Wydzielanie cytokin prozapalnych przez jednojadrzaste komórki

PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
35
Wydzielanie cytokin prozapalnych przez jednojądrzaste
komórki krwi obwodowej w hodowli z komórkami
raka płaskonabłonkowego krtani*
Production of proinflammatory cytokines by peripheral blood mononuclear cells
in cocultures with squamous cell carcinoma of the larynx*
Katarzyna Starska1, Marek Łukomski1, Henryk Tchórzewski2, Ewa Głowacka 2
SUMMARY
Purpose: Antitumor mechanisms of cellular immune response are connected with the
cytokines activity secreted by peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The aim of
this study was estimation of proinflammatory cytokine (IL-6 and TNF- ) concentration
in patients with laryngeal squamous cell carcinoma and analysis of directed influence
of neoplasm cells to the function of PBMC and modification of cytokine profile.
Materials and methods: For analysis of cytokine secretion, the cultures of isolated
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with marginal neoplasm cells and noncancerous adjacent mucosa cells from 55 patients with laryngeal squamous cell carcinoma were established. Production of cytokines in 21h and 72h culture supernatants
was detected by Elisa.
Results: Authors reported the increase of IL-6 and decrease of TNF- concentration in
cultures of isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with marginal neoplasm
cells and non-cancerous adjacent mucosa cells.
Conclusion: The presence of laryngeal squamous carcinoma cells in PBMC culture
can modify immunocompetent cells activity and production of proinflammatory
cytokines.
Hasła indeksowe: rak krtani, cytokiny prozapalne, jednojądrzaste komórki krwi
Key words: carcinoma larynx, proinfl ammatory cytokines, peripheral blood mo-
©by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów
– Chirurgów Głowy i Szyi
Otrzymano/Received:
05.05.2009
Zaakceptowano do druku/Accepted:
26.05.2009
1
Katedra Otolaryngologii, Klinika Laryngologii
Onkologicznej UM w Łodzi
Kierownik Kliniki: Prof. dr hab. med.
M. Łukomski
2
Zakład Immunologii Klinicznej ICZMP w Łodzi
Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. med.
H. Tchórzewski
Wkład pracy autorów/Authors contribution:
Według kolejności
Konflikt interesu/Conflicts of interest:
Autorzy pracy nie zgłaszają konfliktu interesów.
Adres do korespondencji/
Address for correspondence:
imię i nazwisko: Katarzyna Starska
adres pocztowy:
Klinika Otolaryngologii UM
ul. Kopcińskiego 22
90-153 łódź
tel. 42 678 57 85
fax 42 678 57 85
e-mail [email protected]
nonuclear cells
Wstęp
Rola komórek immunokompetentnych w chorobie nowotworowej nie jest do końca wyjaśniona. Liczne badania
doświadczalne wskazują na aktywność mechanizmów
komórkowej odpowiedzi immunologicznej w walce z komórkami nowotworowymi różnego pochodzenia. Wyjaśnienie interakcji międzykomórkowych w układzie
autologicznym (komórki nowotworowe <–> komórki
immunokompetentne gospodarza) może w przyszłości
warunkować postęp w rozwoju immunoterapii nowotworów, stworzeniu szczepionek przeciwnowotworowych
oraz stanowić wykładnik przebiegu choroby nowotworowej i być jednym z czynników prognostycznych
branych pod uwagę przy wyborze optymalnej metody
leczenia.
Odpowiedź immunologiczna skierowana przeciw
rozwijającemu się nowotworowi obejmuje różne mechanizmy komórkowe i humoralne. Mechanizmy efektorowe komórkowej odpowiedzi przeciwnowotworowej
związane są m.in. z aktywnością cytokin wydzielanych
przez limfocyty T, zarówno przez T CD4+ (pomocnicze
Th), jak i T CD8+ (cytotoksyczne Tc). Rola limfocytów
T cytotoksycznych polega na odróżnianiu i zabijaniu
komórek potencjalnie nowotworowych. Aktywacja
limfocytów T CD8+ odbywa się z udziałem uprzednio
pobudzonych limfocytów T CD4+ [1]. Pobudzone limfocyty CD4+ mają zdolność do produkowania szeregu
cytokin pozapalnych, regulatorowych oraz biorących
udział w procesie angiogenezy czy apoptozy. Największe
znaczenie w obronie przeciwnowotworowej i regulacji
oddziaływań między limfocytami i komórkami guza
pełnią cytokiny IL-2, Il-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18,
IFN-γ, TNF-α. Wywierają one działanie sprzyjające
rozwojowi odpowiedzi typu komórkowego, w którym
elementami efektorowymi są limfocyty CD8+ [1–24].
Również limfocyty CD8+ wykazują zróżnicowanie pod
względem rodzaju produkowanych cytokin. Interleukiny uwalniane przez limfocyty cytotoksyczne m.in.
IL-2, IFN-γ, TNF-α biorą udział w nasilaniu reakcji
komórkowych skierowanych przeciw komórkom nowotworowym (indukcja apoptozy m.in. w mechanizmie
* Praca finansowana z funduszy Komitetu Badań Naukowych Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego (Projekt KBN nr N403
04332/2326).
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
Otolaryngol Pol 2009;
63 (7 ): 35-42
36
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
FAS-FAS-L, przy udziale perforyn, granzym i kaspaz)
[1–24]. Istnieją jednak liczne dowody na znaczne upośledzenie mechanizmów obrony immunologicznej u chorych z nowotworami, w tym głównie z nowotworami
regionu głowy i szyi [24]. Działanie immunosupresyjne
nowotworu może polegać m.in. na blokowaniu reakcji
cytotoksycznych poprzez wydzielanie TGF-β (transforming growth factor), IL-10, PGE2 przez komórki guza.
Cytokiny te wykazują działanie supresyjne poprzez
blokadę funkcji limfocytów cytotoksycznych i komórek
NK lub aktywację limfocytów supresorowych [1].
Cytokiny spełniają istotną rolę w tworzeniu/wspomaganiu odporności przeciwnowotworowej. Znaczenie
tych czynników w onkologii klinicznej opiera się na próbach modyfikowania odpowiedzi immunologicznej.
Celem przeprowadzonych badań była:
1) ocena wydzielania cytokin prozpalnych (IL-6
i TNF-α) przez jednojądrzaste komórki krwi obwodowej
pacjentów z rakiem płaskonabłonkowym krtani,
2) próba określenia bezpośredniego oddziaływania
komórek nowotworowych raka krtani na funkcję komórek immunokompetentnych i modyfikację profilu
cytokinowego, prowadzonych w układzie autologicznym
(komórki nowotworowe <–> limfocyty T). Proponowane
badania stają się obecnie wiodącymi w immunopatologii
klinicznej chorób nowotworowych.
Materiał i metody
Badania dotyczyły 55 chorych na raka płaskonabłonkowego krtani, którzy zostali poddani leczeniu chirurgicznemu (laryngektomii całkowitej i operacji usunięcia
węzłów chłonnych szyi) lub leczeniu skojarzonemu tj.
chirurgicznemu i radioterapii. Chorzy byli operowani
w Klinice Laryngologii Onkologicznej Uniwersytetu
Medycznego w Łodzi, a leczenie uzupełniające zostało
przeprowadzone w Zakładzie Radioterapii Szpitala
Zespolonego im. M. Kopernika w Łodzi. Rozległość
zmian nowotworowych określono wg kryteriów klasyfikacji TNM (International Union Against Cancer (UICCTNM 2002). Charakterystykę kliniczno-morfologiczną
badanej grupy chorych przedstawia tabela I. Grupę
kontrolną stanowiło 14 zdrowych ochotników.
Celem przeprowadznia badań siedem mililitrów
świeżej krwi, pobranej z żyły łokciowej do probówki zawierającej heparynę litową (stężenie końcowe 10IU/mL),
rozcieńczano płynem hodowlanym o składzie: RPMI1640 (Biomed, Lublin, Poland) z dodatkiem 2Mm L-glutaminy oraz wzbogaconym 10% v/v płodowej surowicy
cielęcej FCS (Biochrom AG Seromed, Berlin, Germany),
100 U/mL penicyliny i 100 μg/mL streptomycyny (Sigma, USA), tak by uzyskać gęstość 1x106 komórek/mL.
Zgodę na wykonanie badań wyraziła Komisja Bioetyczna Uniwersytetu Medycznego w Łodzi w dniu 14
stycznia 2002 roku (Nr RNN/15/03/KN). Komórki
obrzeża guza (TMC – tumor marginal cells) oraz ko-
mórki niezmienionego nowotworowo nabłonka krtani
(NCC – non-cancerous cells) były izolowane z materiału
pooperacyjnego pobranego aseptycznie, z co najmniej
czterech różnych miejsc guza i z dwóch różnych miejsc
niezmienionego nabłonka krtani, do jałowego płynu
hodowlanego o składzie: RPMI-1640 (Biomed, Lublin,
Poland) z dodatkiem 1% v/v antybiotyków penicyliny,
streptomycyny, gentamycyny i przeciwgrzybiczego ketokonazolu (Sigma, Aldrich, Germany), natychmiast
po wykonaniu laryngektomii. Po mechanicznym rozdrobnieniu, fragmenty tkanki płukano trzykrotnie
płynem Hanksa (Biomed Lublin, Poland) a następnie
poddawano trawieniu enzymatycznemu z użyciem 0,16
mg/mL hialuronidazy (Sigma, Aldrich, Germany), 0,55
mg/mL kolagenazy (Sigma, Aldrich, Germany) z dodatkiem 1% v/v antybiotyków penicyliny, streptomycyny, gentamycyny i przeciwgrzybiczego ketokonazolu
(Sigma, Aldrich, Germany) i inkubowano 18 h w temp.
37°C w atmosferze 5% CO2 (Cellstar Incubator). Po
inkubacji fragmenty tkanki przecierano przez sitko
o ∅ 50 (Sigma-Aldrich), płukano trzykrotnie w PBS
bez jonów Ca++ i Mg++ (1800 obrotów/min, przez 20
minut, w temp. 8°C) a następnie zalewano roztworem
dyspaszy w stężeniu 2,4 U/mL, inkubowano w 30 minut
w temp. 37°C i zawieszano w 1ml PBS. Gęstość komórek
liczono przy użyciu komory Bürkera. Komórki martwe
usuwano za pomocą zestawu Dead Cell Removal. Czystość hodowli komórek nowotworowych w zawiesinie
komórkowej oceniana była z zastosowaniem obiektywnych metod immunomorfologicznych (oznaczanie
ekspresji filamentów cytokeratynowych metodą immunohistochemiczną – z użyciem polikonalnych przeciwciał przeciw pośrednim filamantom cytokeratynowym
NCL-C11, Multi-Cytokeratin 4/5/6/8/10/13/18, RTU-D
Novostatin Universal Detection Kit, NCL-L-DAB Liquid
DAB Substrate Kit; Novocastra, UK) – badania zostały
wykonane w Zakładzie Patomorfologii Klinicznej ICZMP
w Łodzi). Dla określenia wpływu komórek raka płaskonabłonkowego krtani na funkcję jednojądrzastych
komórek krwi obwodowej (PBMC) przeprowadzono
następujące interakcje: krew pełna (WB – whole blood),
krew pełna stymulowana PHA, autologiczne komórki
guza (TMC), autologiczne komórki niezmienionego
nowotworowo nabłonka (NCC) oraz hodowle mieszane
w następujących układach (w proporcjach 10:1): autologiczne PBMC + autologiczne komórki nowotworowe
części obwodowej guza (WBTMC), autologiczne PBMC
+ autologiczne komórki niezmienionego nowotworowo nabłonka (WBNCC), autologiczne PBMC + autologiczne komórki nowotworowe części obwodowej guza
w obecności PHA (WBTMCPHA), autologiczne PBMC
+ autologiczne komórki niezmienionego nowotworowo
nabłonka w obecności PHA (WBNCCPHA). W badaniach
był oceniany efekt interakcji między tymi komórkami
stosując inkubacje 21 i 72 h godzinne w temp. 37°C,
w atmosferze 5% CO2. W nadsączach hodowlanych
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
podanych układów komórek (1 x 106 komórek PBMC
i 1 x 105 komórek nowotworowych) oceniono produkcję
wybranych cytokin: TNF-α i IL-6. Stężenie wytwarzanych cytokin określone zostało metodą Elisa (Enzyme
Linked Immuno Absorbent Assay) – stosując zestawy
opt EIA firmy Pharmingen, postępując zgodnie z procedurą podaną przez producenta. Absorbancję próbek
odczytywano przy użyciu czytnika Elx808, Bio-Tek
Instruments, USA). Badania immunologiczne wykonano w Zakładzie Immunologii Klinicznej Instytutu
Centrum Zdrowia Matki Polki w Łodzi. W analizie
statystycznej uzyskanych wyników zastosowano test
dwuczynnikowej wariancji ANOVA, przy poziomie istotności p ≤ 0,05.
Tabela I. Kliniczno-morfologiczna charakterystyka badanej grupy chorych z rakiem płaskonabłonkowym krtani
Cecha
Liczebność grupy N (%)
Płeć
Mężczyźni
Kobiety
53 (96,4)
2 (3,6)
Częściowe usunięcie krtani
Całkowite usunięcie krtani
Operacja usunięcia węzłów chłonnych szyi
Selektywna operacja węzłowa (SND)
Radykalna operacja węzłowa (RND)
22 (40,0)
33 (60,0)
22 (40,0)
20 (36,4)
2 (3,6)
pT2
pT3
pT4
14 (25,4)
21 (38,2)
20 (36,4)
pN0
pN1-3
pN1
pN2
pN3
39 (70,9)
16 (29,1)
7 (12,7)
4 (7,3)
5 (9,1)
G1
G2
G3
4 (7,3)
44 (80,0)
7 (12,7)
Leczenie chirurgiczne
pT
Wyniki
W przeprowadzonych doświadczeniach oceniono stężenie IL-6 i TNFα w nadsączach krwi pełnej w 21h
inkubacji, w układach badawczych bez stymulacji
mitogenem oraz po stymulacji fitohemaglutyniną (PHA).
Porównano średnie wartości stężeń wydzielanych cytokin prozapalnych w grupie badanej i kontrolnej.
Nie zanotowano różnic istotnych statystycznie między wartościami średnich stężeń wydzielanych IL-6
i TNFα w analizowanych grupach badawczych, zarówno w układach doświadczalnych bez stymulacji,
jak i po stymulacji PHA. Analiza wyników w badanych
układach doświadczalnych, pomimo niewystępowania
znamiennych statystycznie różnic dla średnich wartości stężeń IL-6 i TNFα wykazała występowanie zauważalnych tendencji: średnie wartości stężeń IL-6, IL-8,
TNFα w nadsączach krwi pełnej, zarówno w układach
bez stymulacji, jak po stymulacji fitohemaglutyniną
pN
Zróżnicowanie histopatologiczne G
PHA, były wyższe w grupie badanej, w porównaniu
z poziomem cytokin, oznaczonych w grupie kontrolnej. Wyjątek stanowiły układy badawcze, w których
średnie wartości stężeń IL-6 w 21h inkubacji, w doświadczeniu bez stymulacji PHA, były niższe w grupie
kontrolnej w porównaniu z wynikami grupy badanej,
Tabela II. Stężenia cytokin prozapalnych i regulatorowych w nadsączach krwi pełnej w grupie badanej i kontrolnej
Układ doświadczalny
Grupa badana
Grupa badana N=55
Grupa kontrolna N=21
układ bez stymulacji mitogenem
t
IL-6 ± SEM [ng/mL]
TNFα ± SEM
[pg/mL]
21h
63,1 ± 7,05
345,3 ± 39,38
72h
136,9 ± 29,89
132,2 ± 28,11
21h
57,7 ± 7,03
396,9 ± 63,48
72h
141,3 ± 26,53
141,9 ± 17,84
Układ doświadczalny
Grupa badana
Grupa badana N=55
Grupa kontrolna N=21
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
37
układ ze stymulacją fitohemaglutyniną (PHA)
t
IL-6 ± SEM [ng/mL]
TNFα ± SEM
[pg/mL]
21h
94,6 ± 15,34
478,9 ± 68,51
72h
147,5 ± 33,81
173,6 ± 44,58
21h
84,6 ± 11,25
494,1 ± 84,26
72h
166,5 ± 30,62
180,4 ± 25,19
38
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela III. Wydzielanie IL-6 w nadsączach krwi pełnej w mieszanych układach doświadczalnych
Badany układ doświadczalny
Badana cytokina
t
21h
IL-6 [ng/mL]
72h
układ bez stymulacji mitogenem
Układ badawczy (N = 24)
Krew pełna (WB)
42,6±5,74
Krew pełna + NCC (WBNCC)
57,8±8,68
Krew pełna (WB)
42,6±5,74
Krew pełna + TMC (WBTMC)
54,4±7,96
Krew pełna (WB)
58,0±13,97
Krew pełna + NCC (WBNCC)
63,1±15,26
Krew pełna (WB)
58,0±13,97
Krew pełna + TMC (WBTMC)
62,8±11,94
Badany układ doświadczalny
21h
IL-6 [ng/mL]
72h
Średnia wartość stężenia ± SEM
0,004
0,01
> 0,05
> 0,05
układ ze stymulacją fitohemaglutyniną (PHA)
Krew pełna (WB)
51,3±4,44
Krew pełna + NCC (WBNCC)
69,6±10,27
Krew pełna (WB)
51,3±4,44
Krew pełna + TMC (WBTMC)
68,9±9,01
Krew pełna (WB)
82,1±19,60
Krew pełna + NCC (WBNCC)
69,0±16,17
Krew pełna (WB)
82,1±19,60
Krew pełna + TMC (WBTMC)
70,2±12,89
choć zaobserwowano tendencję do wyższych wartości
średnich stężeń badanych cytokin w grupie badanej.
Wartości średnich stężeń wydzielanych IL-6 i TNF
w badanych układach doświadczalnych przedstawiono
w tabeli II.
W przeprowadzonych doświadczeniach oceniono stężenie IL-6 i TNFα w nadsączach krwi pełnej,
w dwóch punktach czasowych (w 21 h i 72 h inkubacji),
w mieszanych układach badawczych bez stymulacji mitogenem oraz po stymulacji fitohemaglutyniną
(PHA). Porównano średnie wartości stężeń cytokin
prozapalnych i regulatorowych, w określonym czasie
inkubacji, w układach doświadczalnych utworzonych
tylko z krwi pełnej i po dodaniu do krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych (TMC),
w zależności od czasu inkubacji. Wykonano również
ocenę średnich wartości stężeń badanych interleukin
po dodaniu do krwi pełnej komórek prawidłowego
nabłonka krtani (NCC), jako układów badawczych
kontrolnych.
Analiza danych wykazała znamienny wzrost wartości średniego stężenia IL-6 w nadsączach układów
mieszanych krwi pełnej, w układach badawczych bez
stymulacji PHA, po dodaniu do krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych (TMC)
p
> 0,05
> 0,05
> 0,05
> 0,05
(p = 0,004), jak też komórek prawidłowego nabłonka
krtani (NCC) (p = 0,01), ocenionych w 21 h inkubacji.
Wzrost wydzielania IL-6 był wyższy w kontrolnym
układzie mieszanym krwi pełnej z komórkami prawidłowymi NCC w porównaniu z układem badawczym
z komórkami nowotworowymi TMC. W analizowanych
układach badawczych, ocenionych w 72 h inkubacji
nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic między
średnimi wartościami stężeń IL-6 (p > 0,05), chociaż
wartości średnich stężeń dla IL-6 były wyższe w układach mieszanych. W analizowanych układach badawczych stwierdzono wzrost wartości średniego stężenia
IL-6 w nadsączach układów mieszanych, po dodaniu
do krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych (TMC), i komórek prawidłowego
nabłonka krtani (NCC), ocenionych zarówno w 21h jak
i 72h inkubacji, w układach badawczych po stymulacji
PHA. Różnica wydzielania IL-6 w badanych doświadczeniach nie była jednak znamienna statystycznie (p
> 0,05). Wyniki wydzielania IL-6 w nadsączach krwi
pełnej w mieszanych układach doświadczalnych przedstawiono w tabeli III.
Analiza danych wykazała znamienny spadek wartości średniego stężenia TNFα w nadsączach układów
mieszanych krwi pełnej, w układach badawczych bez
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela IV. Wydzielanie TNFα w nadsączach krwi pełnej w mieszanych układach doświadczalnych
Badany układ doświadczalny
Badana cytokina
t
21h
TNFα [pg/mL]
72h
układ bez stymulacji mitogenem
Układ badawczy (N = 24)
Krew pełna (WB)
410,1±73,68
Krew pełna + NCC (WBNCC)
267,2±47,10
Krew pełna (WB)
410,1±73,68
Krew pełna + TCC (WBTMC)
286,9±58,29
Krew pełna (WB)
243,7±53,99
Krew pełna + NCC (WBNCC)
143,7±25,01
Krew pełna (WB)
243,7±53,99
Krew pełna + TCC (WBTMC)
136,7±30,15
Badany układ doświadczalny
21h
TNFα [pg/mL]
72h
Średnie stężenie ± SEM
642,7±139,71
Krew pełna + NCC (WBNCC)
366,8±68,74
Krew pełna (WB)
642,7±139,71
Krew pełna + TCC (WBTMC)
369,2±62,08
Krew pełna (WB)
324,7±100,14
Krew pełna + NCC (WBNCC)
158,5±34,97
Krew pełna (WB)
324,7±100,14
Krew pełna + TCC (WBTMC)
177,1±38,04
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
0,001
0,001
0,03
0,01
układ ze stymulacją fitohemaglutyniną (PHA)
Krew pełna (WB)
stymulacji PHA, po dodaniu do krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych (TMC) (p
= 0,001), oraz komórek prawidłowego nabłonka krtani
(NCC) (p = 0,001), ocenionych w 21h inkubacji. W analizowanych układach badawczych, ocenionych w 72h
inkubacji stwierdzono również istotny statystycznie
spadek średnich wartości stężeń TNFα po dodaniu do
krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych (TMC) (p = 0,03), i komórek prawidłowego
nabłonka krtani (NCC) (p = 0,01). Wartości średnich
stężeń TNFα w układach komórkowych mieszanych
były zbliżone. W analizowanych układach badawczych
stwierdzono spadek wartości średniego stężenia TNFα
w nadsączach układów mieszanych, po dodaniu do
krwi pełnej wyizolowanych komórek nabłonkowych
krtani, ocenionych zarówno w 21 h oraz 72 h inkubacji,
w układach badawczych po stymulacji PHA. Analiza
statystyczna wykazała znamienny spadek wartości
średniego stężenie TNFα w nadsączach układów mieszanych krwi pełnej po dodaniu do krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych
(TMC) (p < 0,001) jak i komórek prawidłowego nabłonka
krtani (NCC) (p < 0,001), ocenionych w 21 h inkubacji.
W analizowanych układach badawczych, ocenionych
w 72h inkubacji stwierdzono także istotne statystycznie
p
< 0,001
< 0,001
0,02
0,02
zmniejszenie wartości średnich stężeń TNFα, zarówno
po dodaniu do krwi pełnej wyizolowanych nabłonkowych komórek nowotworowych (TMC) (p = 0,02)
oraz komórek prawidłowego nabłonka krtani (NCC)
(p = 0,02). Wyniki wydzielania TNFα w nadsączach krwi
pełnej w mieszanych układach badawczych przedstawiono w tabeli IV.
Dyskusja
Komórki immunokompetentne, a w szczególności limfocyty T, zarówno pomocnicze CD4+, jak i limfocyty cytotoksyczne CD8+ pełnią istotną rolę w immunologicznej
komórkowej odpowiedzi przeciwnowotworowej [1-24].
Komórki te nasilają lub hamują odpowiedź immunologiczną, działając zarówno we krwi krążącej, jak też
w miejscu rozrostu procesu nowotworowego, poprzez
wydzielanie określonych cytokin – regulacyjnych, prozapalnych, biorących udział w procesie angiogenezy
czy apoptozy m.in. TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8,
IL-10 [1-24]. Ostatnie doniesienia dotyczące oceny
wydzielania cytokin w różnych nowotworach m.in.
raku płuca, raku szyjki macicy i jajnika wskazują,
że interleukiny wydzielane przez limfocyty T, zarówno w badaniach limfocytów naciekających guzy (TIL
39
40
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
– tumor infiltrating lymphocytes), limfocytów krążących
we krwi oraz limfocytów w przerzutowo zmienionych
regionalnych węzłach chłonnych mają istotne znaczenie w mechanizmach regulacyjnych w układzie
komórka nowotworowa – immunokompetentne komórki gospodarza [25–27]. Ich poznanie pozwoliłoby na
lepsze zrozumienie regulacji miejscowej komórkowej
odpowiedzi immunologicznej, zachodzącej w przebiegu
procesu nowotworowego. W przyszłości badania nad
immunologią nowotworów umożliwią poznanie mechanizmów immunologicznych w przebiegu choroby
nowotworowej, ale również praktyczne wykorzystanie
omawianych zjawisk m.in. wybór optymalnego modelu
leczenia, prognozowanie przebiegu choroby, postęp
w immunoterapii w chorobach nowotworowych.
W dostępnym piśmiennictwie można znaleźć tylko
nieliczne prace, w których oceniane było wydzielanie
różnych cytokin w hodowlach komórek nowotworowych
wyizolowanych bezpośrednio z guza. Częściej badane
są interakcje międzykomórkowe z zastosowaniem wyprowadzonych linii komórkowych, co nie może pozostać
bez wpływu na uzyskiwane wyniki. Porównywanie
danych analizowanych w tych pracach, nawet jeśli
dotyczą one tego samego nowotworu, w tym przypadku raka płaskonabłonkowego krtani, różnią się i nie
mogą stanowić jednoznacznego punktu odniesienia
w prowadzonej dyskusji. Nie bez znaczenia pozostaje
dobór i niejednorodność grup badawczych, zastosowanie odmiennych technik oceny stężeń oraz profil
analizowanych cytokin. Yano i wsp. [28] analizując
chorych z rakiem płuca oznaczyli ten sam poziom
IFN-α w hodowli limfocytów z krwi obwodowej, jak
i naciekających guz po stymulacji przeciwciałami
anty-CD3, oceniając stężenia IFN-α w supernatancie
hodowli, ale jednocześnie nie stwierdzili produkcji
IFN-α bez stymulacji. Roussel i wsp. [29] wykazali,
że gen IFN-α nie wykazywał zwiększonej ekspresji
w limfocytach T u pacjentów z rakiem płuca. Palmer
i wsp. [30] sugerują, że produkowane przez komórki nowotworowe cytokiny m.in. IL-10 wpływają supresyjnie
na różnicowanie limfocytów T oraz na produkcję cytokin. Inni autorzy analizowali wydzielanie IFN-α i IL-4
przez limfocyty krążące we krwi obwodowej, limfocyty
obecne w regionalnych węzłach chłonnych objętych
przerzutem oraz naciekające guz. Badania Ito i wsp.
[25] wykazały, że dominującą populacją są limfocyty
wydzielające IFN-α. Nakamura i wsp. [31] podkreślają
jednak, że komórki te nie wykazują wystarczających
właściwości cytotoksycznych przeciwko autologicznym
komórkom nowotworu. Liczni autorzy sugerują, że
jedną z przyczyn jest fakt, iż limfocyty T rozpoznają
tylko niespecyficzne antygeny na powierzchni komórek
guza. Bardziej prawdopodobny mechanizm polega na
blokowaniu cytotoksycznej odpowiedzi przez zmniejszoną prezentację antygenów nowotworowych lub
immunosupresyjne działanie czynników wydziela-
nych przez guz tj. IL-10 lub TGF-α [32, 31]. W innych
badaniach w inwazyjnym raku sutka stwierdzono
znaczną ekspresję genów TNF-α, IL-2 i IFN-γ, podczas gdy w guzach jajnika ekspresja tych genów była
niewielka. Badania te dowodzą, że różnice w ekspresji
genów cytokinowych w komórkach naciekających guz
mogą wynikać ze zdolności komórek nowotworowych
do aktywowania i regulowania funkcji komórek immunokompetentnych [1-27]. W piśmiennictwie podkreśla
się znaczenie cytokin prozapalnych w regulowaniu
mechanizmów związanych z progresją guza i dalszą
prognozą u pacjentów z chorobą nowotworową [3, 5–11,
13, 15, 17-21]. Podwyższony poziom cytokin IL-6 i IL-8
w modelu in vivo raka płaskonabłonkowego głowy i szyi
oraz rolę interleukin prozapalnych jako czynników
sprzyjających występowaniu przerzutów wykazali
Wolf i wsp. [5]. Znaczenie wydzielanych cytokin, w tym
prozapalnych (IL-2, IL-6, IL-8, IL-12 i IFNγ), w progresji
guza i powstawaniu przerzutów w raku trzustki potwierdzili również Bellone i wsp. [8]. Pries i wsp. [6, 7]
także podkreślili istotne znaczenie cytokin zapalnych
i proangiogennych w regulacji agresywności wzrostu
guza nowotworowego oraz odpowiedzi na leczenie
(radio- i chemioterapię). Liczni badacze poszukują
związku między poziomem wydzielanych cytokin przez
limfocyty krwi obwodowej i podścieliska nowotworowego a przebiegiem klinicznym choroby oraz rozległością
miejscową i węzłową guza [10, 11, 13, 16–21]. Lathers
i wsp. [10, 13] w badaniach ekspresji cytokin: IL-2,
IFNγ, IL-4, IL-6, IL-10 w rakach płaskonabłonkowych
regionu głowy i szyi, także potwierdzili występowanie
związku między poziomem cytokin w surowicy krwi
chorych i zaawansowaniem zmian nowotworowych
T i N. Autorzy zanotowali wzrost wydzielania badanych
cytokin wraz z wyższym stopniem zaawansowania
zmian. Podobnie, wysokie stężenia IL-6 w surowicy
krwi pacjentów z zaawansowanym rakami płaskonabłonowymi regionu głowy i szyi zanotowali Sparano
i wsp. [11]. Autorzy potwierdzili wzmożone wydzielanie
IL-6 i IL-10 w badanej grupie chorych a wzrost poziomu
cytokin korelował z wyższym stopniem cechy T i N.
Ueda i wsp. [21] potwierdzili zastosowanie oznaczania
stężenia w surowicy chorych IL-6 i IL-8 jako wskaźników przebiegu choroby nowotworowej u pacjentów
z rakiem jelita grubego. Badacze zanotowali znamienny
związek poziomu IL-8 w surowicy z histologicznym
typem guza i stopniem zaawansowania zmian oraz
wykazali korelację wysokiego stężenia IL-6 i IL-8
z obecnością przerzutów węzłowych. Wielu autorów
podkreśla, że kontakt komórek immunokompetentnych
z komórkami nowotworowymi może być przyczyną
upośledzonej odpowiedzi immunologicznej na rozwijający się proces nowotworowy. Ponieważ limfocyty T
cytotoksyczne pełnią główną rolę w immunologicznej
odpowiedzi przeciwnowotworowej, to właśnie zmiana
w wydzielaniu cytokin jest bezpośrednio związana
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
z zaburzeniem cytotoksycznych właściwości limfocytów T.
11. Sparano A, Lathers DM, Achilles N, Petruzzelli GJ, Young
MR. Modulation of Th1 and Th2 cytokine profiles and their
association with advanced head and neck squamous cell
Wnioski
carcinoma. Otolaryngol. Head Neck Surg. 2004; 131(5):
573-576.
1. W badaniach in vitro, komórki raka płaskonabłonkowego krtani wykazują wpływ na aktywność
komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, modyfikując wydzielanie przez nie cytokin prozapalnych
IL-6 i TNF-α.
2. Obecność komórek nowotworowych w hodowli
limfocytów T powoduje zmniejszone wydzielanie IL-6
oraz zwiększone wydzielanie TNF-α.
12. Toutirais O, Chartier P, Dubois D, Bouet F, Leveque J, Ca-
PIŚMIENNICTWO
14. Pignataro L, Corsi MM, Sambataro G, Porcaro L, Tredici
tros-Quemener V, Genetet N. Constitutive expression of
TGF-beta1, interleukin-6 and interleukin-8 by tumor cells
as a major component of immune escape in human ovarian
carcinoma. Eur. Cytokine Netw. 2003; 14(4): 246-255.
13. Lathers DM, Achille NJ, Young MR. Incomplete Th2 skewing of cytokines in plasma of patients with squamous
cell carcinoma of head and neck. Hum. Immunol. 2003;
64(12):1160-1166.
1.
Płużańska A, Dyczka J. Immunologia i immunoterapia no-
P, Broich G. Plasmatic cytokine network in patients with
wotworów. W Immunologia kliniczna. Kowalski M. (red.).
laryngeal carcinoma after surgical treatment. Anticancer
Mediton; 2002.
2.
15. Chen Z, Malhotra PS, Thomas GR, Ondrey FG, Duffey DC,
T, Nagata Y i wsp. Cytokine production of lung cancer
Smith CW i wsp. Expression of proinflammatory and pro-
cell lines: Correlation between their production and the
angiogenic cytokinez in patients with head and neck can-
inflammatory/immunological responses both in vivo and
in vitro. Cancer Sci. 2007; 98(7): 1048-1054.
3.
Pries R, Thiel A, Brocks C, Woldenberg B. Secretion of tu-
Park i wsp. Establishment and characterization of human
laryngeal squamous cell carcinoma cell lines. Larygoscope
2006; 20(1): 45-48.
Jiang C, Ye D, Qiu W, Zhang X, Zhang Z, He D i wsp. Re-
Disease stage related in vitro responsiveness of peripheral
blood T-lymphocytes in patients with head and neck car-
us cell carcinomas induced by 4NQO. BMC Cancer 2007;
ne expression of transforming growth factor-beta2 and in-
Wolf JS, Li G, Varadhachary A, Petrak K, Schneyer M, Li
terleukin-10 in squamous cell carcinomas of the head and
D i wsp. Oral lactoferrin results in T-cell dependent tumor
neck. Comparison of tissue expression and serum levels.
vivo. Clin. Cancer Res. 2007; 1, 13(5): 1601-1610.
Pries W, Wollenberg B. Cytokines in head and neck cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 2006; 17(3): 141-146.
7.
8.
HNO 1999; 47(10): 879-884.
19. Chopra V, Dinh TV, Hannigan EV. Circulating serum levels of cytokinez and angiogenic factors in patients with
cervical cancer. Cancer Invest. 1998; 16(3): 152-159.
Pries R, Nitsch S, Wollenberg B. Role of cytokines in head
20. Oka M, Yamamoto K, Takahashi M, Hakozaki M, Abe T,
and neck squamous cell carcinoma. Expert Rev. Antican-
Lizuka N i wsp. Relationship between serum levels of in-
cer Ther. 2006; 6(9): 1195-1203.
terleukin 6, various disease parameters and malnutrition
Bellone G, Smirne C, Mauri FA, Tonel T, Carbone A, Buffo-
in patients with esophageal squamous cell carcinoma.
lino A i wsp. Cytokine expression profile in human pancre-
9.
cinoma. Acta Otoalryngol. 1998; 118(6): 887-891.
18. Karcher J, Reissem C, Daniel V, Herold-Mende C. Cytoki-
7: 40-46.
inhibition of head and neck squamous cell carcinoma in
6.
1999; 109(6): 976-982.
17. Heimdal JH, Aarstad HJ, Klementsen B, Oloffson J.
sponse of lymphocyte subsets and cytokines to Shenyang
prescription in Sprague-Dawley rats with tongue squamo-
5.
cer. Clin. Cancer Res. 1999; 5(6): 1369-1379.
16. Ku JL, Kim WH, Lee JH, Park HS, Kim HM, Sung MW,
mor-promoting and immune suppresive cytokines by cell
lines of head and neck squamous cell carcinoma. In Vivo
4.
Res. 2001; 21(5): 3621-3625.
Fukuyama T, Ichiki Y, Hamada S, Shigematsu Y, Baba
Cancer Res. 1996; 56 (12): 2776-2780.
atic carcinoma cells and in surgical specimens: implica-
21. Ueda T, Shimada E, Urakawa T. Serum levels of cytokines
tions for survival. Cancer Immunol. Immunother. 2005;
in patients with colorectal cancer: possible involvement of
11:1-15.
interleukin-6 and interleukin-8 in hematogenous meta-
Thomas GR, Chen Z, Leukinova E, Van Waes C, Wen J.
stasis. J. Gastroenterol. 1994; 29(4): 423-429.
Cytokines IL-1 alpha, IL-6, and GM-CSF constitutively
22. Chen Z, Colon I, Ortiz N, Callister M, Dong G, Pegram MY
secreted by oral squamous carcinoma induce down-re-
i wsp. Effects of interleukin-1 , interleukin-1 receptor an-
gulation of CD80 costimulatory molekule`expression: re-
tagonist and neutralizing antibody on proinflammatory
storation by interferon gamma. Cancer Immunol. Immu-
cytokine expression by human squamous cell carcinoma
nother. 2004; 53(1): 3-40.
lines. Cancer Res. 1998; 58: 3668-3676.
10. Lathers DM, Young MR. Increased aberrance of cytokine
23. Woods KV, El-Nagger A, Clayman G, Grimm EA. Variable
expression in plasma of patients with more advanced squ-
expression of cytokines in human head and neck squamo-
amous cell carcinoma of head and neck. Cytokine 2004; 7,
us cell carcinoma cell lines and consistent expression in
25(5): 220-228.
surgical specimens. Cancer Res. 1998; 58: 3132-3141.
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
41
42
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
24. Golusiński W, Szyfter K, Biczysko W. Badania genetyczne
29. Roussel E, Gingras MC, Grimm EA, Roth JA. High expres-
i immunologiczne. W Rak krtani i gardła dolnego. Jan-
sion of adhesion molecules/activation markers with little
czewski G, Osuch-Wójcikiewicz E. (red.). α-medica press
interleukin-2, interferon- , and tumor necrosis factor gene
2002.
activation in fresh tumor-infiltrating lymphocytes from
25. Ito N, Suzuki Y, Taniguchi Y, Ishiguro K, Nakamura H,
Ohgi S. Prognostic significance of T helper 1 and 2 and T
cytotoxic 1 and 2 cells in patients with non-small cell lung
cancer. Anticancer Res. 2005; 25: 2027-2031.
26. Sheu BC, Lin RH, Lien HC, Ho HN, Hsu SM, Huang
SC. Predominant Th2/Tc2 polarity of tumor-infiltrating
lymphocytes in human cervical cancer.J Immunol. 2001;
167(5): 2972-2978.
27. Santin AD, Hermonat PL, Ravaggi A, Bellone S, Roman
JJ, Smith CV i wsp. Phenotypic and functional analysis
lung adenocarcinoma. Cancer Immunol. Immunother.
1995; 41: 1-9.
30. Palmer EM, Seventr GA. Human T helper cell differentation is regulated by the combined action of cytokines and
accessory cell dependent costimulatory signals. J. Immunol. 1997; 158: 2654-2662.
31. Nakamura H, Ishiguro K, Mori T. Different immune function of peripheral blood, regional lymph node, and tumor
infiltrating lymphocytes in lung cancer patients. Cancer
1988; 62: 2489-2497.
of tumor-infiltrating lymphocytes compared with tumor-
32. Bellone G, Turletti A, Artusio E, Mareshi K, Carbone A.,
associated lymphocytes from ascitic fluid and peripheral
Tibaudi D i wsp. Tumor-associated transforming growth
blood lymphocytes in patients with advanced ovarian can-
factor-β and interleukin-10 contribute a systemic Th2 im-
cer. Gynecol Obstet Invest. 2001; 51(4): 254-261.
mune phenotype in pancreatic carcinoma patients. Am. J.
28. Yano T, Yasumoto K, Togami M, Ishida T, Kimura G, Su-
Pathol. 1999; 155: 537-547.
gimachi K i wsp. Properties of recombinant interleukin2-cultured tumor-infiltrating lymphocytes in human lung
cancer. Int. J. Cancer 1989; 43: 619-623.
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9