Metody przeżyciowego barwienia i obserwacji komórek

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Biologia komórki
Metody przeżyciowego barwienia i obserwacji komórek
WSTĘP
Postęp w syntezie chemicznej fluorochromów a zwłaszcza dalsze ulepszanie
konstrukcji mikroskopów świetlnych pozwala dziś śledzić wiele z procesów
komórkowych bezpośrednio w żywej komórce i w czasie rzeczywistym. Pomagają w
tym również dynamicznie rozwijające się nowe metody akwizycji i obróbki obrazu w celu
polepszenia czułości i ostrości uzyskiwanych w mikroskopii obrazów. Ćwiczenie to ma
na celu zapoznanie się częściowo w praktyce a częściowo w ramach pokazu z
niektórymi zastosowaniami mikroskopii fluorescencyjnej do badania żywych komórek.
Fluorescencyjna mikroskopia konfokalna
Zasadnicza różnica pomiędzy tradycyjną mikroskopią w świetle białym i
fluorescencyjnym polega na stosowaniu w tym drugim przypadku światła z
ograniczonego zakresu widma (uzyskanego przy użyciu wąskopasmowych filtrów
optycznych) bądź w skrajnym przypadku światła o jednej długości fali (przy
zastosowaniu światła laserowego).
Rysunek przedstawia w sposób uproszczony schematy działania mikroskopu
konwencjonalnego i konfokalnego. Lewa część rysunku przedstawia schematycznie
konwencjonalny (szerokopolowy) mikroskop, w którym obiekt jest oświetlany na dużej
przestrzeni przez źródło światła białego, ogniskowanego przez kondensor. W
zależności od położenia oświetlanej części obiektu jego obraz znajduje się z różnym
miejscu w stosunku do płaszczyzny ostrości. Obraz obiektu w okularze (lub kamerze)
jest sumą wszystkich składowych obrazu z różnych miejsc obiektu i jest z tego względu
tylko częściowo ostry, co jest z kolei zależne od głębi ostrości obiektywu. W
mikroskopie konfokalnym (prawa część rysunku) wprowadzono dwie przysłony: między
obiektem a źródłem światła w celu ograniczenia oświetlanego pola obrazu oraz przed
detektorem, który ogranicza światło docierające do detektora wyłącznie do tej jego
części, która pochodzi z punktów pochodzących z płaszczyzny ostrości obiektywu.
Barwniki specyficzne do DNA.
Poza grupą barwników używanych w testach biochemicznych i barwienia żeli, istnieje
coraz szersza grupa barwników używanych do wybarwiania DNA w żywych komórkach.
Najczęściej używane to pochodne bis-benzoimidazolowe (barwniki Hoechst 33258 i
33342), pochodne akrydyny (oranż akrydynowy). Związki te różnią się długością fali
światło emitowanego po związaniu się z DNA ale także często długością fali
wzbudzenia (wzbudzenie w świetle UV lub widzialnym).
H3C
H
H
+
N
N
N
+
N
H
H
N
+
R
N
H
Hoechst 33342
R=OCH2CH3
Hoechst 33258
R=OH
Struktury chemiczne barwników Hoechst
Wykorzystywane są również barwniki, które nie przechodzą przez błonę komórkową w
związku z czym barwią wyłącznie komórki z uszkodzoną błoną komórkową (w założeniu
martwe). Można więc przy stosowaniu dwóch barwników o różnych długościach fali
emitowanego światła, z których tylko jeden barwi żywe a drugi żywe i martwe komórki,
określać procentowy udział poszczególnego rodzaju komórek w populacji.
Można również wykorzystywać aktywność esteraz w cytoplazmie (zamieniających np.
kalceinę-AM we fluorescencyjną pochodną barwiącą cytoplazmę na kolor zielony) w
połączeniu z barwnikami barwiącymi DNA komórek z uszkodzoną błoną komórkową
(np. homodimer bromku etydyny barwiący martwe komórki na kolor pomarańczowoczerwony). Testy żywotności komórek jednokomórkowców a zwłaszcza drożdży oparte
są na innej zasadzie i polegają na zastosowaniu barwnika FUN-1 zmieniającego kolor w
komórkach żywych z żółto-zielonego na pomarańczowo-czerwony.
Barwienie organelli komórkowych
Istnieje wiele barwników specyficznie barwiących organelle w żywych komórkach. Ich
zastosowanie pozwala na śledzenie zmian morfologii i funkcjonalności (w połączeniu z
innymi typami testów np. enzymatycznych) organelli w komórkach poddanych działaniu
leków, pochodzących od chorych itp.
Komórki nerki psa wybarwione Bodipy FLC5-ceramid, kolor zielony (aparat Golgiego),
LysoTracker Red, kolor czerwony (lizosomy), Hoechst 33258, kolor niebieski (jądro
komórkowe).
Komórki tętnicy płuc wołu barwione LysoTracker Red, kolor czerwony (lizosomy),
MitoTracker Green FM, kolor zielony (mitochondria).
Zmiany w potencjale błon komórkowych
Błony mogą poprawnie funkcjonować w komórce jedynie gdy utrzymywany jest na nich
potencjał elektryczny. Najwyższy taki potencjał jest na błonie wewnętrznej
mitochondriów i istnieje duża grupa fluorochromów wiążących się specyficznie z
błonami mitochondriów i zmieniających długość fali emitowanego światła w zależności
od wielkości potencjału błonowego. Takie barwniki stosowane są w badaniach stanu
metabolizmu mitochondriów (np. przy określaniu zmian w żywotności komórek) czy w
sytuacji gdy komórki umierają w wyniku uruchomienia procesu apoptozy gdyż w tym
przypadku jednym z wczesnych etapów śmierci komórkowej jest spadek potencjału
błonowego mitochondriów.
Komórki fibroblastów mysich NIH/3T3, spadek potencjału po traktowaniu nadtlenkiem
wodoru przez podany czas. Barwienie związkiem JC-1, zmiana koloru z
pomarańczowego na zielony świadczy o spadającym potencjale na błonie
mitochondriów.
Pomiar pH wewnątrz komórki
Istnieje grupa bardzo użytecznych fluorochromów służących do pomiaru za pomocą
analizy obrazu mikroskopowego wartości pH wewnątrz żywej komórki. Wartości pH
wewnątrz komórki wahają się w zakresie od 5 do 8 stąd na różne zakresy pH stosuje
się różne barwniki. Najczęściej używane to: barwniki SNARF (zakres pH 7-8), BCECF
(zakres pH 6.5-7.5), barwniki LysoSensor (zakres pH 3.5-8.0).
Najczęściej pomiar pH za pomocą fluorochromów opiera się na zasadzie
racjometrycznej gdzie mierzy się jednocześnie fluorescencję przy dwóch różnych
długościach fali i stosunek wielkości sygnałów fluorescencji związany jest z określonym
pH wewnątrz komórki. W badaniach tych wykonuje się zwykle skalowanie danego
układu komórkowego poprzez wyznaczanie krzywych wzorcowych z użyciem komórek
permeabilizowanych za pomocą jonoforów (zwykle nigerycyna) i tzw. fizjologicznych
buforów o znanych wartościach pH.
Rozwinięciem metod pomiaru pH wewnątrz komórki z użyciem fluorochromów jest
zastosowanie tzw. mikrospektrofluorymetrii, która jest połączeniem mikroskopu i
spektroskopu luminescencyjnego. Po wybarwieniu fluorochromami komórek można za
pomocą mikrospektrofluorymetru mierzyć widma fluorescencyjne w małych przekrojach
subkomórkowych i mierzyć w ten sposób np. wartości pH w różnych obszarach komórki
(jądro, pęcherzyki aparatu Golgiego, siateczki śródplazmatycznej, pojedyncze lizosomy
itp.).
Obecność reaktywnych form tlenu w komórce
W szeregu procesach komórkowych, zarówno fizjologicznych jak i patologicznych,
produkowanych jest wiele różnych rodzajów reaktywnych form tlenu. Należą do nich
.
tlen singletowy (1O2), rodnik hydroksylowy (OH ), różnego rodzaju nadtlenki (ROOR’) i
wodoronadtlenki (ROOH). Istnieje wiele barwników pozwalających wykrywać ich
zawartość w komórce. Są one utleniane przez te formy tlenu co wiąże się ze zmianą
własności fluorescencyjnych. Do częściej używanych fluorochromów służących do
wykrywania wolnych rodników tlenowych to: estry dichlorodihydrofluoresceiny (np.
H2DCFFDA), dihydrorodamina 123, dihydroetydyna (hydroetydyna).
Ekspresja białek fluorescencyjnych (GFP, RFP, YFP, BFP)
Szczególnie popularnym staje się w ostatnich latach stosowanie ekspresji indukowanej
białek zawierających sekwencje fluoryzujące w kolorze niebieskim (BFP), zielonym
(GFP), żółtym (YFP) czy czerwonym (DsRed).
Widma wzbudzenia i emisji różnych typów białek fluorescencyjnych.
Ekspresja białek zawierających sekwencje fluorescencyjne pozwala śledzić zmiany w
lokalizacji białek w różnych fazach cyklu komórkowego, interakcję z innymi białkami
(przy zastosowaniu jednoczesnej ekspresji białek o sekwencjach fluoryzujących w
różnych zakresach długości fali emisji). W tym drugim przypadku wykorzystuje się też
często dodatkowo zjawisko tzw. fotowybielania (gaszenie sygnału fluorescencji) za
pomocą wiązki laserowej co pozwala określić dynamikę zmian w lokalizacji danego
białka. Zastosowanie białek fluorescencyjnych wraz z wysokorozdzielczą mikroskopią i
techniką FRET (ang. fluorescence resonance emission transfer czyli rezonansowe
przeniesienie sygnału emisji fluorescencji) pozwala obserwować oddziaływania
pomiędzy pojedynczymi cząsteczkami białek w żywych komórkach.
Komórki chomika CHO-K1 z ekspresją wektora kodującego GFP (obserwacja
mikroskopowa 72h po transfekcji, fluorescencja w kolorze zielonym).
PRZEBIEG ĆWICZENIA
Ze względu na ograniczenia sprzętowe ćwiczenie ma charakter pokazowy i ma na celu
zapoznanie studentów z technikami obserwacji funkcji żywych komórek za pomocą
technik mikroskopii fluorescencyjnej a w szczególności:
1) poznanie działanie mikroskopu fluorescencyjnego i układu analizy obrazu
2) prowadzenie obserwacji organelli (jądro, mitochondria, aparat Golgiego, ER)
SPRAWOZDANIE
Proszę znaleźć w literaturze np. w ksiązkach, Internecie itp. ciekawe zastosowanie
mikroskopii fluorescencyjnej i opisać je w sprawozdaniu z podaniem źródła zdobytych
informacji. Opis powinien w sposób krótki ale zrozumiały przedstawiać to zastosowanie
z uwzględnieniem zasady, wykonania i zastosowań praktycznych opisywanej techniki.
Zawarte w instrukcji fotografie pochodzą z materiałów firmy Molecular Probes Inc
(Eugene, OR, USA) dostępnych na stronie internetowej www.probes.com