Udzial IFN-gamma i TNF-alfa w etiopatogenezie polipów nosa

W. Pietruszewska i inni
Udział IFN-gamma i TNF-alfa w etiopatogenezie
polipów nosa – badania wstępne*
Role of IFN-gamma and TNF-alpha in etiology
of nasal polyps – initial studies
Wioletta Pietruszewska1, Izabela Olejniczak2,
Tomasz Durko1, Wojciech Młynarski3
1Katedra
i Klinika Otolaryngologii UM w Łodzi, Szpital Uniwersytecki im. N. Barlickiego
Kierownik: prof. dr hab. med. T. Durko
2Klinika Onkologii Laryngologicznej Katedry Otolaryngologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: prof. dr hab. med. M. Łukomski
3Zakład Immunopatologii i Genetyki, Klinika Chorób Dzieci I Katedry Pediatrii
Uniwersytetu Medycznego w Łodzi
Kierownik: prof. dr hab. med. W. Młynarski
Summary
Objective. Nasal polyposis is a chronic inflammatory disease of the nasal mucosa. The pathogenesis of nasal polyps is still not
entirely known and has been debated for many years. The aim of the present study was to evaluate the expression of interferon
gamma and TNF-alpha secreted by Th1 lymphocytes and to analyze their role in the etiology of nasal polyps. Methods. 12
patients with nasal polyposis were selected – 6 of them allergic and 6 non-allergic. Patients with allergy were distinguished from
those without allergy on the basis of positive allergy skin tests to dust and serum levels of IgE. Blood sample was obtained from
patients and examined for the expression of IFN-gamma and TNF-alpha by intracellular staining procedure after stimulation
with PMA/ionomycin and allergen. Results. Negative correlation was found between expression of IFN-gamma and TNF-alpha
after PMA/ionomycin stimulation and allergen stimulation (p > 0,05). Statistical analysis of two groups of patients demonstrated that no significant differences in the cytokine expression in allergic versus non-allergic patients were observed although
mean value of IFN-gamma and TNF-alpha were lower in allergic patients in comparison to non-allergic (p > 0,05). We didn’t
observed any correlation between expression of INF-gamma and TNF-alpha and: coexistence of bronchial asthma, allergy to
aspirin and local corticosteroid treatment. In patients with recurrent polyposis the expression of INF-gamma was significantly
lower (p = 0,05). Conclusion. This research suggests that IFN-gamma and TNF-alpha play a role in the pathogenesis of nasal
polyps but the allergic mechanism may not play a fundamental role in this process. It needs further investigations.
H asła i n d e ks ow e : IFN-gamma, TNF-alfa, cytokiny, polipy nosa
Key w ord s : IFN-gamma, TNF-alfa, cytokines, nasal polyps
Otolaryngol Pol 2008; LXII (1): 54–58 © 2008 by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów – Chirurgów Głowy i Szyi
WSTĘP
Dane dotyczące polipów nosa i ich leczenia
pojawiają się już w historii starożytnego Egiptu,
a także w zapisach sprzed trzech tysięcy lat z Indii.
Jednak nazwę polipy najprawdopodobniej wprowa-
dzili Grecy. Pierwszym, który dokładnie opisał tę
jednostkę chorobową oraz zaproponował metody
leczenia, zarówno zachowawczego, jak i chirurgicznego, stosowane do XIX wieku, był Hipokrates
z Kos. Patomechanizm powstawania polipów nosa
nadal pozostaje kwestią sporną i istnieje wiele na
*Praca finansowana z prac własnych Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr 502-11-453.
Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.
54
Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1
IFN-gamma i TNF-alfa w etiopatogenezie polipów nosa
ten temat teorii. W ostatnich latach uważa się, że
polipy nosa są wynikiem wielu czynników, w tym:
uszkodzenia nabłonka, odczynów komórkowych
i uszkodzenia autonomicznego układu nerwowego.
Stwierdzono częstsze występowanie polipów nosa
u chorych z całorocznym alergicznym nieżytem
nosa, w tym z uczuleniem na antygeny roztocza.
W patomechanizmie polipów nosa istotną rolę
odgrywa proces zapalny i udział komórek immunologicznych oraz produkowanych przez nie cytokin
[11, 12]. U większości chorych z polipami nosa
znamienne jest mnogie występowanie eozynofilów,
jednak w niektórych przypadkach są one pojedyncze [1]. Eozynofilia związana jest z nadmierną aktywacją limfocytów subpopulacji Th2 i wydzielania
przez nie charakterystycznych cytokin: Il-3, Il-4,
Il-5, Il-13 i GM-CSF. Rola wspominanych cytokin
u chorych z polipami nosa była niejednokrotnie
badana. Podkreśla się również istotny udział w patogenezie zmian przerostowych w nosie cytokin należących do subpopulacji Th1: Il-2, Il-12, Il-18, IFNgamma, TNF-alfa, badania ich dotyczące stanowią
jednak pojedyncze doniesienia. Produkowane przez
limfocyty Th1 interferony (IFN) stanowią grupę
białek wytwarzanych przez komórki w odpowiedzi
na zakażenia wirusowe lub stymulację antygenową
i wykazujących różnorodną aktywność biologiczną.
Naturalne interferony można uzyskać z krwinek
białych (IFN-alfa), fibroblastów (IFN-beta) lub aktywowanych limfocytów (IFN-gamma). W warunkach
fizjologicznych interferony wpływają na funkcję
różnych komórek i mogą regulować ekspresję niektórych genów. Z tego względu mają one istotny
wpływ na utrzymanie homeostazy komórkowej.
Cytokiny te w największym stopniu oddziałują na
procesy immunologiczne, hematopoezę i rozwój
tkanek embrionalnych. Biorą one udział we wczesnej reakcji obronnej organizmu, zwłaszcza w zakażeniach wirusowych, bakteryjnych i pierwotniakowych. Interferony wykazują ponadto aktywność
przeciwnowotworową, oddziałując pośrednio i bezpośrednio na komórki nowotworowe. Hamują one
aktywność syntetazy 2’5’-oligoadenylowej i modulują onkogeny komórkowe, zwłaszcza C-myc, cfos i c-H ras, a w konsekwencji wydłużają cykl
komórkowy. Ponadto wywołują usunięcie metabolitów niezbędnych dla podziałów komórkowych
i hamują aktywację dekarboksylazy ornitynowej
[3, 7]. Interferon gamma (IFN-gamma) wywiera
działanie immunomodulujące, przeciwnowotworowe, przeciwwirusowe i antyproliferacyjne. Ma
on istotne znaczenie w regulacji procesów immu-
Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1
nologicznych, gdyż zmienia fenotyp limfocytów B
i stymuluje ich różnicowanie do komórek plazmatycznych wydzielających immunoglobuliny. IFNgamma indukuje powstawanie cytotoksycznych
limfocytów T, aktywuje makrofagi, wywierając tym
samym podobny wpływ do IL-2. Badania wykazały,
że istotny w mechanizmie tworzenia polipów nosa
IFN-gamma jest najczęstszym produktem komórek
zapalnych: limfocytów Th i Tc. Nasila on chemotaksję i aktywację eozynofilów u chorych z polipami nosa oraz indukuje syntezę kolagenu przez
fibroblasty (4). IFN-gamma uznawany jest za jeden
z czynników przyczynowych i nasilających proces
zapalny. Wykazuje on działanie immunomodulacyjne, hamuje syntezę przeciwciał IgE oraz proliferację
i aktywność limfocytów Th2. Istnieje udowodniona
doświadczalnie, odwrotna korelacja między produkcją Interleukiny-4 a IFN-gamma: obydwie te
cytokiny wywierają przeciwstawne działanie na
powstawanie IgE oraz inne cechy zapalenia alergicznego [6, 16].
Badania nad etiologią polipów nosa obejmują
również udział czynnika martwicy nowotworów
alfa (TNF-alfa) syntetyzowanego przez komórki Th1.
TNF-alfa jest cytokiną o właściwościach immunomodulujących i przeciwnowotworowych, odgrywa
również istotną rolę we wstrząsie toksycznym.
Może być on wytwarzany przez neutrofile, makrofagi, limfocyty T i B, komórki Kupffera, komórki
mikrogleju i astrocyty. Tym samym uczestniczy
w zasadniczym ciągu zdarzeń odpowiedzialnych
za kolejne etapy zapalenia, w którym cząsteczka ta
o plejotropowym działaniu i właściwościach autoregulacyjnych odgrywa główną rolę indukującą.
Syntezę i wydzielanie TNF-alfa stymulują głównie
toksyny bakteryjne w wyniku aktywacji receptorów
CD14 i CD11/18. Inhibitorem biosyntezy są natomiast glikokortykosteroidy, które mogą zapobiegać
uwalnianiu TNF-alfa w następstwie zakażenia.
Celem pracy była ocena ekspresji cytokin należących do subpopulacji Th1, tj. IFN-gamma i TNF-alfa
oraz ich udziału w etiopatogenezie polipów nosa.
MATERIAŁ I METODY
Badaniami objęto 12 chorych z polipami nosa
(6 kobiet i 6 mężczyzn) w wieku od 31 do 78 lat
(średnia wieku: 53,08), których zakwalifikowano do
leczenia operacyjnego usunięcia polipów nosa. Do
badania wyodrębniono chorych z polipowatością
nosa uczulonych na antygeny roztocza, ponieważ
55
W. Pietruszewska i inni
Tabela I. Charakterystyka badanej grupy chorych z polipami nosa (n = 12)
Lp.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
IgE całk.
IU/ml
14,84
64,44
15,81
14,49
8,38
68,45
242,86
287,28
548,87
119,57
702,35
208,84
IgE całk.
(±)
+
+
+
+
+
+
Roztocza:
testy skórne
+
+
+
+
+
+
polipy w przeważającej części występują u chorych
z całorocznym alergicznym nieżytem nosa. Chorych
podzielono na podstawie przeprowadzonych testów
skórnych i pomiaru wartości całkowitej IgE w surowicy metodą immunoenzymatyczną ELISA (zestawem Allergopharma) na 2 grupy. Pierwszą grupę
stanowili chorzy z alergią, tj. z dodatnimi testami
skórnymi na roztocza i wartością całkowitej IgE
w surowicy przekraczającą 100 IU/ml. Drugą grupę
tworzyli chorzy bez potwierdzonej alergii, wykazujący ujemne testy skórne i IgE poniżej 20 IU/ml.
Cztery osoby wśród badanych stosowały przez
minimum kilka miesięcy przed operacją kortykosteroidoterapię donosowo (tab. I.).
Zdolność sekrecyjną limfocytów i syntezę cytokin oceniano metodą intracellular staining przez
oznaczenie wewnątrzkomórkowej sekrecji IFNgamma i TNF-alfa. Komórki jednojądrzaste izolowano z krwi obwodowej przy zastosowaniu
gradientu gęstości (Histo-Paque 1077) i przechowywano w warunkach głębokiego zamrożenia w ciekłym azocie (temperatura -200 st. C) w mieszaninie
RPMI-1640 z dodatkiem 10% FCS i 2% DMSO.
Przed przystąpieniem do badań komórki odmrażano, określano leukocytozę oraz przeżywalność
limfocytów (50–70%) przy użyciu błękitu trypanu.
Zawiesinę komórek – limfocytów (1,5–3,5 x 10^6/
ml) badano w następujących układach: próbka
niestymulowana; próbka aktywowana nieswoiście
PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) i jonomycyną; próbka aktywowana swoiście antygenem
roztocza. Do poszczególnych układów dodano
odpowiednich przeciwciał: INF-gamma FITC lub
TNF-alfa-FITC/CD69 PE/CD4 PerCp-Cy5,5 (mieszanina). Analizę wyników przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej. Ocenę statystyczną
56
Astma
(±)
+
+
+
+
-
Uczulenie
na NLPZ (±)
+
+
-
Polipektomia
1
1
0
0
1
3
0
1
3
3
0
0
Steroidoterapia
donosowa (±)
+
+
+
+
-
przeprowadzono testem t-Studenta oraz MannaWhitney’a przy poziomie istotności p < 0,05. Na
przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji
Bioetyki Uniwersytetu Medycznego w Łodzi (nr
RNN/202/03/KE z dnia 23.09.2003r.).
WYNIKI
W grupie chorych z polipami nosa bez alergii
i z alergią na roztocza średnie stężenie IgE wynosiło odpowiednio: 31,068 i 371,556. Stwierdzono
wysoce istotną zależność między wyższym stężeniem IgE u chorych z alergią w porównaniu z chorymi bez alergii (p < 0,001). W analizowanych
grupach nie stwierdzono różnic między ekspresją
cytokin IFN-gamma i TNF-alfa po stymulacji limfocytów: swoistej (antygenem roztoczy) i nieswoistej
(PMA), a rozkład był podobny (p > 0,05). Średnie
wartości syntezy IFN gamma i TNF alfa zarówno
bez stymulacji, jak i po stymulacji limfocytów nieswoistej PMA i swoistej antygenem roztoczy u chorych z polipami nosa były jednak niższe w grupie
z potwierdzoną alergią na roztocza w porównaniu
z grupą bez alergii. Nie były to jednak zależności
istotne statystycznie (p > 0,05) (tab. II).
Nie obserwowano istotnych zależności między
ekspresją IFN-gamma i TNF-alfa a występowaniem
astmy oskrzelowej, uczuleniem na niesteroidowe
leki przeciwzapalne czy stosowaniem glikokortykosteroidoterapii miejscowej. U chorych z nawrotowymi polipami nosa i koniecznością powtarzania ich
usuwania poziom IFN-gamma był istotnie niższy (p
= 0,05). Podobne obserwacje poczyniono w przypadku TNF-alfa, jednak zależności te nie były już
znamienne (p > 0,05).
Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1
IFN-gamma i TNF-alfa w etiopatogenezie polipów nosa
Tabela II. Średnie wartości syntezy IFN-gamma i TNF-alfa po stymulacji limfocytów nieswoistej PMA (1) i swoistej antygenem roztoczy (2) u chorych z polipami nosa (n = 12)
1
IFN-gamma
PMA (IL)2
PMA(%)1
34,63
2,02
25,52
1,36
P = 0,585
P = 0,818
TNF-alfa
PMA(%)1
21,99
14,71
P = 0,699
PMA (IL)2
2,29
1,71
P = 0,937
Kwalifikacja
Bez alergii
Alergia
Porównanie między grupami bez i z alergią przy p < 0,05
2
IFN-gamma
Roztocza (IL)2
Roztocza (%)1
2,36
1,64
1,67
1,32
P = 0,818
P = 0,425
TNF-alfa
Roztocza(%)1
Roztocza (IL)2
2,12
1,2
1,94
0,87
P = 0,763
P = 0,310
Kwalifikacja
Bez alergii
Alergia
Porównanie między grupami bez i z alergią przy p <0,05
1 – % komórek, które uległy aktywowaniu
2 – % komórek aktywowanych, syntetyzujących badaną cytokinę
DYSKUSJA
Mechanizm powstawania polipów nosa wydaje się być bardzo zróżnicowany immunologicznie, co potwierdzono w badaniach obserwując
jednocześnie zwiększoną ekspresję Interleukiny-5
i IFN-gamma, tj. cytokin syntetyzowanych zarówno przez subpopulację limfocytów Th1, jak i Th2
[16]. Podobne obserwacje poczyniono we wcześniejszych badaniach własnych, w których zmiany
ekspresji dotyczyły zarówno cytokin należących
do subpopulacji Th1 (Il-2, IFN-gamma, TNF-alfa),
jak i Th2 (Il-4, Il-13). W badaniach własnych nie
stwierdzono istotnych różnic między ekspresją
IFN-gamma wśród chorych bez i z alergią, mimo że
IFN-gamma jest cytokiną, która wpływa na odpowiedź alergiczną. Podobne obserwacje poczyniono
w przypadku TNF-alfa. Nie wykazując związku
poziomu ekspresji IFN-gamma i TNF-alfa z występowaniem alergii, mechanizm alergiczny w rozwoju polipów nosa wydaje się być wątpliwy. Zbliżone
wyniki uzyskali Lezcano-Meza i wsp., którzy obserwowali podobną ekspresję IFN-gamma w dwóch
badanych grupach chorych, tj. bez i z alergią.
Potwierdzili oni także istotny udział tej cytokiny
w patogenezie polipów nosa przez syntezę eotaxyny – 2/CCL24, będącej chemoatraktantem dla
eozynofilów [9]. Wzmożoną ekspresję IFN-gamma,
zarówno u alergików, jak i chorych bez alergii,
stwierdzili Lee i wsp. Badanie wskazuje na udział
IFN-gamma w patogenezie polipów nosa, jednak
jednoznacznie nie podkreśla tła alergicznego [8].
Podobne wyniki uzyskali Bernstein i wsp., którzy
u chorych z polipami nosa stwierdzili ekspresję
cytokin należących do subpopulacji Th1 i Th2, bez
Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1
istotnych różnic u chorych bez i z alergią [2]. Z drugiej strony istnieją badania wskazujące na podłoże
alergiczne polipów nosa i udział IFN-gamma w tym
mechanizmie. Przebadano 17 chorych z alergicznym nieżytem nosa, stwierdzając istotnie zmniejszoną ekspresję IFN-gamma u chorych z alergią
w porównaniu z chorymi z ujemnymi testami skórnymi i prawidłowym poziomem IgE w surowicy
krwi [2]. Podobne wyniki uzyskali Hamilos i wsp.,
którzy także stwierdzili różnicę w ekspresji IFNgamma, porównując grupę chorych bez i z alergią
[5]. W polipach nosa stwierdzono wyższą ekspresję
IFN-gamma w porównaniu z Il-4 i Il-5, co wskazuje
na istotną rolę tej cytokiny w rozwoju tworów polipowatych w jamach nosa i zatok [10]. W badaniach
własnych nie obserwowano takiej zależności.
Działanie IFN-gamma okazuje się jednak znacznie bardziej złożone, o czym może świadczyć
jego udział w zaostrzeniu astmy lub jej inicjacji
po zakażeniu wirusowym [6]. IFN-gamma przez
aktywację eozynofilów i makrofagów w odpowiedzi immunologicznej wydaje się regulować proces
zapalny. W badaniach Dellacono i wsp. wzrost
ekspresji IFN-gamma w polipach nosa korelował
z nasileniem objawów klinicznych u tych chorych
oraz częstszą liczbą polipektomii w wywiadzie
[4]. W badaniach własnych oraz Scavuzzo i wsp.
[13] otrzymano wyniki przeciwstawne. Wskazuje
to jedynie na udział IFN-gamma w przewlekłej
fazie zapalenia, ale nie pomaga w jednoznacznym
wyjaśnieniu, jaką rolę odgrywa tu IFN-gamma.
TNF-alfa działa na komórki efektorowe przez
swoiste, dokładnie scharakteryzowane receptory,
które określa się ze względu na ich ciężar czą-
57
W. Pietruszewska i inni
steczkowy jako p55 i p75 TNF. Mechanizm bezpośredniego działania cytotoksycznego TNF-alfa
na wrażliwe komórki nie został w pełni wyjaśniony; sądzi się, że przez fosfolipazę A2 uruchamia
on przemiany kwasu arachidonowego w komórce i produkcję wewnątrzkomórkowych rodników
hydroksylowych. Równocześnie wzmaga ekspresję
na komórkach śródbłonka cząsteczek adhezyjnych,
które są odpowiedzialne za interakcje krwinek
białych z odpowiednimi komórkami śródbłonka,
umożliwiając ich przyleganie, a następnie diapedezę [7, 12]. TNF-alfa, podobnie jak IFN-gamma,
aktywuje komórki eozynofilowe. Wykazano obecność receptorów dla TNF-alfa na eozynofilach i atywację przez TNF-alfa procesu, którego efektem jest
synteza GM-CSF, działającego na eozynofile w sposób autokrynny i wydłużającego czas ich przeżycia
[15]. W przeprowadzonym badaniu stwierdzono
ekspresję TNF-alfa nie wykazując istotnej różnicy między grupą chorych bez i z alergią. Udział
TNF-alfa w patogenezie polipów nosa stwierdzili
Silvestri i wsp., dodatkowo opisując wpływ TNFalfa na zwiększoną ekspresję ICAM-1 (intercellular
adhesion molecule-1) na fibroblastach [14].
Wykazano udział IFN-gamma i TNF-alfa w patomechanizmie powstawania polipów nosa. Jednak
wyniki badań własnych i innych autorów nie
pozwalają na jednoznaczne stwierdzenie, który
z czynników w patogenezie powstawania polipów
nosa ma większe znaczenie. Wydaje się, że wieloczynnikowa przyczyna jest najbardziej prawdopodobna, a związane z nią złożone mechanizmy
immunologiczne, warunki mikrośrodowiskowe do
rozwoju polipów nosa oraz indywidualna predyspozycja chorego utrudnia wysunięcie jednoznacznych wniosków.
PIŚMIENNICTWO
01. Bateman N, Fahy C, Woolford T. Nasal polyps: still more
questions than answers. The J Laryngol Otol 2003; 117(1):
1–10.
02. Bernstein JM, Ballow M, Rich G, i wsp. Lymphocyte subpopulations and cytokines in nasal polyps: is there a local
immune system in the nasal polyp? Otolaryngol Head Neck
Surg 2004; 130(5): 526–535.
03. Bufe A, Gehlhar K, Grage-Griebenow E., i wsp. Atopic
phenotype in children is associated with decreased virusinduced interferon-alpha release. Int Arch Allergy Immunol
2002; 127(1): 82–88.
58
04. Dellacono FR, Eisma R, Lafreniere D, i wsp. Interferon
gamma expression in human nasal polyps. Laryngoscope
1997; 107(5): 626–630.
05. Hamilos DL, Leung DY, Wood R, i wsp. Evidence for distinct
cytokine expression in allergic versus non-allergic chronic
sinusitis. J Allergy Clin Immunol 1995; 96(4): 537–544.
06. Krasnowska M, Mędrala W. Wpływ IFN-gamma na produkcję leukotrienu C4 przez leukocyty krwi obwodowej chorych
na przewlekły alergiczny nieżyt nosa – badania in vitro.
Pneumonol Alergol Pol 2003; 71(5/6): 230–236.
07. Kowalski ML. Odpowiedź immunologiczna; Kliniczne postacie alergii atopowej. W: Immunologia kliniczna PWN 2000;
1(32), 165–198.
08. Lee CH, Rhee CS, Min YG. Cytokine gene expression in nasal
polyps. Ann Otol Rhinol Laryngol 1998; 107(8): 665–670.
09. Lezcano-Meza D, Davila-Davila B, Vega-Miranda A, i wsp.
Interleukin-4 and to a lesser extent either Il-13 or interferongamma regulate the production of eotaxin-2/CCL24 in nasal
polyps. Allergy 2003; 58(10): 1011–1017.
10. Min YG, Lee CH, Rhee CS, i wsp. Inflammatory cytokine
ekspression on nasal polyps developed in allergic and infectious rhinitis. Acta Otolaryngol 1997; 117(2): 302–306.
11. Pawliczak R, Lewandowska-Polak A, Kowalski ML.
Pathogenesis of nasal polyps: an update. Curr Allergy
Asthma Rep 2005; 5(6): 463–471.
12. Sanchez-Segura A, Brieva JA, Rodriguez C. T lymphocytes
that infiltrate nasal polyps have a specialized phenotype and
produce a mixed Th1/Th2 pattern of cytokines. J Allergy and
Clin Immunol 1998; 102(6): 953–960.
13. Scavuzzo MC, Fattori B, Ruffoli R, Giannessi F. Inflammatory
mediators and eosinophilia in atopic and non-atopic patients
with nasal polyposis. Biomed Pharmacother 2005; 59(6):
323–329.
14. Silvestri M, Sabatini F, Scarso L, i wsp.: Fluticasone propionate downregulates nasal fibroblast functions involved
in airway inflammation and remodeling. Int Arch Allergy
Immunol 2002; 128(1): 51–58.
15. Temkin V, Levi-Schaffer F. Mechanism of Tumour Necrosis
Factor Alpha mediated eosinophil survival. Cytokine 2001;
15(1): 20–26.
16. Wosińska-Becler K, Plewako H, Hakansson L, i wsp. Cytokine
production in peripheral blood cells during and outside the
pollen season in birch-allergic patients and non-allergic controls. Clin Exp Allergy 2004; 34(1): 123–130.
Adres autora:
ul. Kopcińskiego 22
90-153 Łódź
Pracę nadesłano: 10.05.2007 r.
Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1