakterystyka działania”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną za pomocą odczynnika EnVision FLEX Hematoxylin (Link)
(nr kat. K8008). Zaleca się stosowanie niewodnego środka do trwałego zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów zaleca się wykonywanie dodatnich i ujemnych
prób kontrolnych z uŜyciem identycznego protokołu. W optymalnym przypadku kontrole dodatnie powinny
zawierać tkankę raka sutka o niskiej ekspresji ER. MoŜna równieŜ uŜywać łagodnych nowotworów szyjki macicy.
We wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki, jak opisany dla
tej tkanki w części „Charakterystyka działania”.
Zalecany odczynnik do kontroli ujemnej to FLEX Universal Negative Control, Rabbit, Gotowy do uŜycia (Link)
(nr kat. IR600).
Interpretacja
wybarwienia
Przeciwciała dają odczyn jądrowy. Ewentualny zaobserwowany odczyn cytoplazmatyczny naleŜy uznać za
nieswoisty.
Dodatni wynik badania definiuje się jako odczyn jądrowy w ≥1% komórek nowotworowych (6). Zasada ta jest
zgodna z rekomendowanym przez ASCO/CAP poziomem granicznym wyniku dodatniego określonym jako ≥1%
dodatnich komórek nowotworowych (3).
Ograniczenia swoiste
dla opisywanego
produktu
Charakterystyka
działania
1.
Wyniki fałszywie ujemne mogą być spowodowane procesem stopniowego rozkładu antygenu w tkankach.
JeŜeli próbki przechowywano w temperaturze pokojowej, powinny być poddane barwieniu w ciągu
2 miesięcy od osadzenia preparatów tkankowych na szkiełkach (7).
2.
W celu uzyskania optymalnych, powtarzalnych wyników, w preparatach utrwalanych standardowo
(w obojętnej buforowanej formalinie) i zatapianych w parafinie naleŜy zastosować odmaskowanie antygenu
białka ER.
3.
Nie przeprowadzono weryfikacji stosowania Dako Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon EP1, na
tkankach utrwalanych środkami innymi niŜ formalina.
Precyzja: Do badania przeznaczono seryjne skrawki pochodzące z trzech róŜnych bloczków raka sutka,
utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie. Badanie wykonano w następujący sposób:
Precyzja w jednej serii odczynów: Zgodnie ze standardowym protokołem uŜycia odczynników EnVision FLEX,
High pH trzy skrawki z kaŜdego bloku wybarwiono za pomocą przeciwciał Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α,
klon EP1. Jednocześnie wykonano odczyn na pojedynczych skrawkach z kaŜdego bloczka, stosując odczynnik
do kontroli ujemnej.
Precyzja między seriami odczynów: PowyŜszą procedurę powtarzano przez dwa dodatkowe dni, wykonując
odczyn jednego skrawka z kaŜdego bloczka. Jednocześnie wykonano odczyn na pojedynczych skrawkach z
kaŜdego bloczka, stosując odczynnik do kontroli ujemnej.
((121936-002))
P01471PL_003_IR084/2015.11 s. 2/4
Precyzja między aparatami: PowyŜszą procedurę powtarzano na trzech osobnych aparatach Autostainer,
wykonując odczyn trzech skrawków z kaŜdego bloczka. Jednocześnie wykonano odczyn na pojedynczych
preparatach z kaŜdego bloczka, stosując odczynnik do kontroli ujemnej.
W wyniku eksperymentów z przeciwciałami Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon EP1, w badaniach w
obrębie jednej, kilku serii i między aparatami uzyskano zgodność wyników. W przebiegu badania uzyskano stale
zgodne wyniki pomiędzy seriami odczynów, a odczynniki przechowywano w temperaturze 2–8 ºC.
Tkanki normalne: W tabeli 1. przedstawiono podsumowanie immunoreaktywności Monoclonal Rabbit Anti-Human
ER α, klon EP1, w zalecanym panelu prawidłowych tkanek. Wszystkie preparaty utrwalano w formalinie i
zatapiano w parafinie. Następnie wykonywano odczyn przy uŜyciu Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon
EP1, zgodnie z zaleceniami przedstawionymi w ulotce dołączonej do opakowania.
Tabela 1: Podsumowanie reaktywności Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon EP1, w tkankach
prawidłowych (8)
Rodzaj tkanki (liczba
testowanych przypadków)
Grasica (3)
Gruczoł krokowy (3)
Gruczoły sutkowe (2)
Jajniki (3)
Jądra (3)
Jelito cienkie (3)
Jelito grube (3)
Komórki międzybłonka (3)
Macica (3)
Mięsień sercowy (3)
Mięśnie szkieletowe (3)
Migdałki (3)
Mózgowie (3)
MóŜdŜek (3)
Nadnercza (3)
Nerki (3)
Nerwy obwodowe (3)
Płuca (3)
Przełyk (3)
Przysadka mózgowa (3)
Przytarczyce (3)
Skóra (3)
Szpik kostny (3)
Szyjka macicy (3)
Śledziona (3)
Ślinianki (3)
Tarczyca (3)
Trzustka (3)
Wątroba (3)
śołądek (3)
Składniki komórkowe dające dodatni odczyn
0/3
3/3 Komórki podścieliska (<5–30%), jądrowy
2/2 Komórki nabłonka gruczołowego (20%), jądrowy
3/3 Nabłonek pęcherzykowy (20–40%), jądrowy
2/3 Komórki podścieliska (10–30%), jądrowy
0/3
0/3
0/3
0/3
3/3 Warstwa mięśniowa (<1–40%), jądrowy
3/3 Nabłonek gruczołowy (50–80%), jądrowy
3/3 Komórki podścieliska (30–80%), jądrowy
0/3
0/3
2/3 Komórki nabłonka (≤1%), jądrowy
1/3 Limfocyty ośrodka rozmnaŜania (<1%), jądrowy
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
1/3 Komórki nabłonka (<1%), jądrowy
0/3
0/3
0/3
0/3
3/3 Komórki nabłonka (30%), jądrowy
3/3 Komórki podścieliska (30%), jądrowy
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
0/3
Porównanie metod: Przeprowadzono testy przeciwciał Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon EP1, z
zastosowaniem odczynnika EnVision FLEX. Wyniki poddano ocenie zgodnie z wytycznymi ASCO/CAP (próg
≥1%) (3). Przeprowadzono równieŜ testy koktajlu przeciwciał anty-ER α (klony 1D5 i ER-2-123) przy uŜyciu
zestawu Dako ER/PR pharmDx Kit. Wyniki tych testów oceniono zgodnie z wytycznymi Allred zamieszczonymi w
ulotce dołączonej do opakowania. Dane z porównania metod przedstawiono w Tabeli 2. Wyniki ocen dokonanych
zgodnie z odpowiednimi wytycznymi wykazują duŜą zgodność pomiędzy przeciwciałami Monoclonal Rabbit AntiHuman ER α, klon EP1, a przeciwciałami anty-ER α wchodzącymi w skład zestawu Dako ER/PR pharmDx Kit.
Zgodność ogólna, zgodność wyników dodatnich i zgodność wyników ujemnych wynoszą odpowiednio: 96,2%,
98,9% i 92,2%.
((121936-002))
P01471PL_003_IR084/2015.11 s. 3/4
Tabela 2: Zgodność między Anti-ER α, klon EP1, a składnikiem anty-ER α zestawu ER/PR pharmDx Kit
Składnik anty-ER α zestawu ER/PR pharmDx Kit
Monoclonal
Rabbit AntiHuman ER α,
klon EP1
Dodatnie
Ujemne
Razem
Dodatnie
183
10
193
Ujemne
2
119
121
Razem
185
129
314
Zgodność wyników dodatnich wyraŜona procentowo = 183/185 = 98,9%
Zgodność wyników ujemnych wyraŜona procentowo = 119/129 = 92,2%
Zgodność ogólna wyraŜona procentowo = 302/314 = 96,2%
Kappa= 0,9203
95-procentowy przedział ufności = 0,8761–0,9645
Piśmiennictwo
1.
Kumar V, Green S, Stack G, Berry M, Jin J-R, Chambon P. Functional domains of the human estrogen
receptor. Cell 1987;51:941-51.
2.
Elledge RM, Fuqua SAW. Ch. 31: Estrogen and Progesterone Receptors. Diseases of the Breast. Harris et
al. eds., Lippincott Williams & Wilkins 2000; 471-85.
3.
Hammond MEH, Hayes DF, Dowsett M, Allred C, Hagerty KL, Badve S, et al. American Society of Clinical
Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for Immunohistochemical Testing
of Estrogen and Progesterone Receptors in Breast Cancer. Arch Pathol Lab Med 2010;134:907–22.
4.
Fitzgibbons FK, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Prognostic factors in breast
cancer: College of American Pathologists Consensus Statement 1999. Arch Pathol Lab Med 2000;124:966-78.
5.
Fitzgibbons PL, Murphy DA, Hammond EH, Allred C, Valenstein PN. Recommendations for Validating
Estrogen and Progesterone Receptor Immunohistochemistry Assays. Arch Pathol Lab Med 2010:134;930-35.
6.
Diaz LK, Sneige N. Estrogen receptor analysis for breast cancer: current issues and keys to increasing
testing accuracy. Adv Anat Pathol 2005;12:10-9. Review.
7.
Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry;
Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5)- CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400.
Wayne, PA 19087-1898 USA 1999.
8.
M3634 IHC003-D03803 Report on file.
Przeciwciała Monoclonal Rabbit Anti-Human ER α, klon EP1, są produkowane przez firmę Epitomics Inc. przy
uŜyciu technologii produkcji monoklonalnych przeciwciał króliczych chronionej patentami nr 5,675,063 oraz
7,402,409.
Wydanie 11/15
((121936-002))
P01471PL_003_IR084/2015.11 s. 4/4