pobierz plik - Wydział Biologii UW
Transkrypt
pobierz plik - Wydział Biologii UW
Analiza dojrzewania końca 3' cząsteczek tRNA u Saccharomyces cerevisiae mgr inż. Ewa Skowronek Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Promotor: prof. dr hab. Joanna Kufel Recenzenci: prof. dr hab. Teresa Żołądek Zakład Genetyki, Instytut Biochemii i Biofizyki, Polska Akademia Nauk prof. dr hab. Dariusz Bartosik Instytut Mikrobiologii, Zakład Genetyki Bakterii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski Transferowe RNA (tRNA), obecne we wszystkich formach życia, stanowią kluczowy czynnik wiążący odczytywanie kodu genetycznego i biosyntezę białek przez dostarczanie aminokwasów podczas syntezy łańcucha polipeptydowego. Pomimo masowego występowania w komórce oraz roli w podstawowym procesie biologicznym, mechanizm kształtowania dojrzałych funkcjonalnych tRNA z pierwotnych transkryptów nie został do końca ustalony. W komórkach eukariotycznych biogeneza tRNA zachodzi zarówno w jądrze, jak i w mitochondriach. tRNA kodowane jądrowo są transkrybowane jako pojedyncze cząsteczki, a te powstające w mitochondriach stanowią część policistronowych transkryptów. Mimo różnic w syntezie, oba typy tRNA powstają w formie prekursorów (pre-tRNA), które przechodzą złożoną obróbkę, aby jako dojrzałe cząsteczki pełnić funkcje biologiczne. Dojrzewanie pre-tRNA obejmuje przede wszystkim usunięcie wydłużeń na końcach 5' i 3' przez endo- i egzonukleazy, modyfikacje zasad i reszt rybozy oraz przyłączanie tripletu CCA do końca 3', a w przypadku niektórych jądrowych tRNA również wycięcie intronu z pętli ramienia antykodonowego. Enzymem odpowiedzialnym za syntezę kodowanych jądrowo cząsteczek pre-tRNA jest polimeraza III RNA (Pol III RNA), dla której sygnałem terminacji transkrypcji jest ciąg przynajmniej czterech tymidyn. W efekcie, wszystkie cząsteczki pre-tRNA posiadają na końcu 3' ogon oligo(U). Długość tego ogona jest zróżnicowana, podobnie jak długość pełnych odcinków prekursorowych na obu końcach cząsteczek, charakteryzujących się swoistą sekwencją, warunkowaną ekspresją poszczególnych genów. W niektórych przypadkach sekwencja nukleotydowa, w tych rejonach, umożliwia tworzenie struktur drugorzędowych. Wszystkie powyższe cechy sprawiają, że pula drożdżowych, kodowanych jądrowo prekursorów tRNA stanowi niezwykle heterogenną grupę cząsteczek, a obróbka końca 3’ jest najmniej poznanym procesem w obrębie całego mechanizmu dojrzewania pre-tRNA. Dotychczas wiadomo było, że w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae istnieją dwie ścieżki prowadzące do wykształcenia dojrzałego końca 3' tRNA – endonukleolityczna, proponowana jako główny mechanizm oraz egzonukleolityczna, określana również mianem alternatywnej. Dotrawianie końca 3' pre-tRNA przez egzonukleazy następuje w przypadku niezwiązania ogona 3' pre-tRNA przez białko Lhp1, które jako pierwsze wiąże ogon oligo(U) nowopowstałych pre-tRNA. Spośród enzymów aktywnych w tym procesie zidentyfikowano do tej pory dwie egzonukleazy - Rex1 i Rrp6. Rola drożdżowej RNazy Z (Trz1) wnioskowana była natomiast jedynie na podstawie doświadczeń in vitro oraz funkcji białek homologicznych. Wyniki zaprezentowane w rozprawie doktorskiej dowodzą in vivo zaangażowania endonukleazy Trz1 w obróbkę wydłużeń 3' pre-tRNA. Dodatkowo, potwierdzona została również w szerszym aspekcie rola egzonukleaz Rex1, Rrp6 i Rex2 w ścieżce alternatywnej, co pozwoliło na stwierdzenie, że istnieje pewna hierarchia ważności pomiędzy wyżej wymienionymi białkami, a ich funkcje w tym procesie nie w pełni pokrywają się. Wydaje się, że wbrew wcześniejszym przewidywaniom, większość pre-tRNA ulega dojrzewaniu w obu ścieżkach w podobnym stopniu. Jedynie cząsteczki charakteryzujące się niestandardowo długimi sekwencjami prekursorowymi po stronie 3' są ściśle uzależnione od aktywności Trz1. Możliwe, że trawienie egzonukleolityczne, niezależne od Trz1 i wiązania Lhp1, jest w przypadku tych prekursorów blokowane przez przewidziane in silico struktury typu spinki do włosów w obrębie tych sekwencji. Na przykładzie jednej z takich cząsteczek zaobserwowano, że zablokowanie dojrzewania końca 3' prowadzi do degradacji tRNA, zależnej od oligoadenylacji przez polimerazę poli(A) Trf4, która jest składnikiem kompleksu TRAMP. Zjawisko to stanowi element kontroli jakości tRNA, który zachodzi w jądrze komórkowym. Istnieją jednak przesłanki wskazujące, że adenylacja przez Trf4 może być również sygnałem kierującym niestabilne tRNA do degradacji na drodze RTD (ang. rapid tRNA decay). W ramach tej pracy pokazano, że kodowana jądrowo endonukleaza Trz1 jest odpowiedzialna również za dojrzewanie końca 3' mitochondrialnych tRNA (mt-tRNA). Mutacje w genie TRZ1 przyczyniają się do znacznej niestabilności genomu mitochondrialnego, charakteryzującego się utratą części regionów, szczególnie tych zawierających wyłącznie geny tRNA. Ponadto, brak Trz1 w mitochondriach skutkuje zanikiem dojrzałych form transkryptów mitochondrialnych ulegających ekspresji i akumulacją znacznie większych policistronowych prekursorów. Potwierdzono więc, że zgodnie z wcześniejszymi przewidywaniami, głównymi enzymami odpowiedzialnymi za kształtowanie dojrzałych mt-tRNA są endonukleazy – Trz1 oraz wcześniej zdefiniowana RNaza P. Stanowią one podstawę tzw. punktowego modelu dojrzewania mitochondrialnych policistronowych transkryptów, gdzie wycięcie cząsteczek tRNA przez te dwa enzymy jest jednocześnie pierwszym krokiem dojrzewania innych klas RNA kodowanych w tych samych jednostkach transkrypcyjnych. Przeprowadzone badania ukazały ponadto poboczną rolę innych nukleaz, Nuc1, Rex2 i Pet127, w obróbce mitochondrialnego transkryptu pre-tRNAfMet-RPM1-tRNAPro. Brak tych enzymów powoduje nasilenie akumulacji form prekursorowych lub występowanie dodatkowych produktów przejściowych procesu dojrzewania tego transkryptu. Wyniki te potwierdziły udział nukleazy Pet127 w obróbce końca 5' niektórych mitochondrialnych cząsteczek RNA, w tym prekursora RPM1, oraz wskazały na możliwy wkład enzymów o aktywności egzonukleolitycznej 3'-5' w biogenezę dojrzałych mt-tRNA.