Hemolizyny bakteryjne - Wiki

Radosław Stachowiak i Jacek Bielecki
Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski
00-267 Warszawa, Nowy Świat 67.
Hemolizyny bakteryjne
1. Wstęp. 2. Właściwości fizyczne i biochemiczne. 3. Regulacja aktywności. 4. Molekularny
mechanizm działania. 5. Efekty działania toksyn na żywe komórki. 6. Udział w patogenezie.
7. Zastosowanie. 8. Podsumowanie.
Bacterial hemolysins
1. Introduction. 2. Physical and biochemical properties. 3. Regulation of activity. 4. Molecular
mechanism of action. 5. Effects of toxins action upon living cells. 6. Role in pathogenesis. 7.
Applications. 8. Summary.
Abstract
Hemolysins also known as cytolysins are a group of pore-forming proteins capable of
disruption of eucariotic cell’s membrane. This group consists of the following families: the
largest one is called thiol-activated hemolysins and includes toxins produced by a variety of
Gram-positive bacteria. The second family named RTX toxins is also well known. All
members of this family are secreted by Gram-negative bacteria. The rest of hemolysins are
grouped in smaller and recently formed families. Two of them include proteins produced by
micro-organisms that belong to only one genus: Serratia and Vibrio. The last of the revised
types is β-barrel family. Proteins with this characteristic structural motif can be found in both
Gram-positive and Gram-negative bacteria. Every type has some unique biochemical and
physical properties. Despite these differences all cytolysins have one thing in common.
Although they differ in molecular mechanism of cytolysis all hemolysins share the same
mode of action. Process of lysis is two-phased: the first step is independent from
environmental conditions required for full cytolytic activity, that is toxin association with cell
surface. The second phase is a major step of cytolysis strongly relaying on proper biochemical
conditions. These biochemical conditions are needed for correct changes of protein
conformation leading to polymerisation and pore formation. Discussed proteins are not only
capable of cytolysis. They also possess the ability to influence functioning of host’s defence
system. Evasion of immune response is a great opportunity for pathogen.
1. Wstęp
1
Hemolizyny są egzotoksynami zdolnymi do tworzenia por w błonie komórek
eukariotycznych. Jednak na wstępie należy zaznaczyć, że określenie hemolizyny jest niezbyt
precyzyjne, ponieważ sugeruje, że białka te są zdolne jedynie do lizy erytrocytów.
Tymczasem hemolizyny są toksynami o małej specyficzności, zdolnymi do uszkadzania
większości komórek eukariotycznych. Dlatego też właściwsza jest druga nazwa tej rodziny
białek, cytolizyny. Określenie hemolizyny pochodzi od najbardziej charakterystycznej
aktywności biologicznej tych toksyn, dzięki której zostały odkryte. Liza erytrocytów jest
nadal najłatwiejszym i najpowszechniej stosowanym sposobem wykrywania i badania
aktywności hemolizyn i jest też jedną z niewielu właściwości wspólnych dla wszystkich
białek z tej rodziny. Dlatego też ta grupa białek jest nadal najczęściej nazywana
hemolizynami, chociaż w świetle obecnej wiedzy na temat ich wpływu na żywe komórki,
nazwa ta odnosi się raczej do ich właściwości spotykanych w laboratorium.
Początkowe trudności w zrozumieniu mechanizmu działania hemolizyn wynikały ze
słusznego poza tym przypadkiem stwierdzenia, że białka rozpuszczalne mają hydrofilną
powierzchnię i hydrofobowy rdzeń. Białka transbłonowe natomiast cechują się niepolarną
powierzchnią dzięki której mogą funkcjonować we wnętrzu błon cytoplazmatycznych. Zatem
należało wyjaśnić w jaki sposób rozpuszczalne białko może dokonać penetracji pozornie dla
niego niedostępnej błony? Odpowiadając na to pytanie poznano przyczyny tego zjawiska.
Polega ono na tym, że monomeryczne, hydrofilne białko zmienia swoją konformację tworząc
polimeryczne układy o hydrofobowej naturze. Pierwszymi odkrytymi białkami zdolnymi do
tworzenia por w błonie były składniki układu dopełniacza. Dzięki temu przełomowemu
odkryciu zaczęto szukać innych białek o podobnym mechanizmie działania, po czym wkrótce
stwierdzono podobne właściwości dla hemolizyny bakteryjnej, α-toksyny Staphylococcus
aureus.
Większość hemolizyn jest wytwarzana przez bakterie Gram-dodatnie, głównie przez
bakterie należące do rodzin Bacillaceae, Streptococcaceae i Lactobacillaceae [1, 9, 18, 55,
56]. Prawie wszystkie cytolizyny bakterii Gram-dodatnich należą do najliczniejszej i wciąż
powiększającej się rodziny hemolizyn aktywowanych przez grupy tiolowe. Grupa ta jest
reprezentowana przez streptolizynę, toksynę Streptococcus pyogenes. Warto również
wymienić hemolizynę Clostridium perfringens, nazwaną jak większość białek z tej grupy od
nazwy gatunkowej bakterii z której pochodzi, perfringolizyną. Jest ona również dobrze
opisana zarówno pod względem strukturalnym jak i funkcjonalnym i wraz z streptolizyną
stanowi model do badań nad mechanizmem działania tej grupy cytolizyn. α-toksyna S.
2
aureus nie należy do hemolizyn aktywowanych przez grupę SH, i jak się okazało prezentuje
nie tylko odmienne właściwości biochemiczne, ale również inny mechanizm perforacji błon
cytoplazmatycznych. Do niedawna uważano ją za unikalną cytolizynę bakterii Gramdodatnich, która nie należy do rodziny hemolizyn aktywowanych przez ugrupowania tiolowe.
Jednak po dokładnym poznaniu struktury α-toksyny S. aureus [59] okazało się, że jest ona
podobnie zbudowana
jak aerolizyna, toksyna Aeromonas hydrophila. Obie wyżej
wspomniane cytolizyny zawierają domenę strukturalną przypominającą wyglądem beczkę,
nazywaną β−baryłką. Od tej charakterystycznej domeny strukturalnej powstała nazwa dla
nowo utworzonej rodziny β−baryłek. Do tej rodziny należą też prawdopodobnie α−toksyna
Clostridium septicum oraz cytotoksyna Pseudomonas aureginosa [59]. Zatem α-toksyna S.
aureus nie jest pojedynczym przypadkiem, lecz członkiem niewielkiej rodziny, która
prawdopodobnie będzie się powiększać wraz z poznawaniem kolejnych struktur cytotoksyn.
Warto zaznaczyć, iż rodzina β−baryłek jest jedyną, do której przyporządkowano cytolizyny
wytwarzane zarówno przez bakterie Gram-dodatnie jak i Gram-ujemne. Poza tą grupą
rozgraniczenie to w przypadku hemolizyn nadal obowiązuje, ponieważ większość cytolizyn
bakterii Gram-ujemnych tworzy dość jednorodną rodzinę toksyn RTX. Nazwa ta jest skrótem
od angielskiego określenia toksyny z powtórzeniami (ang. repeats in toxin), ponieważ
charakterystyczną cechą tych białek są właśnie powtórzenia w sekwencji aminokwasów.
Grupa ta jest reprezentowana przez hemolizynę E. coli, doskonale scharakteryzowaną pod
względem genetycznym. Natomiast budowa i mechanizm perforacji błony komórkowej tej
grupy toksyn nie jest zbyt dobrze poznany, w odróżnieniu od pozostałych rodzin cytolizyn.
Toksyny RTX są wytwarzane również przez bakterie z rodzajów; Pasteurella, Actinobacillus,
Bordetella, Proteus i Morganella [3, 28, 39, 66]. Wśród hemolizyn bakterii Gram-ujemnych
wyróżnia się jeszcze dwie pomniejsze rodziny. Pierwszą z nich stanowią cytolizyny
syntetyzowane przez Vibrio sp [15, 31, 34, 68]. Najlepiej scharakteryzowana są toksyny
produkowane przez V. cholerae. Biotyp El Tor (należący do serotypu O1) wydziela
cytolizynę nazwaną odpowiednio El Tor. Natomiast niecholeragenne szczepy V. cholerae
wytwarzają cytolizynę określaną w skrócie VCC. Do hemolitycznych gatunków należą także
V. parahaemolyticus oraz V. vulnificus. Hemolizyna Serratia marcescens reprezentuje
ostatnią z omawianych rodzin [8]. Podobnie jak w poprzednim przypadku, ta rodzina składa
się z hemolizyn wytwarzanych przez bakterie należące do tylko jednego rodzaju.
Występowanie cytolizyn nie jest ograniczone wyłącznie do bakterii. Znajdujemy coraz to
nowe hemolizyny wytwarzane przez organizmy eukariotyczne, nawet przez zwierzęta
3
kręgowe. Posiadają one inne właściwości biochemiczne i zapewne odmienny mechanizm
działania i chociaż ich wytwarzanie jest niewątpliwie ciekawym zjawiskiem, nie stanowią
przedmiotu niniejszego opracowania.
2. Właściwości fizyczne i biochemiczne
Rodzina hemolizyn aktywowanych przez grupy tiolowe jest najliczniejsza ze
wszystkich opisanych. Pomimo swej liczebności cechuje się dużą jednorodnością. Najbardziej
charakterystyczną właściwością tej grupy jest wzrost aktywności w wyniku kontaktu z
odczynnikami redukującymi zawierającymi grupę SH [25]. Do takich związków należą
cysteina i β-merkaptoetanol. Hemolizyny aktywowane przez grupy tiolowe zawdzięczają
swoją nazwę cysteinie, zawsze obecnej w cząsteczce białka omawianej rodziny. Ten właśnie
aminokwas zawierający grupę SH w formie zredukowanej był uznawany za czynnik
aktywujący toksynę. Obecnie wiadomo, że obecność grupy SH nie jest tak istotna dla
aktywności cytolizyn z tej rodziny (problem zostanie szczegółowo omówiony w dalszej
części rozdziału). Jednak nazwa-hemolizyny aktywowane przez grupy tiolowe-jest nadal
stosowana. Tlen i kationy dwuwartościowe są inhibitorami tych cytolizyn [65]. Hemolizyny z
tej rodziny posiadają zdolność tworzenia trwałych kompleksów z cholesterolem, oraz z blisko
spokrewnionymi sterolami. Stereospecyficzność tej interakcji jest wysoka, ponieważ
większość modyfikacji w cząsteczce cholesterolu uniemożliwia połączenie z hemolizyną. Ta
właściwość wpływa na specyficzność cytolizy. Jedynie komórki zawierające cholesterol w
błonie cytoplazmatycznej ulegają lizie [25]. Hemolizyna przyłącza się do cholesterolu
zawartego w błonie komórki, po czym polimeryzuje tworząc pory. Błony komórek
bakteryjnych nie zawierają lipidów rozpoznawanych przez cytolizyny. Zapewnia im to
odporność na toksyny, które same wydzielają. Hemolizyny są zdolne do wiązania steroli bez
względu na to, czy są one zintegrowane z błoną, czy też są rozpuszczone. Dlatego też
inkubacja cytolizyn z cholesterolem powoduje trwałą inhibicję toksyny [1]. Wspólną
właściwością dla prawie wszystkich hemolizyn jest termolabilność. W temperaturze powyżej
45oC następuje ich szybka i nieodwracalna inaktywacja. Masa cząsteczkowa białka
monomerycznego hemolizyn z tej grupy waha się od 50 do 80 kDa. Różnice w masie
wynikają przede wszystkim ze zmiennej długości amino-terminalnego regionu tych białek.
Analiza 450 aminokwasów licząc od C-końca ujawnia bardzo dużą homologię sekwencji, od
40 do 70%. Właśnie w karboksy-terminalnym regionie znajduje się wysoce konserwatywny
undekapeptyd o sekwencji ECTGLAWEWWR [33]. Zawiera on aż trzy reszty tryptofanu,
4
niezbędne do prawidłowego funkcjonowania tego białka. Ich rola została poznana poprzez
analizę mutacji punktowych. Dokonano substytucji tryptofanu na fenyloalaninę w regionie
konserwatywnym, jak i poza nim [55]. Mutacja we fragmencie genu kodującym
konserwatywny undekapeptyd powodowała drastyczny spadek zdolności perfringolizyny do
wiązania z błoną erytrocytów. Zmiany poza rejonem konserwatywnym powodowały
nieznaczny spadek aktywności. Z jedenastu aminokwasów tego peptydu największą rolę
przypisywano cysteinie, której obecność miała warunkować zależność omawianej rodziny
hemolizyn od grup tiolowych. Właściwości nowego członka tej rodziny potwierdzały ten
pogląd. Pyolizyna, toksyna Arcanobacterium pyogenes zawiera zamiast cysteiny, alaninę w
konserwatywnym peptydzie, a jej aktywność nie zależy od czynników redukujących. Jednak
po wymianie alaniny na cysteinę aktywność pyolizyny była nadal niezależna od grup SH [7].
Wynik ten uzupełnia się z danymi uzyskanymi w naszym laboratorium. Skonstruowano
zmutowaną listeriolizynę (cytolizyna Listeria monocytogenes), w której zamiast cysteiny
wstawiono alaninę. Jednak tak zmodyfikowana hemolizyna jest nadal aktywowana przez
czynniki redukujące. Powyższe wyniki minimalizują rolę pojedynczego aminokwasu w
aktywności całej cytolizyny. Ważniejsza jest konformacja całej domeny niż obecność czy
brak konkretnego aminokwasu.
Hemolizyny należące do rodziny β−baryłek są produkowane przez bakterie o małym
pokrewieństwie filogenetycznym. Wspólny jest tu mechanizm działania, który zostanie
omówiony w rozdziale 4. Cytolizyny z rodziny β-baryłek charakteryzują się niższą masą
cząsteczkową niż hemolizyny aktywowane przez grupy tiolowe. Dla α-toksyny S. aureus
wynosi ona 33 kDa, natomiast masa cząsteczkowa aerolizyny równa jest 52 kDa. Uderzającą
cechą tych hemolizyn jest brak specyficzności w oddziaływaniu z lipidami. Przyłączają się do
powierzchni liposomów niezależnie od rodzaju lipidów wchodzących w skład sztucznej błony
[59]. W przeciwieństwie do cytolizyn aktywowanych przez grupy tiolowe polimeryzacja
toksyn z rodziny β-baryłek jest ściśle zdefiniowana. Tworzone są oligomery składające się ze
stałej liczby podjednostek, zwane homomerami. Dla α-toksyny S. aureus i aerolizyny liczba
ta wynosi zawsze siedem [59]. Hemolizyny aktywowane przez grupy SH polimeryzują w
sposób bardziej dowolny. Tworzą heteromery, które zawierają 40-80 monomerów [56, 65].
Cytolizyny bakterii Gram-ujemnych są znacznie większe od omówionych powyżej.
Masa cząsteczkowa toksyn z rodziny RTX wynosi około 110 kDa. Omawiane hemolizyny
zawierają w swojej sekwencji powtórzenia składające się z tandemowo ułożonych
nonapeptydów, bogatych w glicynę. Te krótkie sekwencje służą do wiązania jonów wapnia,
5
niezbędnych do prawidłowego funkcjonowania toksyn RTX [3]. Natomiast kationy cynku
hamują ich aktywność [3]. Do charakterystycznych motywów strukturalnych tych toksyn
należy również N-terminalna domena o hydrofobowym charakterze. Z powodu dużej masy
cząsteczkowej oraz wyeksponowanych fragmentów hydrofobowych, hemolizyny RTX są
słabiej rozpuszczalne od białek z wyżej omówionych rodzin i wykazują silną tendencję do
spontanicznej agregacji. Toksyny zawierające powtórzenia są dobrze poznane pod względem
mechanizmów regulacji aktywności i specyficzności samej hemolizyny (rozdział 3).
Cytolizyny produkowane przez rodzaj Vibrio tworzą bardzo nietypową klasę, chociaż
są syntetyzowane przez Gram-ujemne przecinkowce, w swoich właściwościach upodabniają
się do hemolizyn bakterii Gram-dodatnich. Masa cząsteczkowa hemolizyn V.cholerae wynosi
65 kDa w przypadku El Tor, 63 kDa dla VCC. Są to wartości typowe dla cytolizyn
aktywowanych przez ugrupowania tiolowe. Podobnie jak w przypadku toksyn aktywowanych
przez grupy tiolowe, aktywność hemolizyn Vibrio sp. jest hamowana przez tlen [53].
Hemolizyny rodzaju Vibrio tworzą trwałe kompleksy ze specyficznymi lipidami. Są to
cholesterol i sfingolipidy [70]. Zdolność do wiązania z cholesterolem także jest wspólna z
rodziną toksyn aktywowanych przez grupy SH. Jednak wspomniana podwójna specyficzność
jest unikalna dla hemolizyn Vibrio. Przy czym sfingolipidy wiążą cytolizyny w większym
stopniu. Z kolei sposób tworzenia oligomerów jest wspólny z grupą hemolizyn z motywem βbaryłki. Otóż w tym przypadku polimeryzacja także prowadzi do powstania homooligomerów. Tworzone przez cytolizynę V. cholerae pierścienie są pentameryczne [70].
Termostabilna hemolizyna V. parahaemolyticus zgodnie z nazwą cechuje się dużą
wytrzymałością na ciepło, co jest absolutnie unikalne wśród hemolizyn. Różnice pomiędzy
cytolizynami tych dwóch gatunków dotyczą również mechanizmu perforacji błony [29].
Ostatnią z omawianych klas reprezentuje hemolizyna Serratia marcescens. Zawarte tu
cytolizyny rodzaju Serratia tworzą nową rodzinę [8] o nietypowych właściwościach. Toksyny
z tej grupy charakteryzują się największą masą cząsteczkową z dotychczas opisanych. Masa
cząsteczkowa hemolizyny S. marcescens wynosi 160 kDa. Tak duże rozmiary mają wielki
wpływ na właściwości omawianych białek. Już w formie monomeru są one słabo
rozpuszczalne w wodzie i szybko dochodzi do ich agregacji, prowadzącej do nieodwracalnej
inaktywacji. W związku z tym okres półtrwania w formie aktywnej jest bardzo krótki, wynosi
zaledwie 3 minuty [27]. Nie pozostaje to bez wpływu na jej aktywność hemolityczną.
Polimeryzacja i tworzenie por zachodzi niemal natychmiast, w przeciwieństwie do
pozostałych rodzin. Jednak mała trwałość białka przesądza o niskiej aktywności
hemolitycznej Serratia.
6
Powyższa charakterystyka nie obejmuje wszystkich hemolizyn bakteryjnych.
Przykładowo hemolizyna Prevotella melaninogenica posiada wyróżniające ją właściwości.
Głównym powodem, dla którego nie została włączona do żadnej z powyższych rodzin jest
unikalna sekwencja nukleotydowa kodującego ją genu [2]. Istnieją hemolizyny sprawiające
jeszcze większe problemy taksonomiczne. Gen kodujący cytolizynę Treponema denticola
wykazuje znaczącą homologię do genów kodujących aminotransferazy [11]. Niektóre
hemolizyny
zawierają
podjednostki
o
aktywności
enzymatycznej.
Powstały
one
najprawdopodobniej w wyniku fuzji determinujących ich wytwarzanie genów z genami
odpowiednich enzymów. Toksyna AC Bordetella pertussis jest połączeniem hemolizyny
RTX z eukariotyczną cyklazą adenylanową [66]. Fuzja tego typu niezwykle poszerza
spektrum działania toksyny (rozdział 5). Niezwykle ciekawą toksynę wykryto u Enterococcus
faecalis. Białko to składa się z dwóch podjednostek o aktywności hemolizyny i bakteriocyny.
Jest to unikalna toksyna zdolna do uszkadzania błony eukariotycznej i bakteryjnej [12].
3. Regulacja aktywności
Aktywność cytolizyn zależy od czynników środowiskowych oraz od wewnętrznych
mechanizmów regulacyjnych. Warunki zewnętrzne wpływają na aktywność hemolityczną
przez modyfikację aktywności samego białka oraz ekspresji genu kodującego toksynę. Te
dwa czynniki zazwyczaj nakładają się na siebie. Warunki optymalne dla aktywności danej
hemolizyny sprzyjają również ekspresji kodującego ją genu. U bakterii Gram-ujemnych
dochodzi jeszcze jeden element regulacji wewnętrznej. Cytolizyny tej grupy bakterii są
zawsze wydzielane w formie nieaktywnej. Do uzyskania pełnej zdolności litycznej niezbędna
jest posttranslacyjna modyfikacja przez specyficzny enzym, która polega na acylacji toksyny.
Najlepiej zbadano ten mechanizm w przypadku hemolizyny E. coli. Acylacji ulegają tu dwie
konserwatywne lizyny. Substytucja jednej z nich uniemożliwia pełną acylację. Tak częściowo
zmodyfikowana hemolizyna jest aktywna tylko w 40%, natomiast toksyna nie poddana
acylacji jest całkowicie nieaktywna biologicznie [22]. Większość cytolizyn jest zdolna do
tworzenia por nie tylko w błonie erytrocytów, ale także w błonie większości komórek
eukariotycznych.
Istnieje
jednak
pewne
zróżnicowanie
we
wrażliwości
komórek
eukariotycznych wobec danej cytolizyny. Każda toksyna powoduje lizę pewnego typu
komórek w większym stopniu, niż pozostałych komórek. Również w obrębie danego typu
komórek zaobserwowano zmienną wrażliwość, zależnie od tego, z jakiego organizmu
pochodzi dana komórka [65]. Na przykład listeriolizyna powoduje lizę wszystkich komórek
7
eukariotycznych, ale jej działanie jest najbardziej efektywne wobec erytrocytów, a najbardziej
wrażliwe na listeriolizynę są erytrocyty mysie. Zjawisko to nazywamy specyficznością
aktywności cytolizyn. W przypadku toksyn RTX specyficzność hemolizy jest spowodowana
selektywnym wiązaniem toksyn z powierzchnią komórek-cząsteczki hemolizyn przyłączają
się efektywniej do powierzchni wybranych komórek, dzięki czemu można zaobserwować
zróżnicowany poziom wrażliwości komórek na toksyny RTX [3]. Za specyficzność wiązania
z błoną cytoplazmatyczną są odpowiedzialne konserwatywne fragmenty białka, zawierające
dwie reszty lizyny [3, 39]. Większość toksyn RTX powoduje lizę erytrocytów, za wyjątkiem
leukotoksyny wytwarzanej przez Pasteurella haemolytica, specyficznej wobec leukocytów.
Wymieniając konserwatywne fragmenty pomiędzy leukotoksyną, a toksyną Bordetella
Pertussis, uzyskano cytolizyny o zmienionej specyficzności działania [66]. Specyficzność
hemolizyny E. coli zmodyfikowano dokonując jedynie wymiany pojedynczych aminokwasów
w regionie konserwatywnym [48]. Rodzaj kwasu tłuszczowego, który ulega przyłączeniu do
reszty lizyny ma wpływ na poziom aktywności toksyny, ale nie zmienia specyficzności
toksyn wobec komórek docelowych [28]. Hemolizyny są najczęściej acylowane przez proste
kwasy tłuszczowe takie jak kwas palmitynowy. Natomiast cytolizyna S. marcescens jest
aktywowana jedynie przez fosfatydyloetanoloaminę [23]. Modyfikacja hemolizyny jest
niezbędna do zajścia drugiego etapu cytolizy (rozdział 4). Prawdopodobnie grupy acylowe
pełnią rolę dodatkowych ligandów podczas łączenia z powierzchnią komórek. Być może
również zwiększają interakcje pomiędzy poszczególnymi monomerami, ułatwiając późniejszą
polimeryzację. Główną funkcją przyłączonych kwasów tłuszczowych jest zwiększenie
hydrofobowości hemolizyny, co umożliwia jej insercję wewnątrz błony cytoplazmatycznej
[60].
4. Molekularny mechanizm działania
Pomimo różnych właściwości biochemicznych, hemolizyny wykazują ten sam
schemat działania. Cytoliza zawsze zachodzi w dwóch etapach. Pierwszym z nich jest
przyłączenie monomerów toksyny do błony komórkowej. W drugim etapie dochodzi do
perforacji błony cytoplazmatycznej. Powyższe zdarzenia są wyraźnie rozdzielone w czasie.
Połączenie toksyn z błoną komórkową jest błyskawiczne, następuje w ciągu kilkunastu
sekund [3]. Jednak efekt działania hemolizyn jest zazwyczaj zauważalny dopiero po
kilkunastu minutach. Wiązanie cytolizyn z błoną lipidową jest niezależne [3, 56, 65] od
warunków fizykochemicznych wymaganych dla pełnej ich aktywności (rozdział 2). Etap ten
8
nie zależy również od białek regulujących aktywność hemolizyn (rozdział 3). Komórki
wykazują duże zróżnicowanie wrażliwości na cytolizyny. Erytrocyty są rodzajem komórek
najłatwiej ulegającym lizie. Również w obrębie jednego typu komórek stopień wrażliwości
jest zmienny. Erytrocyty różnych gatunków ssaków poddane działaniu streptolizyny ulegają
hemolizie w niejednakowym stopniu [65]. Zjawisko zróżnicowanej wrażliwości nie jest
dokładnie wyjaśnione. Jako jedną z przyczyn podaje się specyficzność przyłączania
hemolizyn do powierzchni komórek. To wyjaśnienie jest wystarczające w przypadku toksyn
RTX (rozdział 3). Dla tej rodziny wykazano zależność pomiędzy stopniem hemolizy a
wiązaniem różnych cytolizyn z erytrocytami [3]. Powyższa zależność nie znajduje
zastosowania dla pozostałych hemolizyn. Toksyny aktywowane przez grupy SH przyłączają
się do cholesterolu, który jest obecny we wszystkich komórkach eukariotycznych. Niewielkie
różnice w zawartości tego lipidu w błonach poszczególnych komórek nie mogą być
wytłumaczeniem dla tak wielkiego zróżnicowania wrażliwości. Cytolizyny aktywowane przez
grupy tiolowe przyłączają się do wszystkich komórek. Zaobserwowano jednak, że komórki
mniej wrażliwe są zdolne do usuwania monomerów toksyn ze swojej powierzchni [65].
Większe znaczenie przypisuje się jednak różnicom powstającym na etapie tworzenia por.
Podobnie jest dla toksyn z motywem β-baryłki oraz wydzielanymi przez V. cholerae. Przy
niskim (nanomolarnym) stężeniu cytolizyny wykazują specyficzność w stosunku do
króliczych erytrocytów [68], a przy
wysokim (mikromolarnym) stężeniu powodują lizę
innych komórek. Nie zidentyfikowano jeszcze żadnego czynnika na powierzchni komórek
odpowiedzialnego za zróżnicowaną wrażliwość komórek na aktywność cytolizyn.
Po związaniu się hemolizyn z powierzchnią komórek następuje drugi etap działania
tych białek. W tym momencie zaadsorbowane cząsteczki toksyn zmieniają swoją
konformację. Hydrofilne dotychczas monomery ulegają przeobrażeniu w hydrofobowe
cząsteczki penetrujące błonę cytoplazmatyczną. Proces ten zachodzi jedynie w odpowiednich
warunkach fizykochemicznych, charakterystycznych dla danej rodziny (rozdział 2 i 3). W
przeciwieństwie do poprzedniego, etap ten jest nieodwracalny. Hemolizyny tworzą pory w
błonie o strukturze pierścienia poprzez polimeryzację znajdujących się na błonie monomerów.
Wyjątkiem są toksyny RTX. Nie stwierdzono w ich przypadku tworzenia wspomnianych
struktur. Integracji z błoną dokonują monomery. Insercja jest ograniczona do zewnętrznej
warstwy błony lipidowej [44]. Obecność toksyn powoduje zmiany bocznego napięcia w
błonie i powstanie por o niewielkich rozmiarach (1,5-3 nm). Włączeniu w błonę ulega blisko
połowa cząsteczki, fragment N-terminalny, region środkowy zawierający powtórzenia oraz Ckoniec [40]. Szczegółowy mechanizm oraz struktura toksyn RTX w trakcie interakcji z błoną
9
nie zostały dotychczas opisane. Zintegrowane fragmenty posiadają prawdopodobnie strukturę
α helikalną [37]. Hemolizyny tworzące transbłonowe pierścienie są dużo lepiej
scharakteryzowane pod tym względem. Utworzone w ten sposób pory są już widzialne w
mikroskopie elektronowym. W przypadku cytolizyn aktywowanych przez grupy tiolowe
obserwuje się nie tylko pełne pierścienie, powstają również łukowate struktury. Jest to wynik
niekompletnej polimeryzacji cytolizyn. Toksyny z tej rodziny tworzą kompleksy o zmiennej
liczbie cząstek. Istnieje jednak tendencja do tworzenia polimerów składających się z podobnej
liczby molekuł. Kompletne pierścienie zawierają najczęściej około 50 monomerów [56].
Cytolizyny aktywowane przez grupy SH tworzą największe pory, o średnicy 20-30 nm [56].
Dokładny opis struktury perfringolizyny [50] umożliwił wyjaśnienie mechanizmu działania
tej rodziny toksyn. Na podstawie podobieństwa sekwencji uznano, że pozostałe cytolizyny
aktywowane przez grupy tiolowe mają niemal identyczną budowę. Hemolizyna C.
perfringens składa się z czterech domen. Największą rolę spełnia domena czwarta [58],
zlokalizowana przy C-końcu.
Właśnie tam znajduje się konserwatywny undekapeptyd
wiążący cholesterol. Połączenie z cholesterolem rozpoczyna proces zmian konformacji białka
i w efekcie jego insercję w błonę. Interkalacji dokonuje motyw β-szpilki. Ten hydrofobowy
fragment toksyny atakuje błonę niczym sztylet [50, 51]. Przekształceniu ulega struktura
trzeciorzędowa i C-terminalna część białka pogrąża się w błonie [50, 51]. W przypadku
perfringolizyny stwierdzono działanie dwóch szpilek na każdy monomer. Te motywy
dokonujące inwazji powstają z sześciu α heliks [25]. Zatem mamy tu do czynienia ze
znaczącymi zmianami w strukturze drugorzędowej . Trudno powiedzieć, czy mechanizm
działania perfringolizyny jest unikalny, czy też zmiany tego typu nie zostały jeszcze wykryte
u pozostałych (słabiej poznanych pod tym względem) członków tej rodziny. Za drugim
wyjaśnieniem
przemawia
duże podobieństwo właściwości i sekwencji hemolizyn
aktywowanych przez grupy SH. W związku z powyższym powinny podzielać również
wspólny mechanizm działania. Nie wiadomo dokładnie, czy toksyny polimeryzują przed [18,
65], czy po [1, 45, 46] integracji z błoną. Obecność nieaktywnych polimerów na błonie
komórek odpornych na lizę sugeruje, iż insercji dokonuje kompleks cytolizyn [65]. Czynnik
hamujący integrację toksyn z błoną nie został jeszcze zidentyfikowany. W polimeryzacji
bierze udział domena pierwsza i czwarta, zaangażowana również w insercję. Rozpoznawany
przez nią cholesterol prawdopodobnie spełnia wiele funkcji, nie tylko warunkuje przyłączanie
toksyn, ale także penetrację błony [33, 50], a może nawet polimeryzację i stabilizację
utworzonych pierścieni [50]. Zaadsorbowane hemolizyny zaczynają się poruszać w błonie,
10
albo po jej powierzchni łącząc się ze sobą dzięki oddziaływaniom niekowalencyjnym.
Niedawno odkryta zdolność cytolizyn do spontanicznej polimeryzacji w roztworze [18]
uzasadnia model insercji uformowanego pierścienia w błonę. Na poparcie teorii polimeryzacji
w błonie przytaczane są następujące argumenty: Produkty niekompletnej polimeryzacji, czyli
łukowate struktury mogą dalej polimeryzować, powodując dynamiczne zmiany w błonie
cytoplazmatycznej [45]. Zmiany konformacyjne monomeru podczas wiązania z błoną
sugerują allosteryczną aktywację, dzięki której możliwa staje się polimeryzacja [1, 46]. Jest
całkiem prawdopodobne, że obie hipotezy są prawdziwe i tworzenie pierścieni może
zachodzić zarówno ponad, jak i wewnątrz błony cytoplazmatycznej.
Mechanizm działania hemolizyn V. cholerae i cytolizyn z rodziny β-baryłek jest
prawdopodobnie zbliżony [68]. W ogólnym zarysie zasada działania jest podobna jak u
omówionych powyżej toksyn aktywowanych przez ugrupowania tiolowe. Poniżej
przedstawiono najważniejsze różnice: W tym przypadku powstają pory z udziałem homooligomerów. Hemolizyna S. aureus tworzy heptamery [59]. Natomiast cytotoksyna V.
cholerae łączy się w pentamery [70]. W związku z małą liczbą cząstek budujących jeden
pierścień tworzone pory są znacznie mniejsze, niż u powyżej opisanej klasy cytolizyn
aktywowanych przez grupy SH. Kanał wodny zbudowany przez α−toksyny mierzy w swoim
najszerszym miejscu 4,6 nm [59]. Średnica por tworzonych przez VCC i El Tor wynosi od
1do 2 nm [31, 68]. W przypadku rodziny β-baryłek wiadomo, że oligomeryzacja rozpoczyna
się na zewnątrz błony komórek, zarówno wrażliwych jak i opornych [57, 63]. O insercji
kompleksu w błonę decyduje nieznany czynnik obecny prawdopodobnie na powierzchni
komórek. W przypadku komórek wrażliwych następuje integracja pierścienia z błoną. Każdy
monomer α-toksyny dokonuje inwazji przy użyciu 23 aminokwasowego odcinka o strukturze
dwóch przeciwległych β-kartek [55, 59]. Fragment ten, pochodzący z centralnej części białka
zagłębia się w błonie. Po niekowalencyjnym połączeniu z sąsiednimi, poprzez kooperatywne
oddziaływania (zmiana konformacji jednego składnika kompleksu wymusza zmianę struktury
u pozostałych), tworzy się wspomniany motyw β-baryłki. Podczas integracji z błoną
kompleks przechodzi przez trzy stany pośrednie, stopniowo nabierając hydrofobowego
charakteru [62]. Proces ten zależy od płynności błony białkowo-lipidowej i z tego właśnie
powodu hemoliza nie zachodzi w temperaturze poniżej 4oC [57]. Mechanizm działania
hemolizyn V. cholerae nie jest tak dobrze poznany, za to interakcje z lipidami zostały opisane
wyczerpująco. Jak już wspomniano, (rozdział 2) cytolizyny z rodzaju Vibrio posiadają
podwójną specyficzność. Sfingolipidy, a zwłaszcza niektóre ceramidy promują adsorpcję
11
toksyn w większym stopniu niż cholesterol [70]. Natomiast w procesie oligomeryzacji
obecność sterolu jest niezastąpiona [31].
Najsłabiej poznany jest mechanizm działania hemolizyn wydzielanych przez rodzaj
Serratia. Najbardziej uderzającą cechą tej grupy białek jest zdolność do hemolizy w
temperaturze blisko 0oC. Ta niezwykła cecha wynika zapewne z ich silnej tendencji do
agregacji, gdyż zmienione białka o obniżonej tendencji do polimeryzacji nie posiadają tej
zdolności [27]. Tworzą one niewielkie pierścienie o wewnętrznej średnicy 2,5-3 nm. W
temperaturze poniżej 4oC, na wskutek obniżonej płynności błony, pory miały rozmiar
zaledwie 1-1,5 nm [54].
5. Efekty działania toksyn na żywe komórki
Efekt działania hemolizyn na komórki zależy w głównej mierze od stężenia toksyn. W
przypadku wysokiego stężenia występuje najbardziej charakterystyczny skutek aktywności
cytolizyn, czyli śmierć komórki na skutek jej lizy. Przy mniejszym stężeniu powodują one
zaburzenia metaboliczne. Zmiany wynikają z naruszenia integralności błony komórkowej co
doprowadza komórkę do utraty homeostazy. Objawy te są zależne od rodzaju cząsteczek dla
których błona cytoplazmatyczna już nie stanowi bariery. O tym decyduje rozmiar por, dlatego
też te efekty są charakterystyczne dla danej rodziny hemolizyn. Do innych zmian należą
zaburzenia metaboliczne niezależne od uszkodzenia błony komórkowej, wynikające z
indywidualnych właściwości farmakologicznych danej toksyny. Dlatego też efekty tego typu
są unikalne dla każdej hemolizyny.
Powstałe w błonie komórkowej pory umożliwiają swobodne przemieszczanie się przez
nią wody, jonów i molekuł o niskiej masie cząsteczkowej. Odpowiednia ilość tych por
pozwala na przepływ wody w skali indukującej cytolizę. Ilość uszkodzeń błony
cytoplazmatycznej letalna dla komórki zależy od wrażliwości komórki i rozmiarów
transbłonowych kanałów (rozdział 4). W ekstremalnym przypadku, gdy ludzkie erytrocyty są
poddane działaniu toksyn aktywowanych przez grupy tiolowe wystarczający może się okazać
jeden kompleks lityczny [65]. Mechanizm cytolizy in vivo może spełniać rolę drugorzędową.
Celem ataku cytolizyn są tu także pozostałe komórki, dużo odporniejsze. Do tego dochodzi
mniejsza ilość toksyn oddziałujących na jedną komórkę niż w warunkach doświadczalnych.
Dlatego też uważa się, że większe znaczenie praktyczne mają pozostałe, bardziej subtelne
mechanizmy działania hemolizyn. Śmierć komórki może nastąpić także w przypadku
działania mniejszej liczby cząsteczek toksyn. Wytworzone pory umożliwiają przepływ
12
kationów jednowartościowych takich jak K+ i H+, powodując depolaryzację błony. Efektem
końcowym jest obumarcie komórki na skutek spadku poziomu ATP [64, 69]. Hemolizyny
aktywowane przez grupy SH cechuje dodatkowy mechanizm zwiększający skuteczność
cytolizy. Toksyny te są zdolne do wiązania fragmentu Fc przeciwciał. Zaadsorbowane na
błonie cytolizyny łączą się z przeciwciałami, bez względu na ich antygenową specyficzność.
Nagromadzenie immunoglobulin na powierzchni komórek jest sygnałem do aktywacji układu
dopełniacza. Białka komplementu przyłączają się do błony komórek własnego organizmu,
tworząc w nich pory niezależnie od toksyn bakteryjnych [4]. Większość hemolizyn (oprócz
wydzielanych przez V. cholerae) [69] indukuje przedostawanie się kationów Ca2+ do komórki.
Zwiększenie poziomu tak istotnego wewnątrzkomórkowego przekaźnika sygnału poważnie
zakłóca metabolizm. Wzrasta poziom także innych mediatorów, takich jak fosforan inozytolu.
Efekt końcowy jest też zależny od rodzaju
komórki. Może dojść do nadprodukcji
interleukin, prostaglandyn i innych czynników modulujących aktywność sąsiednich komórek
[20]. Hemolizyny wywołują szereg zróżnicowanych efektów, które tylko częściowo i nie we
wszystkich przypadkach mogą być wytłumaczone istnieniem transbłonowych kanałów. Tak
jest w przypadku interakcji listeriolizyny z makrofagami. Hemolizyna ta indukuje zwiększoną
produkcję interleukiny 1. Efekt ten jest niezależny od uszkodzenia błony makrofagów,
ponieważ występuje nawet po inaktywacji cytolizyn cholesterolem [67]. Ta sama cytolizyna,
umieszczona w kompleksie z MHC II na powierzchni komórek prezentujących antygen
powoduje nieodwracalną inaktywację limfocytów T [14]. Hemolizyna L. monocytogenes
powoduje także aktywację MAP kinazy (ang. Mitogen Activated Protein). W tym przypadku
aktywność cytolityczna wpływa na reakcję komórek, ponieważ streptolizyna oraz detergent
również prowadzą do aktywacji MAP kinazy [61]. Inna toksyna z rodziny aktywowanych
poprzez grupy sulfhydrylowe, pneumolizyna zwiększa wydzielanie tlenku azotu przez
makrofagi [9]. Omawiane w tym rozdziale cząsteczki sygnalne, w małych ilościach aktywują
komórki należące do układu immunologicznego. Jednak ich nadprodukcja prowadzi do
zachwiania równowagi pomiędzy poszczególnymi składowymi układu odpornościowego.
Nadmierna aktywność komórek efektorowych prowadzi między innymi do przewlekłego
stanu zapalnego. Aerolizyna jest zdolna do zwiększenia wewnątrz komórkowego stężenia
jonów Ca2+. Polega to na standardowym przenikaniu jonów przez pory wytworzone przez
hemolizyny.
Innym
mechanizmem
jest
proces
uwalniania
Ca2+
z
magazynów
wewnątrzkomórkowych. Proces ten jest niezależny od pierwszego, aktywowanym
mediatorem jest w tym przypadku białko G [35]. Toksyna S. aureus oraz hemolizyny RTX
również wywołują nadprodukcję mediatorów zapalnych, jak NO czy prostaglandyny.
13
Toksyny RTX wykazują jednak większą skuteczność w indukcji tych procesów [20].
Należąca do tej rodziny dwufunkcyjna toksyna B. pertussis dzięki posiadaniu dodatkowej
domeny cyklazy adenylanowej odznacza się zacznie zwiększoną skutecznością. Efekty
działania hemolitycznej podjednostki są widoczne dopiero po dłuższym czasie i przy
większym stężeniu tego białka. Tymczasem aktywność podjednostki enzymatycznej objawia
się w błyskawicznej ucieczce kationów K+ z komórki. Naturalnie dwie podjednostki
współdziałają ze sobą, domena cyklazy adenylanowej dostaje się do wnętrza komórki dzięki
lizie błony [19]. Hemolizyna Burkholderia cepacia oddziałuje bardziej bezpośrednio na
fagocyty, gdyż wywołuję ich apoptozę [30]. Cytolizyny wydzielane przez rodzaj Vibrio
również nie ograniczają swej aktywności do lizy komórki. Insercja toksyny V. vulnificus w
błonę komórek prowadzi do aktywacji cyklazy guanylowej [34]. Hemolizyna V.
parahaemolyticus powoduje degenerację komórek poprzez dezorganizację cytoszkieletu [15].
Natomiast białko V. cholerae wywołuje wakuolizację komórek [13]. Zdolność do lizy
komórek poprzez wakuolizację jest obserwowana także u hemolizyny S. marcescens [24].
Przedstawione powyżej efekty wywoływane przez cytolizyny w sublitycznych dawkach,
zostały w większości odkryte w ciągu kilku ostatnich lat. Nieznane są dokładne mechanizmy
odpowiedzialne za opisane powyżej reakcje komórek. W wielu przypadkach nie wiadomo, w
jakim stopniu efekt działania toksyn jest zależny od istnienia transbłonowych kanałów.
6. Udział w patogenezie
Hemolizyny są bardzo ważnymi determinantami patogenezy. Delecja genu cytolizyny
prowadzi do znacznego spadku wirulencji, czasami nawet do jej całkowitej utraty. Tak jest w
przypadku wewnątrzkomórkowego patogena, L. monocytogenes. Cytolizyna tych bakterii jest
niezbędna do ich ucieczki z fagosomu do cytoplazmy. Znaczenie listeriolizyny wykazano w
pracy, gdzie gen kodujący toksynę przeklonowano do Bacillus subtilis. Zupełnie awirulentna,
glebowa bakteria nabrała zdolności do wzrostu wewnątrz komórek eukariotycznych [6].
Doświadczenie powtórzono także z inną hemolizyną z rodziny aktywowanych przez grupy
tiolowe. Perfringolizyna również umożliwiała B. subtilis wzrost wewnątrzkomórkowy [49].
Większość bakterii chorobotwórczych nie jest całkowicie zależna od posiadania cytolizyn.
Jednak ich brak prawie zawsze wpływa ujemnie na wirulencję mikroorganizmu. Jest to
związane z możliwościami, jakie stwarza patogenowi posiadanie hemolizyny. Wykraczają
one znacznie poza cytotoksyczność (rozdział 5). Naturalnie wspomniany proces nie jest bez
znaczenia. Cytoliza prowadzi do uszkodzenia tkanki, w której namnaża się patogen. Skutkiem
14
są objawy chorobowe, zależne od rodzaju zakażonej tkanki. Sam proces hemolizy prowadzi
do uwolnienia z erytrocytów żelaza zawartego w hemoglobinie. Limitowane stężenie tego
pierwiastka jest jedną z przeszkód, jakie napotyka bakteria chorobotwórcza. Dlatego też
zdobycie
żelaza
zwiększa
szansę
pasożytniczego
mikroorganizmu
na
przeżycie.
Najgroźniejszym jednak wrogiem patogena jest układ immunologiczny. Odpowiednio do
sytuacji zadaniem o największym priorytecie dla bakterii jest uniknięcie ataku ze strony
układu odpornościowego. Jak wykazały badania przeprowadzone w ciągu ostatnich kilku lat,
w tej działalności uczestniczą również cytolizyny. Indukując zwiększone wydzielanie różnego
rodzaju
cząsteczek
sygnalnych
zakłócają
poprawne
funkcjonowanie
układu
immunologicznego (rozdział 5). Znaczny spadek wirulencji z powodu braku hemolizyny jest
spowodowany jeszcze jednym czynnikiem. Komórki bakteryjne często posiadają kilka
determinant
patogenezy takich jak adhezyny czy fosfolipazy, a posiadają tylko jedną
cytolizynę. Są oczywiście wyjątki od tej reguły. Actinobacillus pleuropneumoniae wydziela
dwie różne toksyny RTX [16]. Jedna z nich jednak charakteryzuje się niską aktywnością i nie
może efektywnie zastępować drugiej. S. aureus posiada aż trzy białka cytolityczne: α, β, oraz
γ−toksynę. Największe znaczenie dla procesu patogenezy mają α i γ−toksyna. Obie
cytolizyny są niezbędne, ich funkcje uzupełniają się wzajemnie [42]. W przypadku
enterotoksycznych szczepów E. coli udział hemolizyny w patogenezie jest znikomy. Delecja
genu kodującego toksynę nie miała wpływu na rozwój zakażenia u prosiąt [41]. Jest to
zasługujący na uwagę wyjątek od reguły przedstawionej na początku rozdziału. Wynika to z
faktu, iż E. coli nie jest typowym patogenem, który w toku ewolucji polegał na własnych
czynnikach wirulencji. Bakteria ta otrzymała gen hemolizyny w wyniku transferu
horyzontalnego stosunkowo niedawno. Dlatego też jej cykl życiowy nie jest jeszcze zależny
od posiadania cytolizyn. Naturalnie posiadanie genu kodującego toksynę przez dany szczep
daje mu pewną przewagę nad innymi. Wykazanie tej zależności zależy w znacznym stopniu
od modelu doświadczalnego. Przebieg zapalenia otrzewnej u szczurów w dużej mierze zależał
od wytwarzania hemolizyn przez E. coli. Rozmiar i letalność infekcji były znacząco większe
w przypadku szczurów zakażonych przez szczepy hemolityczne [38].
7. Zastosowanie
Szczególne właściwości hemolizyn sprawiły, iż są one obecnie nie tylko obiektem
badań, lecz są również wykorzystywane podczas prowadzenia badań z różnych dziedzin
biologii. Geny kodujące cytolizyny są często znajdowane w nowo poznawanych bakteriach
15
chorobotwórczych. Identyfikacja większości z odkrywanych toksyn jest stosunkowo prosta.
Używając konserwatywnych fragmentów genów jako sondy można określić przynależność
opisywanej hemolizyny do danej rodziny [10]. Niska zmienność niektórych fragmentów
omawianych białek stwarza możliwość opracowania szczepionki o szerokim zakresie.
Zmienność antygenowa bakterii i duża liczba serotypów jest głównym problemem przy
opracowaniu skutecznej szczepionki. Zastosowanie konserwatywnych determinantów
patogenezy pozwala ominąć ten problem. W związku z powyższym podjęto próbę
skonstruowania szczepionki z wykorzystaniem hemolizyny jako antygenu, która miałaby
skutecznie zabezpieczać przed infekcją różnorodnych szczepów E. coli [43]. Jeszcze bardziej
obiecująca wydaje się być
zdolność monoklonalnych
przeciwciał rozpoznających
konserwatywny undekapeptyd do neutralizacji wszystkich toksyn aktywowanych przez grupy
tiolowe [33]. Wykorzystanie listeriolizyny stwarza ogromne możliwości dla opracowania
szczepionek nowej generacji. Jak już wspomniano w poprzednim rozdziale, białko to jest
czynnikiem patogenezy umożliwiającym ucieczkę bakterii z wakuoli do cytoplazmy.
Umieszczenie wybranego antygenu w tej przestrzeni jest niezwykle pożądane, gdyż
umożliwia prezentację obcego białka na powierzchni komórki przez kompleks MHC I.
Tradycyjne szczepionki stymulują głównie odporność humoralną. Podany antygen jest
przetwarzany przez komórki prezentujące antygen po czym prezentowany wspólnie z MHC
II. Tymczasem obcy
oligopeptyd połączony z MHC I aktywuje limfocyty Tc
(cytotoksyczne). Komórki te są odpowiedzialne za zwalczanie wirusów oraz komórek
nowotworowych. L. monocytogenes zawierająca gen kodujący nukleoproteinę wirusa grypy
pobudziła limfocyty Tc do aktywności cytotoksycznej wobec zakażonych komórek [32].
Ekspresja
przez
L.
monocytogenes
antygenów
charakterystycznych
dla
komórek
nowotworowych daje również zachęcające wyniki. Omawiany wektor był skuteczny jako
szczepionka uodparniająca myszy na podaną następnie śmiertelną dawkę komórek rakowych.
Powodował również regresję uformowanego już nowotworu [47]. Dostarczanie antygenu na
teren cytoplazmy jest możliwe także przez inne bakterie dzięki ekspresji listeriolizyny. E. coli
z genem kodującym cytolizynę ulegała lizie w fagosomie, lecz syntetyzowane przez nią
białka znalazły się w cytozolu dzięki kanałom w błonie wakuoli utworzonym przez toksyny
[26]. Ponieważ sekrecja hemolizyn nie jest niezbędna, możliwe jest zastosowanie liposomów
jako wektora. Użycie liposomów zawierających toksynę L. monocytogenes i wybrane białko
również zapewnia dostarczenie antygenu do cytoplazmy [36]. Hemolizyny aktywowane przez
grupy tiolowe są aktualnie używane jako narzędzie badawcze w biologii komórki.
Zastosowane w odpowiednich ilościach umożliwiają przeprowadzenie molekularnej iniekcji,
16
czyli wprowadzenia do komórki cząsteczek o wymiarach nie przekraczających średnicy
kanałów transbłonowych [5]. Raz utworzone pory nie ulegają zamknięciu, co stanowiło
problem w przypadku badań wpływu wprowadzanych molekuł na metabolizm komórkowy.
Trudność ta została wyeliminowana dzięki zastosowaniu zmodyfikowanej cytolizyny.
Składające się z niej kompleksy lityczne są zdolne do odwracalnej penetracji błony
komórkowej, w zależności od stężenia kationów cynku [52]. Wykorzystano również zdolność
wiązania cholesterolu przez toksyny aktywowane przez grupy tiolowe. Ta charakterystyczna
właściwość umożliwia badanie rozmieszczenia cholesterolu w błonie komórkowej oraz szlaki
transportu tej cząsteczki. Warunkiem jest zastosowanie odpowiednio oznakowanego białka,
oraz jego modyfikacja w celu eliminacji aktywności cytolitycznej [17]. Hemolizyna S. aureus
jest obecnie badana pod kątem wykorzystania jej jako molekularnego sensora. W obecności
cyklodekstryny przepływające przez transbłonowy kanał cząsteczki powodują chwilowe
zablokowanie kanału. Wydarzenie to może być wykryte poprzez pomiar zmian potencjału
transbłonowego. Częstotliwość takich zaburzeń pozwala ustalić stężenie analizowanej
substancji, a ich wartość i okres trwania informuje o rodzaju cząsteczki. System ten wydaje
się być obiecującym układem do identyfikacji i jednoczesnego pomiaru stężenia
poszczególnych składników mieszaniny różnych substancji organicznych [21].
8. Podsumowanie
Cytolizyny są niezwykle różnorodną grupą białek. Na podstawie homologii sekwencji
wyróżniamy wśród nich rodziny skupiające białka o podobnych właściwościach. Jednak
aktualna klasyfikacja nie obejmuje wszystkich znanych hemolizyn. W obrębie każdej rodziny
występują wyjątki, w przypadku których przynależność do danej grupy jest dyskusyjna. Jest
to kolejny przykład ukazujący, iż różnorodność natury dalece przewyższa nasze zdolności do
jej klasyfikacji. Elementem wspólnym dla wszystkich hemolizyn jest mechanizm działania.
W ogólnym zarysie jest on podobny u wszystkich toksyn i zawsze składa się z dwóch
niezależnych etapów: asocjacja z błoną komórkową i jej penetracja. Drugi etap jest wysoce
zależny od odpowiednich parametrów fizykochemicznych. Umożliwiają one cytolizynom
zmiany konformacyjne i przejście monomeru w formę aktywną, zdolną do inicjacji procesu
cytolizy. Liza komórki nie jest jedynym efektem działalności toksyn. Zaburzają one również
funkcjonowanie metabolizmu wewnątrzkomórkowego. Ponieważ celem ataku hemolizyn są
17
także komórki układu odpornościowego, końcowym efektem są zaburzenia funkcjonowania
wspomnianego układu. Daje to patogenowi większe szanse na udaną kolonizację jego niszy
ekologicznej. Najbliższe lata z pewnością przyniosą nowe informacje z zakresu mechanizmu
działania cytolizyn, oraz wpływu ich działania na komórki eukariotyczne. Być może nowe
dane wprowadzą zmiany w obecnej klasyfikacji tej grupy białek. Prawdopodobnie będziemy
też świadkami dalszego rozwoju zastosowań cytolizyn w różnych dziedzinach biologii.
Piśmiennictwo:
65. Abdel Ghani E.M., Weis S., Walev I., Kehoe M., Bhakdi S., Palmer M.: Streptolysin O:
inhibition of the conformational change during membrane binding of the monomer
prevents oligomerization and pore formation. Biochemistry, 38, 15204 (1999)
66. Allison H.E., Hillman J.D.: Cloning and characterization of a Prevotella melaninogenica
hemolysin. Infect. Immun. 65, 2765 (1997)
67. Bauer M.E., Welch R.A.: Association of RTX toxins with erythrocytes. Infect. Immun.
64, 4665 (1996)
68. Bhakdi S., Tranum-Jensen J.: Complement activation and attack on autologous cell
membranes induced by streptolysin O. Infect. Immun. 48, 713 (1985)
69. Bhakdi S., Weller U., Walev I., Martin E., Jonas D., Palmer M.: A guide to the use of pore
forming toxins for controlled permeabilization of cell membranes. Med. Microbiol.
Immun. 182, 167 (1993)
70. Bielecki J.E., Youngman P., Connely P., Portnoy D.A.: Bacillus subtilis expressing
haemolisyn gene from Listeria monocytogenes can grow in mammalian cells. Nature, 345,
175 (1990)
71. Billington S.J., Jost B.H., Cuevas W.A., Bright K.R., Songer J.G.: The Arcanobacterium
(Actinomyces) pyogenes hemolysin, pyolysin, is a novel member of the thiol-activated
cytolysin family. J. Bacteriol. 179, 6100 (1997)
72. Braun V., Hobbie S., Ondraczek R.: Serratia marcescens forms a new type of cytolysin.
FEMS Microbiol. Lett. 79, 299 (1992)
73. Braun J.S., Novak R., Gao G., Murray P.J., Shenep J.L.: Pneumolysin, a protein toxin of
Streptococcus pneumoniae, induces nitric oxide production from macrophages. Infect.
Immun. 67, 3750 (1999)
74. Burrows L.L., Lo R.Y.: Molecular characterization of an RTX toxin determinant from
18
Actinobacillus suis. Infect. Immun. 60, 2166 (1992)
75. Chu L., Burgum A., Kolodrubetz D., Holt S.C.: The 46-kilodalton-hemolysin gene from
Treponema denticola encodes a novel hemolysin homologous to aminotransferases.
Infect. Immun. 63, 4448 (1995)
76. Coburn P.S., Hancock L.E., Booth M.C., Gilmore M.S.: A novel means of self-protection,
unrelated to toxin activation, confers immunity to the bactericidal effects of the
Enterococcus faecalis cytolysin. Infect. Immun. 67, 3339 (1999)
77. Coelho A., Andrade J.R.C., Vicente C.P., Dirita V.J.: Cytotoxic cell vacuolating activity
from Vibrio cholerae hemolysin. Infect. Immun. 68, 1700 (2000)
78. Darji A., Stockinger B., Wehland J., Chakraborty T., Weiss S.: Antigen-specific T cell
receptor antagonism by antigen-presenting cells treated with the hemolysin of Listeria
monocytogenes: a novel type of immune escape. Eur. J. Immun. 27, 1696 (1997)
79. Fabbri A., Falzano L., Frank C., Donelli G., Matarrese P., Raimondi F., Fasano A.,
Fiorentini C.: Vibrio parahaemolyticus thermostable direct hemolysin modulates
cytoskeletal organization and calcium homeostasis in intestinal cultured cells. Infect.
Immun. 67, 1139 (1999)
80. Frey J., van den Bosch H., Segers R., Nicolet J.: Identification of a second hemolysin
(HlyII) in Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 and expression of the gene in
Escherichia coli. Infect. Immun. 60, 1671 (1992)
81. Fujimoto T., Hayashi M., Iwamoto M., Ohno-Iwashita Y.: Crosslinked plasmalemmal
cholesterol is sequestered to caveolae: analysis with a new cytochemical probe. J.
Histochem. Cytochem. 45, 1197 (1997)
82. Gilbert R.J., Rossjohn J., Parker M.W., Tweten R.K., Morgan P.J., Mitchell T.J.,
Errington N., Rowe A.J., Andrew P.W., Byron O.: Self-interaction of pneumolysin, the
pore-forming protein toxin of Streptococcus pneumoniae. J. Mol. Biol. 284, 1223 (1998)
83. Gray M., Szabo G., Otero A.S., Gray L., Hewlett E.: Distinct mechanisms for K+ efflux,
intoxication, and hemolysis by Bordetella pertussis AC toxin. J. Biol. Chem. 273, 18260
(1998)
84. Grimminger F., Rose F., Sibelius U., Meinhardt M., Potzsch B., Spriestersbach R., Bhakdi
S., Suttorp N., Seeger W.: Human endothelial cell activation and mediator release in
response to the bacterial exotoxins Escherichia coli hemolysin and staphylococcal alphatoxin. J. Immun. 159, 1909 (1997)
85. Gu L., Braha O., Conlan S., Cheley S., Bayley S.: Stochastic sensing of organic analytes
by a pore-forming protein containing a molecular adapter. Nature, 398, 686 (1999)
19
86. Guzman-Verri C., Garcia F., Arvidson S.: Incomplete activation of Escherichia coli
hemolysin (HlyA) due to mutations in the 3' region of hlyC. J. Bacteriol. 179, 5959
(1997)
87. Hertle R., Brutsche S., Groeger W., Hobbie S., Koch W., Konninger U., Braun V.:
Specific phosphatidylethanolamine dependence of Serratia marcescens cytotoxin activity.
Mol. Microbiol. 26, 853 (1997)
88. Hertle R., Hilger M., Weingardt-Kocher S., Walev I.: Cytotoxic action of Serratia
marcescens hemolysin on human epithelial cells. Infect. Immun. 67, 817 (1999)
89. Heuck A.P., Shepard L.A., Rossjohn J., Parker M.W., Johnson A.E., Tweten R.K.: The
mechanism of membrane insertion for a cholesterol-dependent cytolysin: a novel
paradigm for pore-forming toxins. Cell, 99, 293 (1999)
90. Higgins D.E., Shastri N., Portnoy D.A.: Delivery of protein to the cytosol of macrophages
using Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 31, 1631 (1999)
91. Hilger M., Braun V.: Superlytic hemolysin mutants of Serratia marcescens. J. Bacteriol.
177, 7202 (1995)
92. Hormozi K., Parton R., Coote J.: Target cell specificity of the Pasteurella haemolytica
leukotoxin is unaffected by the nature of the fatty-acyl group used to activate the toxin in
vitro. FEMS Microbiol. Lett. 169, 139 (1998)
93. Huntley J.S., Sathyamoorthy V., Hall R.H., Hall A.C.: Membrane attack induced by
HlyA, a pore-forming toxin of Vibrio cholerae. Human Experim. Toxicol. 16, 101 (1997)
94. Hutchison M.L., Poxton I.R., Govan J.R.W.: Burkholderia cepacia produces a hemolysin
that is capable of inducing apoptosis and degranulation of mammalian phagocytes. Infect.
Immun. 66, 2033 (1998)
95. Ikigai H., Akatsuka A., Tsujiyama H., Nakae T., Shimamura T.: Mechanism of
membrane damage by El Tor hemolysin of Vibrio cholerae O1. Infect. Immun. 64, 2968
(1996)
96. Ikonomidis G., Portnoy D.A., Gerhard W., Paterson Y.: Influenza-specific immunity
induced by recombinant Listeria monocytogenes vaccines. Vaccine, 15, 433 (1997)
97. Jacobs T., Cima-Cabal M.D., Darji A., Mendez F.J., Vazquez F., Jacobs A.A., Shimada
Y., Ohno-Iwashita Y., Weiss S., de los Toyos J.R.: The conserved undecapeptide shared
by thiol-activated cytolysins is involved in membrane binding. FEBS Lett. 459, 463
(1999)
98. Kook H., Rhee J.H., Lee S.E., Kang S.Y., Chung S.S., Cho K.W., Baik Y.H.: Activation
of particulate guanylyl cyclase by + vulnificus hemolysin. Eur. J. Pharmacol. 365, 267
20
(1999)
99. Krause K.H., Fivaz M., Monod A., van der Goot F.G.: Aerolysin induces G-protein
activation and Ca2+ release from intracellular stores in human granulocytes. J. Biol.
Chem. 273, 18122 (1998)
100.Lee K.D., Oh Y.K., Portnoy D.A., Swanson J.A.: Delivery of macromolecules into
cytosol using liposomes containing hemolysin from Listeria monocytogenes. J. Biol.
Chem. 271, 7249 (1996)
101.Ludwig A., Schmid A., Benz R., Goebel W.: Mutations affecting pore formation by
hemolysin from Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 226, 198 (1991)
102. May
A.K., Gleason T.G., Sawyer R.G., Pruett T.L.: Contribution of Escherichia coli
alpha-hemolysin to bacterial virulence and to intraperitoneal alterations in peritonitis.
Infect. Immun. 68, 176 (2000)
103.McWhinney D.R., Chang Y.F., Young R., Struck D.K.: Separable domains define target
cell specificities of an RTX hemolysin from Actinobacillus pleuropneumoniae. J.
Bacteriol. 174, 291 (1992)
104.Moayeri M., Welch R.A.: Prelytic and lytic conformations of erythrocyte-associated
Escherichia coli hemolysin. Infect. Immun. 65, 2233 (1997)
105.Moxley R.A., Berberov E.M., Francis D.H., Xing J., Moayeri M., Welch R.A., Baker
D.R., Barletta R.G.: Pathogenicity of an enterotoxigenic Escherichia coli hemolysin
(hlyA) mutant in gnotobiotic piglets. Infect. Immun. 66, 5031 (1998)
106.Nilsson I.M., Hartford O., Foster T., Tarkowski A.: Alpha-toxin and gamma-toxin jointly
promote Staphylococcus aureus virulence in murine septic arthritis. Infect. Immun. 67,
1045 (1999)
107. O'Hanley
P., Marcus R., Baek K.H., Denich K., Ji G.E.: Genetic conservation of hlyA
determinants and serological conservation of HlyA: basis for developing a broadly crossreactive subunit Escherichia coli alpha-hemolysin vaccine. Infect. Immun. 61, 1091
(1993)
108.Ostolaza H., Bakas L., Goni F.M.: Balance of electrostatic and hydrophobic interactions
in the lysis of model membranes by E. coli alpha-haemolysin. J. Membr. Biol. 158, 137
(1997)
109.Palmer M., Harris R., Freytag C., Kehoe M., Tranum-Jensen J., Bhakdi S.: Assembly
mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a
free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. EMBO
J. 17, 1598 (1998)
21
110.Palmer M., Vulicevic I., Saweljew P., Valeva A., Kehoe M., Bhakdi S.: Streptolysin O: a
proposed model of allosteric interaction between a pore-forming protein and its target
lipid bilayer. Biochemistry, 37, 2378 (1998)
111.Pan Z., Ikonomidis G., Lazenby A., Pardoll D., Paterson Y.: A recombinant Listeria
monocytogenes vaccine expressing a model tumor antigen protects mice against lethal
tumor cell challenge and cuses regression of estabilished tumors. Nat. Med. 1, 471 (1995)
112.Pellett S., Welch R.A.: Escherichia coli hemolysin mutants with altered target cell
specificity. Infect. Immun. 64, 3081 (1996)
113.Portnoy D.A., Tweten R.K., Kehoe M., Bielecki J.: Capacity of listeriolysin O,
streptolysin O, and perfringolysin O to mediate growth of Bacillus subtilis within
mammalian cells. Infect. Immun. 60, 2710 (1992)
114.Rossjohn J., Fell S.C., McKinstry W.J., Tweten R.K., Parker M.W.: Structure of a
cholesterol-binding, thiol-activated cytolysin and a model of its membrane form. Cell, 89,
685 (1997)
115.Rossjohn J., Gilbert R.J., Crane D., Morgan P.J., Mitchell T.J., Rowe A.J., Andrew P.W.,
Paton J.C., Tweten R.K., Parker M.W.: The molecular mechanism of pneumolysin, a
virulence factor from Streptococcus pneumoniae. J. Mol. Biol. 284, 449 (1998)
116.Russo M.J., Bayley H., Toner M.: Reversible permeabilization of plasma membranes
with an engineered switchable pore. Nat. Biotechnol. 15, 278 (1997)
117.Sathyamoorthy V., Huntley J.S., Hall A.C., Hall R.H.: Biochemical and physiological
characteristics of HlyA, a pore-forming cytolysin of Vibrio cholerae serogroup O1.
Toxicon, 35, 515 (1997)
118.Schonherr R., Hilger M., Broer S., Benz R., Braun V.: Interaction of Serratia marcescens
hemolysin (ShlA) with artificial and erythrocyte membranes. Demonstration of the
formation of aqueous multistate channels. Eur. J. Biochem. 223, 655 (1994)
119.Sekino-Suzuki N., Nakamura M., Mitsui K.I., Ohno-Iwashita Y.: Contribution of
individual tryptophan residues to the structure and activity of theta-toxin (perfringolysin
O), a cholesterol-binding cytolysin. Eur. J. Biochem. 241, 941 (1996)
120.Sekiya K., Danbara H., Futaesaku Y., Haque A., Sugimoto N., Matsuda M.: Formation of
ring-shaped structures on erythrocyte membranes after treatment with botulinolysin, a
thiol-activated hemolysin from Clostridium botulinum. Infect. Immun. 66, 2987 (1998)
121.Sellman B.R., Kagan B.L., Tweten R.K.: Generation of a membrane-bound, oligomerized
pre-pore complex is necessary for pore formation by Clostridium septicum alpha toxin.
Mol. Microbiol. 23, 551 (1997)
22
122.Shimada Y., Nakamura M., Naito Y., Nomura K., Ohno-Iwashita Y.: C-terminal amino
acid residues are required for the folding and cholesterol binding property of
perfringolysin O, a pore-forming cytolysin. J. Biol. Chem. 274, 18536 (1999)
123.Song L., Hobaugh M.R., Shustak C., Cheley S., Bayley H., Gouaux E.J.: Structure of
Staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore. Science, 274, 1859
(1996)
124.Stanley P., Koronakis V., Hughes C.: Acylation of Escherichia coli hemolysin: a unique
protein lipidation mechanism underlying toxin function. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62,
309 (1998)
125.Tang P., Rosenshine I., Cossart P., Finlay B.B.: Listeriolysin O activates mitogenactivated protein kinase in eucaryotic cells. Infect. Immun. 64, 2359 (1996)
126.Valeva A., Palmer M., Bhakdi S.: Staphylococcal alpha-toxin: formation of the
heptameric pore is partially cooperative and proceeds through multiple intermediate
stages. Biochemistry, 36, 13298 (1997)
127.Valeva A., Walev I., Pinkernell M., Walker B., Bayley H., Palmer M., Bhakdi S.:
Transmembrane beta-barrel of staphylococcal alpha-toxin forms in sensitive but not in
resistant cells. Proc. Natn. Acad. Sci. U.S.A. 94, 11607 (1997)
128.Walev I., Martin E., Jonas D., Mohamadzadeh M., Muller-Klieser W., Kunz L., Bhakdi
S.: Staphylococcal alpha-toxin kills human keratinocytes by permeabilizing the plasma
membrane for monovalent ions. Infect. Immun. 61, 4972 (1993)
129.Walev I., Palmer M., Valeva A., Weller U., Bhakdi S.: Binding, oligomerization, and
pore formation by streptolysin O in erythrocytes and fibroblast membranes: Detection of
nonlytic polymers. Infect. Immun. 63, 1188 (1995)
130.Westrop G., Hormozi K., da Costa N., Parton R., Coote J.: Structure-function studies of
the adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis and the leukotoxin of Pasteurella
haemolytica by heterologous C protein activation and construction of hybrid proteins. J.
Bacteriol. 179, 871 (1997)
131.Yoshikawa H., Kawamura I., Fujita M., Tsukada H., Arakawa M., Mitsuyama M.:
Membrane damage and interleukin-1 production in murine macrophages exposed to
listeriolysin O. Infect. Immun. 61, 1334 (1993)
132.Zitzer A., Palmer M., Weller U., Wassenaar T., Biermann C., Tranum-Jensen J., Bhakdi
S.: Mode of primary binding to target membranes and pore formation induced by Vibrio
cholerae cytolysin (hemolysin). Eur. J. Biochem. 247, 209 (1997)
133.Zitzer A., Wassenaar T.M., Walev I., Bhakdi S.: Potent membrane-permeabilizing and
23
cytocidal action of Vibrio cholerae cytolysin on human intestinal cells. Infect. Immun. 65,
1293 (1997)
134.Zitzer A., Zitzer O., Bhakdi S., Palmer M.: Oligomerization of Vibrio cholerae cytolysin
yields a pentameric pore and has a dual specificity for cholesterol and sphingolipids in the
target membrane. J. Biol. Chem. 274, 1375 (1999)
24