Ćw. 10 Absorpcjometria II

Ćw. 10 Absorpcjometria II
Absorpcja promieniowania elektromagnetycznego z obszaru widzialnego i nadfioletowego przez
atomy i cząsteczki powoduje zmianę ich stanu elektronowego. Zjawiska te moŜna badać za
pośrednictwem elektronowych widm absorpcyjnych. Metoda optyczna wykorzystująca absorpcję
promieniowania elektromagnetycznego w nadfiolecie (z ang. Ultra-Violet = UV)
i w zakresie widzialnym (ang. visible = Vis.) przez substancje nosi nazwę spektrofotometrii
UV—Vis. Jest to metoda szeroko wykorzystywana w analizie jakościowej I ilościowej związków
organicznych i nieorganicznych. Dla widm optycznych sformułowano ogólne prawa absorpcji
promieniowania wiąŜące wielkość absorpcji z ilością badanej substancji.
Prawa absorpcji
I prawo absorpcji (prawo Bouguera—Lamberta).
Wiązka światła monochromatycznego przy przechodzeniu przez jednorodny ośrodek absorbujący
o grubości l ulega osłabieniu wg równania:
I = I0 ⋅ e-k⋅l
gdzie:
I0 - natęŜenie wiązki promieniowania monochromatycznego padającego na jednorodny ośrodek
absorbujący,
I - natęŜenie promieniowania po przejściu przez ośrodek absorbujący,
k - współczynnik absorpcji, charakterystyczny dla danej substancji przy określonej długości fali
promieniowania.
ZaleŜność tę wygodniej jest przedstawić w formie logarytmicznej:
A = ln(I0/I) =k ⋅ l
lub:
A = 1og(I0/I) = a ⋅ l
gdzie: a = 0,4343 ⋅ k
A — zdolność pochłaniania promieniowania przez ośrodek materialny, zwana absorbancją. Obok
terminu „absorbancja” uŜywane są takŜe inne terminy, takie jak: “wartość absorpcji”,
“ekstynkcja” (E) lub “gęstość optyczna”.
I prawo absorpcji moŜna takŜe sformułować w następujący sposób: absorbancja jest
proporcjonalna do grubości warstwy absorbującej, o ile wiązka promieniowania
monochromatycznego przechodzi przez jednorodny ośrodek absorbujący.
Często przy określeniu ilości zaabsorbowanego promieniowania spotykamy się z wielkością
określoną mianem transmitancji (T), zdefiniowanej następująco:
T = I / I0
A zatem:
A = log(1/T)
Wartość transmitancji podawana jest najczęściej w procentach. Wtedy:
%T = I / I0 ⋅ 100%
II prawo absorpcji (prawo Beera).
Prawo to dotyczy absorpcji promieniowania elektromagnetycznego przez roztwory i moŜna je
sformułować w następujący sposób: w przypadku, gdy współczynnik absorpcji rozpuszczalnika
1
jest równy zeru, to wiązka promieniowania monochromatycznego przy przechodzeniu przez
jednorodny roztwór substancji absorbującej o stęŜeniu c ulega osłabieniu według równania:
I = I0 ⋅ e-k⋅l⋅c
W formie logarytmicznej zaleŜność ta ma postać:
A = ln(I0/I) = k ⋅ l ⋅ c
lub:
A = 1og(I0/I) = a ⋅ l ⋅ c
Prawo to moŜna takŜe sformułować w ten sposób: w przypadku, gdy współczynnik absorpcji
rozpuszczalnika jest równy zeru, to absorbancja wiązki promieniowania monochromatycznego
przechodzącej przez jednorodny roztwór jest wprost proporcjonalna do stęŜenia roztworu c i do
grubości warstwy absorbującej l.
III prawo absorpcji (prawo addytywności absorpcji).
Absorbancja roztworu wieloskładnikowego równa się sumie absorbancji poszczególnych
składników:
A = A1 + A2 + A3 + … + An
gdzie:
A1, A2, A3, An - absorbancje składników roztworu
Prawo addytywności umoŜliwia analizę ilościową układów wieloskładnikowych.
W równaniu na absorbancję: A = a ⋅ l ⋅ c wielkością jest właściwym współczynnikiem absorpcji
w przypadku, gdy stęŜenie wyraŜamy w g/cm3 . Natomiast, gdy stęŜenie wyraŜone jest
w molach/dm3 równanie to przybiera postać: A = ∈ ⋅ l ⋅ c . Współczynnik ∈ nazywamy molowym
współczynnikiem absorpcji. Wartość A za1eŜy od stęŜenia roztworu, a funkcja
A = f(c) jest linią prostą, a ile roztwór spełnia prawo Beera (rys. 1). Często występują odchylenia
od praw absorpcji i wówczas funkcja ta przyjmuje postać przedstawioną na rys. 2.
Wielkość stęŜenia substancji, przy którym zaczynają pojawiać się odchylenia od praw absorpcji
zaleŜy od natury oznaczanej substancji, stopnia monochromatyczności pochłanianego
promieniowania, czułości aparatu i obecności substancji towarzyszących. Najczęściej
2
spotykanym odchyleniem jest tzw. odchylenie ujemne, którego przyczyną jest fakt, Ŝe ze
wzrostem stęŜenia cząsteczki mogą ulegać polimeryzacji, asocjacji lub solwatacji.
Instrukcja obsługi spektrofotometru CECIL CE 1010
1. Włączyć aparat do sieci i nacisnąć przycisk ON/OFF umieszczony z tyłu po lewej stronie
przyrządu. Następuje wtedy samosprawdzanie i kalibracja, co sygnalizuje migający napis
CAL.
2. Pozostawić przyrząd na kilka minut do stabilizacji termicznej.
3. Po zakończeniu samotestowania przyrządu automatycznie wybierany jest pomiar
absorbancji (A). Zmiany na transmitancję (T) moŜna dokonać klawiszem READOUT.
4. Umieścić kuwetę z roztworem odniesienia w uchwycie, zamknąć pokrywę.
5. Ustawić Ŝądaną długość fali uŜywając klawiszy „↑”, „↓”.
6. Nacisnąć klawisz „ZERO” by ustawić zerową absorbancję.
7. Przesunąć kuwetę z roztworem badanym w strumień światła i zamknąć wieko.
8. Odczytać mierzoną wartość z wyświetlacza.
Oznaczenie Ŝelaza (III) metodą rodankową
Odczynniki:
r-r podstawowy Ŝelaza o stęŜeniu 1 mg/ml
0,1 % r-r HCl
0,1 M r-r HCl
20 % KSCN
Jony rodankowe (tiocyjanianowe) w kwasowym środowisku reagują z Ŝelazem (III) tworząc
czerwono zabarwiony kompleksy Ŝelazowo-rodankowe (λmax = 480 nm). W wyniku stopniowej
reakcji kompleksowania w roztworze mogą powstać kompleksy Fe(SCN)2+ , Fe(SCN)2+ …
Fe(SCN)63-. StęŜenia reagentów i pH środowiska decydują, które z kompleksów przewaŜają w
roztworze. W roztworach o mikrogramowych stęŜeniach Ŝelaza przewaŜa pierwszy kompleks w
szeregu. Kwasowość roztworu powinna być co najmniej taka, aby nie dopuścić do hydrolizy
jonów Fe3+, która zaczyna się juŜ około pH 3.
Z roztworu podstawowego Ŝelaza (III) o stęŜeniu 1 mg/ml przygotować roztwór roboczy o
stęŜeniu 10 µg Fe3+/ml. Roztwór roboczy naleŜy przygotować w kolbie 100 ml uprzednio
przepłukanej 0,1% HCl. Z roztworu roboczego naleŜy sporządzić serię roztworów wzorcowych
w kolbkach 50 ml (uprzednio przepłukanych 0,1M HCl) poprzez odpipetowanie: 0 (próba ślepa),
2, 4, 6, 8, 10 ml, następnie dodać 5 ml 20% r-ru KSCN i uzupełnić 0,1 M HCl do kreski.
Roztwory wymieszać, przelać do kuwety i zmierzyć absorbancję przy długości fali 480 nm.
Roztworem odniesienia powinna być próba ślepa. Na podstawie przeprowadzonych pomiarów
naleŜy sporządzić krzywa kalibracyjną.
Otrzymany w 100 ml kolbie roztwór (analiza) rozcieńczyć woda destylowaną do kreski. Pobrać
skalibrowaną pipetą trzy porcje po 25 ml do kolbek miarowych 50 ml. Do kaŜdej kolbki dodać 5
ml r-ru KSCN i rozcieńczyć do kreski 0,1 M HCl. Roztwory wymieszać i zmierzyć absorbancję.
Na podstawie pomiarów wyliczyć stęŜenie Ŝelaza w otrzymanej próbce (analiza, 100 ml).
3
Uwaga: kompleks Ŝelazo-tiocyjanian jest nietrwały, dlatego naleŜy dodawać rodanek do próbek
bezpośrednio przez pomiarem absorbancji. Pomiary wzorców i próbek naleŜy wykonywać
bezpośrednio po sobie.
Oznaczanie kreatyniny w moczu.
Podstawą oznaczenia jest reakcja Jaffe’go, w której kreatynina i kwas pikrynowy tworzą w
środowisku zasadowym barwny kompleks. Reakcja nie jest specyficzna i na jej dodatni odczyn
mogą mieć wpływ takŜe inne związki, szczególnie o właściwościach redukujących.
Odczynniki:
20 % roztwór kwasu trichlorooctowego (TCA)
0,8% roztwór kwasu pikrynowego
6,5% roztwór NaOH
Roztwór wzorcowy kreatyniny 1mg/ml (przechowywać w ciemności
Opis czynności.
1. Rozcieńczyć mocz 50-krotnie wodą
2. Z roztworu wzorcowego kreatyniny przygotować r-r roboczy o stęŜeniu 5mg/100 ml (5
ml roztworu wzorcowego i 10 ml 0,1 M HCl rozcieńczyć wodą do 100 ml)
3. Przygotować odczynnik roboczy. Bezpośrednio przed oznaczanie zmieszać r-r kwasu
pikrynowego i zasadę w stosunku 1:1
Przygotować krzywą wzorcową: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml r-ru roboczego kreatyniny uzupełnić
wodą do objętości 0,5 ml. Ponadto dodać 0,5 ml 205 r-ru TCA i 1 ml odczynnika roboczego.
Przygotować próbę odczynnikową: 0,5 ml wody, dodać 0,5 ml 20% r-ru TCA i 1 ml odczynnika
roboczego.
Przygotować próbę badaną: 0,5 ml rozcieńczonego moczu, dodać 0,5 ml 20% r-ru TCA i 1 ml
odczynnika roboczego.
Wszystkie roztwory wymieszać, pozostawić w temp. 25 st. Celsjusza na 20 minut. Następnie
zmierzyć absorbancję prób wzorcowych i próby badanej względem próby odczynnikowej przy
dł. Fali 520 nm.
NaleŜy wykreślić krzywą kalibracyjną i wyznaczyć stęŜenie kreatyniny w moczu (uwzględniając
jego rozcieńczenie). Jednostka stęŜenia kreatyniny powinno być mg/100 ml (mg/dl). Oznaczoną
zawartość kreatyniny porównać do wartości literaturowych.
4