Białka rekombinowane i ukierunkowana mutageneza (2011/2012)
Transkrypt
Białka rekombinowane i ukierunkowana mutageneza (2011/2012)
INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015) Instrukcja do ćwiczenia nr 8 Produkcja rekombinowanej beta-laktoglobuliny w komórkach bakterii E. coli CEL Uzyskanie rozpuszczalnej formy białka BLG B (mutanty L1AI2S i L1AI2SV92F). ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA 1) Jaką funkcję pełni izomeraza wiązań disiarczkowych DsbC w komórkach bakterii. 2) Rola poszczególnych sekwencji DNA obecnych w wektorze ekspresyjnym pETDuet-1, w tym genu dsbC. MATERIAŁY WEKTORY pET DUET-1/dsbC/blgBI1AL2S pET DUET-1/dsbC/blgBI1AL2SV92F SZCZEPY BAKTERYJNE Origami B (DE3) ODCZYNNIKI płynna pożywka LB IPTG antybiotyki: ampicylina, kanamycyna, tetracyklina SPRZĘT LABORATORYJNY inkubator z wytrząsaniem, grzaniem i chłodzeniem komora laminarna spektrofotometr pipety automatyczne kuwety plastikowe do pomiarów gęstości optycznej zawiesiny bakterii wirówki waga laboratoryjna 1 INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015) WYKONANIE ĆWICZENIA Ze względu na długi czas prowadzenia hodowli bakteryjnej, poszczególne grupy będą wykonywać tylko wybrane elementy z całej procedury podanej w instrukcji. UWAGA! W miarę możliwości zakładanie hodowli bakteryjnych oraz pobieranie próbek hodowli do pomiarów OD powinno się odbywać w komorze laminarnej. I. Przygotować: 4,5 litra płynnej pożywki LB (skład: NaCl – 45 g, ekstrakt drożdżowy – 22,5 g, pepton – 45 g, 4,5 l wody demineralizowanej, roztwór zautoklawować), po 4,5 ml stężonych roztworów antybiotyków (ampicylina – 100 mg/ml, kanamycyna – 15 mg/ml, tetracyklina – 12,5 mg/ml), 4 ml tysiąc razy stężonego roztworu IPTG (0,5M), 4 sterylne kolby szklane o objętości 3 l. Po przygotowaniu roztwory antybiotyków i IPTG należy przechowywać w temp. - 20°C. II. Dzień przed planowaną dużą hodowlą założyć 4 tak zwane hodowle-matki, czyli z szalki, na której rosną komórki E. coli ze szczepu Origami B (DE3) stransformowane wektorem pETDUET-1/dsbC/blgBI1AL2S (lub pETDUET1/dsbC/blgBI1AL2SV92F) pobrać przy pomocy sterylnej końcówki pojedynczą kolonię, a następnie końcówkę umieścić w kolbie zawierającej 50 ml pożywki LB z antybiotykami (końcowe stężenie antybiotyków: ampicylina – 100 µg/ml, kanamycyna – 15 µg/ml, tetracyklina – 12,5 µg/ml). Prowadzić hodowlę przez noc, w temperaturze 37°C w łaźni wodnej lub w inkubatorze z wytrząsaniem. III. W dniu hodowli do sterylnych kolb (obj. 3 l) przelać 1 litr ciepłej pożywki LB, dodać antybiotyki (końcowe stężenie antybiotyków: ampicylina – 100 µg/ml, kanamycyna – 15 µg/ml, tetracyklina – 12,5 µg/ml) a następnie 50 ml całonocnej hodowli-matki. IV. Przygotować 2 kuwety plastikowe, jedną podpisać przy górnej krawędzi REF a drugą KOM. Do pierwszej kuwety nalać 2 ml pożywki LB z antybiotykami a do drugiej (po wcześniejszym wymieszaniu zawiesiny), pobrać 2 ml świeżo założonej dużej hodowli. V. Kolby z dużymi hodowlami (podpisane A, B, C i D) umieścić w inkubatorze o temperaturze 37°C i włączyć wytrząsanie (ok. 150 obr./min). VI. Włączyć spektrofotometr, uruchomić program OD600, wyzerować aparat używając jako referencji pożywki z antybiotykami, następnie zmierzyć gęstość optyczną jednej z założonych dużych hodowli (A, B, C lub D). Pomiar powtórzyć trzykrotnie, w notatkach obok wyniku zapisać godzinę pomiaru. Po zakończeniu pomiaru wylać zawartość kuwety podpisanej KOM do czerwonego pojemnika na odpady biologiczne. VII. Co około 20 minut powtarzać pomiar gęstości optycznej w celu monitorowania tempa wzrostu hodowli (do pomiaru należy za każdym razem pobierać próbkę z tej samej kolby). Próbki należy pobierać w warunkach jałowych pamiętając o dokładnym wymieszaniu zawiesiny. Po pobraniu próbki kolbę z hodowlą bakteryjną należy natychmiast umieścić na powrót w inkubatorze. VIII. Gdy gęstość zawiesiny bakterii osiągnie wartość OD600 około 1 należy: a) pobrać 1 ml hodowli do miniprobówki o objętości 1,5 ml i podpisać wg wzoru: dzień tygodnia, symbol kolby (A, B, C lub D), PI, komórki bakteryjne zwirować (6000 obr/min, 3 min), nadsącz wylać a osad zamrozić w temp. -20°C. UWAGA! Zamrożone próbki zostaną na kolejnych ćwiczeniach poddane elektroforezie w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) w celu uzyskania profilu ekspresji rekombinowanego białka. b) do kolb z dużą hodowlą dodać stężony IPTG (końcowe stężenie induktora powinno wynosić 0,5 mM), kolby umieścić w inkubatorze i zwiększyć tempo wytrząsania do około 400 obrotów na minutę. 2 INŻYNIERIA BIAŁEK I (2014/2015) IX. Po zaindukowaniu ekspresji należy co godzinę sprawdzać gęstość hodowli. Równolegle, za każdym razem, do przygotowanej wcześniej miniprobówki należy pobrać 1 ml płynnej hodowli do zamrożenia. Kolejne próbki z osadem bakterii należy podpisywać wg wzoru: dzień tygodnia, symbol kolby (A, B, C lub D), liczba godzin po indukcji. X. Po czterech godzinach od indukcji zakończyć prowadzenie hodowli. Zawartość kolb przelać do 6 gilz wirowniczych (poj. ok. 400 ml), gilzy podpisać symbolem kolby i dobrze zrównoważyć. Zwirować bakterie (10 min., 6000 obr./min, 4°C). W międzyczasie zważyć probówkę o obj. 50 ml, wynik pomiaru zanotować. Po zwirowaniu hodowli wylać większość nadsączu i zawiesić osad bakterii w pozostałych 10-15 ml płynu hodowlanego. Zawiesinę z sześciu gilz przelać do zważonej probówki o obj. 50 ml. Ponownie zwirować bakterie (10 min., 6000 obr./min, 4°C). Po zwirowaniu starannie usunąć cały nadsącz, po raz kolejny zważyć probówkę i na podstawie uzyskanego wyniku obliczyć masę mokrego osadu bakterii uzyskanego z jednego litra płynnej hodowli. Wynik zapisać na probówce. Dodatkowo na probówce umieścić następujące informacje: dzień tygodnia i nazwa białka rekombinowanego (BLG B I1AL2S lub BLG B I1AL2SV92F). Tak przygotowany osad zamrozić w temp. –20°C. WYTYCZNE DO SPRAWOZDANIA NR 3 Sprawozdania powinno zawierać: a. skrócony opis przebiegu doświadczenia, a dokładniej – tylko tej jego części, która została faktycznie wykonana na ćwiczeniach (maksymalnie pół strony formatu A4); b. wykres zależności wartości OD600 od czasu – na wykresie, o ile je zaobserwowano, należy zaznaczyć poszczególne fazy wzrostu hodowli bakteryjnej (np. adaptacyjna, wzrostu wykładniczego, równowagi, zamierania) oraz moment indukcji (dane do sporządzenia wykresu zostaną udostępnione na stronie kursu w arkuszu programu Excel); c. odpowiedź na pytanie wylosowane w czasie ćwiczeń. 3