Ocena przydatności heksametylodisilazanu jako czynnika

&ARM0RZEGL.AUK †
/CENAPRZYDATNOuCIHEKSAMETYLODISILAZANU
JAKOCZYNNIKADERYWATYZUJ’CEGO
WANALIZIESTRUKTURYFEOMELANINTECHNIK’PIROLIZY
!NASSESSMENTOFTHEUSEFULNESSOFHEXAMETHYLDISILAZANE
ASADERIVATIZINGAGENTINSTRUCTURALANALYSISOFPHEOMELANIN
BYPYROLYSIS
!NNA$ZIER˜ÃGA†,ÃCZNAR3ŒAWOMIR+URKIEWICZ+RYSTYNA3TÃPIEÊ
+ATEDRA!NALIZY)NSTRUMENTALNEJ7YDZIAŒU&ARMACEUTYCZNEGO
Z/DDZIAŒEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJW3OSNOWCU
gL’SKIEGO5NIWERSYTETU-EDYCZNEGOW+ATOWICACH
Streszczenie
Abstract
Piroliza prowadzona w obecności czynnika derywatyzującego, połączona z identyfikacją otrzymanych produktów
metodą chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas, jest wartościową techniką wykorzystywaną w badaniach struktury melanin. W prezentowanej pracy po raz
pierwszy badano możliwość zastosowania w tym celu odczynnika sililującego – heksametylodisilazanu (HMDS).
Analizie poddano syntetyczną feomelaninę otrzymaną na
drodze enzymatycznej z dopaminy i cysteiny oraz wzorce feomelaninowych jednostek monomerycznych typu
benzotiazynowego i benzotiazolowego. Uzyskane wyniki
wskazują, że sposób termicznej degradacji oraz pirolitycznej sililacji in situ podjednostek strukturalnych badanej melaniny jest inny, niż czystej benzotiazyny i benzotiazolu. Pochodne trimetylosililowe powstające w wyniku
pirolizy feomelaniny w obecności HMDS nie posiadają
heterocyklicznego pierścienia zawierającego siarkę, co
uniemożliwia ich wykorzystanie jako pirolitycznych markerów jednostek monomerycznych charakterystycznych
dla feomelanin. Przydatność HMDS w analizie strukturalnej pigmentów feomelaninowych techniką pirolizy ogranicza ponadto jego niska stabilność termiczna.
Sample pyrolysis in the presence of a derivatizing reagent,
coupled with identification of the products formed by gas
chromatography/mass spectrometry, is the valuable technique for structural investigations of melanin pigments. In
the present study a silylating agent, hexamethyldisilazane
(HMDS), was applied for the first time for this purpose.
Synthetic pheomelanin obtained enzymatically from dopamine and cysteine, and benzothiazine and benzithiazole
being the standards of pheomelanin-type monomer units
were analyzed. It was found that pyrolysis and pyrolytic
in situ derivatization modes of structural subunits present
in the studied pheomelanin were completely different as
compared with the pure standards. Trimethylsilyl derivatives formed during pheomelanin pyrolysis in the presence of HMDS do not possess sulfur-containing heterocyclic rings, which makes them useless as the potent pyrolysis markers of the pheomelanin-type monomer units.
Thermal instability also limits the usefulness of HMDS as
a derivatizing agent in structural analysis of pheomelanin
pigments.
Keywords: pheomelanin, pyrolysis, GC/MS, derivatization, silylation, HMDS
Słowa kluczowe: feomelanina, piroliza, GC/MS, derywatyzacja, sililacja, HMDS
Wstęp
Piroliza połączona z chromatografią gazową i spektrometrią mas (Py-GC/MS) jest wartościową techniką badania
struktury pigmentów melaninowych, pozbawioną ograniczeń charakteryzujących metody oparte na degradacji chemicznej tych biopolimerów, takich jak słaba powtarzalność
czy niska wydajność powstających markerów eumelaninowych i feomelaninowych [1, 2]. Jednakże niektóre produkty
pirolizy mogą posiadać w swojej strukturze polarne grupy
funkcyjne (-COOH, =NH, -NH2 -OH, -SH), co znacznie
zmniejsza ich lotność utrudniając rozdział chromatograficzny. Ponadto związki takie są często adsorbowane na aktywnych powierzchniach wewnętrznych ścianek kolumny kapilarnej, co w połączeniu z niestabilnością termiczną i chemiczną może poważnie modyfikować wyniki analiz [3].
Niekorzystne właściwości chromatografowanych związków można poprawić na drodze derywatyzacji polegającej
na podstawieniu aktywnego atomu wodoru w grupach funkcyjnych innym ugrupowaniem, np. grupą metylową (metylacja), trimetylosililową lub tert-butylodimetylosililową
(sililacja) czy acylową (acylacja). W efekcie powstają mniej
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
polarne pochodne, które wykazują wyższą lotność i stabilność termiczną w porównaniu ze związkami macierzystymi.
Analizując strukturę polimeru techniką Py-GC i PyGC/MS, reakcję derywatyzacji można prowadzić przed,
w trakcie bądź po zakończeniu pirolizy [4]. Derywatyzacja
pre-pirolityczna polega na takiej modyfikacji grup funkcyjnych polimeru, która pozwala na osiągnięcie oczekiwanego
sposobu jego degradacji termicznej, co ułatwia analizę jakościową i ilościową. Derywatyzacja post-pirolityczna jest
prowadzona w celu polepszenia warunków rozdziału chromatograficznego i detekcji składników pirolizatu, nie wpływając na sposób degradacji. W pirolitycznej derywatyzacji
in situ odczynnik derywatyzacyjny jest obecny w trakcie
wykonywania pirolizy, dlatego powstające w tym przypadku
produkty są najprawdopodobniej efektem zarówno pre- jak
i post-pirolitycznych modyfikacji, co umożliwia pełniejszy
wgląd w strukturę analizowanego związku.
Jedynym odczynnikiem derywatyzującym zastosowanym dotychczas w analizie strukturalnej melanin jest metanolowy roztwór wodorotlenku tetrametyloamoniowego
(TMAH) [2, 5-7]. Wysoka skuteczność tego odczynnika
metylującego, wynikająca m.in. z jego silnie zasadowego
charakteru i aktywności hydrolitycznej nasilającej się w wysokiej temperaturze pozwoliła na równoczesną analizę niemelaninowych komponentów (lipidy, białka) związanych
z pigmentami melaninowymi izolowanych z naturalnych
źródeł, takich jak istota czarna mózgu człowieka [2, 5],
czerniak złośliwy skóry [6] czy hodowane ludzkie melanocyty naskórkowe [7].
Większość melanin naturalnych to kopolimery złożone z podjednostek strukturalnych typu eumelaninowego
i feomelaninowego. W świetle danych wskazujących na odmienne właściwości eumelanin (fotoprotekcja i aktywność
antyoksydacyjna) i feomelanin (fotosensybilizacja i aktywność prooksydacyjna) wydaje się, że wzajemny stosunek
obu typów podjednostek może w istotny sposób modyfikować fizjologiczną rolę pigmentów, zarówno epidermalnych,
jak i obecnych w ośrodkowym układzie nerwowym [8, 9].
Prowadząc pirolizę syntetycznych feomelanin w obecności
TMAH niejednokrotnie obserwowano zanik lub obniżenie
poziomu związków uważanych za pirolityczne markery podjednostek feomelaninowych w porównaniu z pirolizatami
otrzymanymi w nieobecności czynnika metylującego [dane
niepublikowane]. Może to świadczyć o nasilonej degradacji
monomerów tego typu pod wpływem hydrolitycznej aktywności TMAH. Dlatego zasadne wydaje się poszukiwanie
innych odczynników derywatyzujących, których zastosowanie mogłoby zwiększyć możliwości analityczne techniki
Py-GC/MS, zwłaszcza w zakresie identyfikacji komponentu
feomelaninowego w naturalnych biopolimerach melaninowych. W niniejszej pracy badano przydatność do tego celu
odczynnika wykazującego aktywność sililującą - heksametylodisilazanu (HMDS).
Materiał i metody
Otrzymywanie feomelaniny
Syntetyczną feomelaninę otrzymano w wyniku katalizowanej przez tyrozynazę (50 000 U, EC.1.14.18.1, 5350
U/mg Sigma) oksydacyjnej polimeryzacji dopaminy (2,5
mM, Sigma) i cysteiny (2,5 mM, Sigma) w 50 mM buforze
fosforanowym (pH 6,8). Mieszaninę reakcyjną inkubowano
intensywnie wytrząsając przez 72 godziny w temperaturze
37 oC bez dostępu światła. Precypitat melaniny zdekantowano i przemyto trzykrotnie wodą dejonizowaną. W celu usunięcia śladów enzymu, precypitat poddano inkubacji z SDS,
po czym przemyto 0,9 % NaCl i wodą dejonizowaną, a następnie poddano liofilizacji.
Pirolityczna derywatyzacja in situ
Porcje liofilizatu feomelaniny (ok. 1 mg) umieszczono
w cienkościennych kapilarach szklanych (długość 80 mm,
średnica wewnętrzna 1,1 mm), do których wprowadzono
następnie po 4μl HMDS. Po zatopieniu końcówek w płomieniu palnika, kapilary umieszczono na 2 minuty we wnętrzu pieca muflowego rozgrzanego do temperatury 500 oC.
W analogiczny sposób degradacji termicznej w obecności
i nieobecności HMDS poddano wzorzec strukturalnych
podjednostek feomelaninowych typu benzotiazynowego
(2H-1,4-benzotiazyno-3(4H)-on, Sigma; BT) i benzotiazolowego (2-hydroksybenzotiazol, Aldrich; HB). Przeprowadzono również pirolizę czystego odczynnika sililującego.
Po wyjęciu z pieca i osiągnięciu temperatury pokojowej,
wszystkie kapilary umieszczono na 12 godzin w temperaturze -20°C. Następnie obie zatopione końcówki każdej kapilary ostrożnie odłamano, a jej wnętrze przemyto heksanem
(2 porcje po 300 μl). Supernatanty pozostałe po odwirowaniu heksanowych ekstraktów (10000 g, 10 min) przeniesiono do szklanych fiolek i poddano analizie techniką GC/MS.
Warunki analizy GC/MS
Do analizy GC/MS zastosowano chromatograf gazowy
Agilent serii 6890 sprzężony ze spektrometrem mas Agilent Network 5973 i wyposażony w automatyczny podajnik
próbek firmy Agilent Technologies. Produkty pirolizy rozdzielano na kolumnie kapilarnej J&W HP5-MS (polidimetylosiloksan z 5% dodatkiem ugrupowań bifenylowych; długość: 60m, średnica wewnętrzna: 0,32mm, grubość filmu:
0,25μm). Wykorzystano dozownik typu „zimnego dozowania na kolumnę” (COC) z elektroniczną kontrolą ciśnienia.
Objętość nastrzyku wynosiła 1μl. Temperatura dozownika
w trybie pracy Track Oven była o 3oC wyższa niż temperatura pieca chromatograficznego. Zastosowano następujący
program temperaturowy pieca chromatograficznego: temperatura początkowa 40oC utrzymywana była przez 1min,
następnie wzrastała do 64oC z prędkością 4oC/min, po czym
następował dalszy wzrost temperatury z prędkością 5oC/min
aż do osiągnięcia temperatury końcowej 290oC, którą utrzymywano przez 8 min. Szybkość przepływu gazu nośnego
(hel) utrzymywano na stałym poziomie (2.6 ml/min) przez
całą analizę. Temperatura linii transferowej wprowadzającej
kolumnę chromatograficzną bezpośrednio do źródła jonów
spektrometru mas wynosiła 250°C. Produkty pirolizy jonizowano strumieniem elektronów o energii 70 eV. Temperatura źródła jonów w spektrometrze wynosiła 230oC, a analizatora kwadrupolowego 150oC. Spektrometr pracował
w trybie zbierania pełnego widma (full scan), monitorując
następujące wartości m/z: 29-200 od początku analizy do 7
minuty, 45-300 od 7 do 14 minuty oraz 45-550 powyżej 14
&ARM0RZEGL.AUK
Ryc.1. Profile pirolityczne benzotiazyny (BT) i hydroksybenzotiazolu (HB) otrzymane w obecności i nieobecności
odczynnika sililującego (HMDS).
minuty. Do zbierania i obróbki danych zastosowano oprogramowanie Enhanced ChemStation G1701CA ver.C.00.00
firmy Agilent Technologies, zaś do interpretacji zarejestrowanych widm mas- siódme wydanie biblioteki widm Wiley
oraz bibliotekę NIST/EPA 2008.
Wyniki i dyskusja
Pirolizę syntetycznej feomelaniny poprzedzono degradacją termiczną związków, których zasadniczym elementem strukturalnym jest heterocykliczny pierścień tiazyny
lub tiazolu skondensowany z pierścieniem benzenowym.
Jak wynika z badań prowadzonych między innymi techniką
Py-GC/MS, układy benzotiazyny i benzotiazolu są charakterystyczne dla jednostek monomerycznych występujących
w feomelaninach [1, 5, 7, 10]. Przeprowadzono także analizę czystego odczynnika sililującego w celu oceny jego odporności na zastosowaną temperaturę degradacji. Termostabilność stosowanych odczynników ma istotne znaczenie dla
prawidłowej interpretacji wyników pirolitycznej derywatyzacji in situ, prowadzonej zarówno techniką on-line (w pirolizerze połączonym bezpośrednio z kolumną chromatograficzną), jak i off-line (co zastosowano w niniejszej pracy).
W pirolizacie czystego HMDS wykryto liczne produkty
termicznego rozpadu odczynnika oraz związki o większych
masach cząsteczkowych będące efektem rekombinacji tych
produktów. Związki te, zidentyfikowane m.in. jako pochodne silanoaminy, stanowiły także istotny składnik pirolizatów
feomelaniny oraz wzorców feomelaninowych jednostek
monomerycznych.
Na rycinie 1 zestawiono profile pirolityczne wzorców monomerów typu feomelaninowego degradowanych
w obecności i nieobecności HMDS. W nieobecności odczynnika derywatyzującego sześcioczłonowy pierścień
heterocykliczny benzotiazyny BT degradował głównie do
pochodnych benzotiazolu z pięcioczłonowym pierścieniem
heterocyklicznym, lub ulegał rozerwaniu z wytworzeniem
pochodnych aniliny. Natomiast, gdy pirolizę benzotiazyny prowadzono w obecności HMDS, obok dominujących
w pirolizacie pochodnych benzotiazolu zidentyfikowano
pochodne trimetylosililowe (TMS) indolu, aminotiofenolu,
aminofenolu, benzoizotiazoloaminy i hydroksyindolu. Profil
pirolityczny hydroksybenzotiazolu HB również zależał od
Ryc. 2. Wzory strukturalne trimetylosililowych (TMS) pochodnych produktów pirolizy benzotiazyny i benzotiazolu
w obecności HMDS.
Tab. 1. Pochodne trimetylosililowe (TMS) otrzymane
w wyniku pirolizy wzorców jednostek monomerycznych
typu feomelaninowego w obecności HMDS
Czas
retencji
[min]
18,57
24,45
25,60
Pochodna
Charakterystyczne
wartości m/z
TMS-tiofenol
TMS-indol
TMS-benzotiazol
182, 167, 151, 73*
189*, 174, 73
207, 191*, 73
269, 254, 166,
27,96 N,S-di-TMS-2-aminotiofenol 73*
30,16 N,O-di-TMS-4-aminofenol 253, 238*, 73
N-TMS222, 207*
30,88 benzoizotiazoloamina
32,41 N,O-di-TMS-hydroksyindol 277, 262, 73
* pik główny
obecności odczynnika sililującego. Przy jego braku główne
produkty pirolizy stanowiły pochodne aniliny i benzotiazo-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
lu. Natomiast w obecności HMDS
dominowały pochodne TMS tiofenolu, benzotiazolu, aminotiofenolu,
aminofenolu i benzoizotiazoloaminy. Otrzymane w obecności HMDS
pochodne TMS charakterystyczne
dla wzorców jednostek monomerycznych typu feomelaninowego
zestawiono w tabeli 1. Są to zarówno zawierające siarkę produkty derywatyzacji związków powstałych
w wyniku rozerwania pierścienia
heterocyklicznego, jak i pochodne zawierające pozbawiony siarki
lub nienaruszony pierścień heterocykliczny (Ryc.2). Świadczy to
o wysokiej skuteczności derywatyRyc.3. Chromatogram produktów pirolizy syntetycznej feomelaniny w obecności
zacyjnej HMDS w odniesieniu do
HMDS. Linią przerywaną zaznaczono pirogram czystego odczynnika derywatyzuanalizowanych wzorców.
jącego.
Przykładowy pirogram feomelaniny degradowanej w obecności HMDS w zestawieniu
z chromatogramem produktów termicznej degradacji czystego odczynnika sililującego przedstawiono na rycinie 3.
W pirolizacie melaniny nie stwierdzono obecności charakterystycznych produktów degradacji jednostek feomelaninowych, które wykrywano prowadząc pirolizę pigmentu w nieobecności czynnika derywatyzującego [1, 2, 5]. Produktów
pirolitycznej sililacji in situ eluowanych pomiędzy 26 a 36
minutą nie udało się zidentyfikować. Natomiast intensywne
piki widoczne na chromatogramie pomiędzy 10 a 24 minutą
zidentyfikowano jako pochodne TMS i zestawiono w tabeli
2. Jak widać, są to produkty zupełnie inne, niż te wykrywane
w pirolizatach wzorców. Żaden z nich nie posiada pierścienia heterocyklicznego charakterystycznego dla monomerów
typu feomelaninowego, a jedynym produktem zawierającym
siarkę jest pochodna diTMS siarkowodoru (Ryc. 4).
Wnioski
Ryc.4. Wzory strukturalne trimetylosililowych (TMS) pochodnych produktów pirolizy syntetycznej feomelaniny
w obecności HMDS.
Uzyskane wyniki wskazują, że sposób termicznej degradacji oraz pirolitycznej sililacji in situ jednostek monomerycznych syntetycznej feomelaniny otrzymanej z dopaminy
i cysteiny jest inny, niż czystych wzorców typu benzotiazynowego i benzotiazolowego. Pochodne TMS powstające
w wyniku pirolizy feomelaniny w obecności HMDS nie
zawierają heterocyklicznego pierścienia tiazyny lub tiazolu. Niespecyficzna budowa tych pochodnych uniemożliwia
ich wykorzystanie jako pirolitycznych markerów jednostek
Tab. 2. Pochodne trimetylosililowe (TMS) wykryte w pirolizacie syntetycznej feomelaniny degradowanej termicznie
w obecności HMDS
Czas
retencji [min]
10,15
13,39
16,14
20,33
21,28
23,25
* pik główny
Pochodna
di-TMS-siarkowodór
TMS-fenol
TMS-4-metylofenol
O-TMS-2-aminofenol
di-TMS-1,2-benzenodiol
di-TMS-4-metylo-1,2-benzenodiol
% sumarycznej
powierzchni pików
0,64
0,80
1,14
2,52
2,30
1,84
Charakterystyczne
wartości m/z
178, 163*, 73
166, 151*
180,165*, 91
181, 166*, 150, 135, 73
254, 139, 73*
268, 73*
&ARM0RZEGL.AUK
monomerycznych charakterystycznych dla feomelanin.
Przydatność HMDS w analizie strukturalnej pigmentów feomelaninowych techniką pirolizy ogranicza ponadto niska
stabilność termiczna tego odczynnika sililującego.
Pracę wykonano w ramach tematu badawczego
nr KNW-2-019/09 finansowanego przez Śląski Uniwersytet
Medyczny w Katowicach
Piśmiennictwo
1. Dzierżęga-Lęcznar A i wsp. Pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry of synthetic neuromelanins. J
Anal Appl Pyrolysis 2002; 62: 239-248.
2. Dzierżęga-Lęcznar A i wsp. GC/MS analysis of thermally degraded neuromelanin from the human substantia nigra. J Am Soc Mass Spectrom 2004; 15:
920-926.
3. Sobeih KL, Baron M, Gonzalez-Rodriguez J. Recent
trends and developments in pyrolysis-gas chromatography. J Chromatogr A 2008; 1186: 51-66.
data otrzymania pracy: 29.11.2010 r.
data akceptacji do druku: 21.12.2011 r.
Adres do korespondencji:
dr n. biol. Anna Dzierżęga-Lęcznar
Tel.: +48 32 364 10 54
e-mail: [email protected]
4. Wang F Ch-Y. Polymer analysis by pyrolysis gas chromatography. J Chromatogr A 1999; 843: 413-423
5. Dzierżęga-Lęcznar A i wsp. Structural investigations of
neuromelanin by pyrolysis-gas chromatography/mass
spectrometry. J Neural Transm 2006; 113: 729-734.
6. Chodurek E i wsp. Thermochemolysis as the useful method to assess the purity of melanin isolated from the
human melanoma malignum. Acta Pol Pharm-Drug Res
2008; 65 (6): 531-534.
7. Stępień K i wsp. Melanin from epidermal human melanocytes: study by pyrolytic GC/MS. J Am Soc Mass
Spectrom 2009; 20: 464-468.
8. Brenner M, Hearing VJ. The protective role of melanin
against UV damage in human skin. Photochem Photobiol 2008; 84: 539-549.
9. Takeuchi S i wsp. Melanin acts as a potent UVB photosensitizer to cause an atypical cell death in murine skin.
Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101:15076-15081.
10. Napolitano A i wsp. The “benzothiazine” chromophore
of pheomelanins: a reassessment. Photochem Photobiol
2008; 84: 593-599.