IDEIA Borrelia burgdorferi IgG [PL]
Transkrypt
IDEIA Borrelia burgdorferi IgG [PL]
5. ODCZYNNIK DOSTARCZONY 96 - Każdy zestaw diagnostyczny zawiera dość odczynników na 96 oznaczeń. 5.1. ZAWARTOŚĆ ZESTAWU IDEIA BORRELIA BURGDORFERI, IgG TEST Key Code TSMX7841 www.oxoid.com/ifu Europe +800 135 79 135 CA 1 855 805 8539 Jedna broszura instrukcji stosowania US 1 855 2360 190 ROW +31 20 794 7071 K602911-2..........................96 Tests PL 100mL rozcieńczalnika próbek buforowany roztwór z detergentem, środkiem przeciwbakteryjnym, zabarwiony na czerwono 1. P RZEZNACZENIE Test IDEIA™ Borrelia burgdorferi IgG to test immunoenzymatyczny do wykrywania ludzkich przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato. Zestaw jest przewidziany jako pomocniczy w diagnostyce boreliozy z Lyme. 50mL koncentratu buforu płuczącego (x25): roztwór buforowany trisem, zawierający środek przeciwbakteryjny i detergent 2. STRESZCZENIE Borelioza z Lyme to wieloorganowe zakażenie wywołane, przenoszonym przez kleszcze, krętkiem B. burgdorferi sensu lato1,2. Borelioza jest najczęstszym zakażeniem przenoszonym wektorowo w Europie i Ameryce Północnej. Chorobę rozpoznawano w Rosji, Chinach i Japonii. 1,5mL IgG kontrola dodatnia ludzka surowica w buforze ze środkiem przeciwbakteyjnym, barwiona na ciemnozielono. W związku ze szczególnie nikłą liczbą komórek B. burgdorferi w zmianach patologicznych i płynach ustrojowych, próby hodowli ani ostatnio stosowane techniki PCR, wykrywające bezpośrednio krętkowy DNA nie okazały się przydatne w rutynowej diagnostyce boreliozy z Lyme. A zatem najbardziej przydatną metodą jest nadal pomiar swoistych dla B. Burgdorferi przeciwciał. IDEIA Borrelia burgdorferi IgG używa jako antygenu testowego oczyszczonego, natywnej wici szczepu B. afzelii DK1. Ta wić (flagellum) jest silnie immunogenna i wyzwala wczesną, silną i trwałą odpowiedź immunologiczną4,5. W porównaniu z konwencjonalnym i obecnie szeroko stosowanym antygenem testowym, jakim jest ekstrakt z całych komórek krętka, oczyszczony antygen flagellum poprawia czułość i swoistość diagnostyczną testów serologicznych do wykrywania boreliozy z Lyme6,7. Ponadto użycie flagellum jako antygenu testowego jest właściwe we wszystkich regionach geograficznych, ponieważ poszczególne szczepy B. burgdorferi nie wykazują różnic dotyczących flagellum. 3. Z ASADA TESTU Test IDEIA Borrelia burgdorferi IgG wykonuje się w studzienkach mikropłytki opłaszczonych oczyszczonym, natywnym flagellum Borrelia. Przeciwciała obecne w próbkach surowicy ludzkiej wiążą się z antygenem obecnym na ścianach studzienek mikropłytki w czasie pierwszej inkubacji. Po usunięciu niezwiązanych białek surowicy przez wypłukanie, do studzienek dodaje się znakowanego peroksydazą przeciwciała przeciwko ludzkiej IgG. Koniugat wiąże się swoiście z przeciwciałami klasy IgG, związanymi uprzednio z antygenem flagellum. Nadmiar koniugatu jest usuwany przez wypłukanie, a po dodaniu chromogenu peroksydaza zawarta w koniugacie katalizuje powstanie niebieskiego zabarwienia. Reakcję zatrzymuje się dodatkiem kwasu, który zmienia niebieskie zabarwienie na żółte. Intensywność zabarwienia odpowiada stężeniu w próbce swoistych przeciwciał przeciwko B. Burgdorferi. Intensywność tę mierzy się spektrofotometrycznie przy długości fali 450nm, a wartość absorbcji prób badanych jest porównywana z absorbancją kontroli. Standardowe składniki zestawów (Sample Diluent, Wash Buffer Concentrate, Substrate and Stop Solution), i podobna procedura wykonania dotyczą też testów IDEIA Borrelia burgdorferi, IgM ( K603011-2) i IDEIA Lyme Neuroborreliosis ( K602811-2). Można zatem wykonywać te testy równolegle, korzystając z tego samego rozcieńczenia surowicy badanej. 10.1.2 Ocena wiarygodności testu opiera się na podwójnym badaniu każdej próbki. Jeżeli zamierza się badać próbki pojedyńczo, zalecane jest, aby wykonujący badanie zapoznał się z opisem wiarygodności testu. Różnice pomiędzy oznaczeniami (CV%) są o około 50% wyższe, jeśli są oparte na pojedynczym oznaczeniu. 10.1.3 Jeżeli wytrząsarka na 500rpm nie jest dostępna, można zredukować szybkość wytrząsania do 300rpm podczas obu inkubacji, bez wyraźnego ujemnego wpływu na wyniki testu, a dostępny jest także protokół statyczny (bez wytrząsania). Proszę skontaktować się z 8. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI - Do diagnostyki in vitro. Osoba wykonująca test musi być przeszkolona i doświadczona w pracy laboratoryjnej 8.1. ŚRODKI BEZPIECZEŃSTWA 8.1.1 Zestaw IDEIA Borrelia burgdorferi IgG jest tak zaprojektowany, aby można go było używać w maksymalnie dziesięciu etapach, podczas trzech miesięcy w okresie ważności. Istotne dla uzyskania optymalnych wyników jest, aby przechowywać niezużyte części zestawu zgodnie z poniższym zaleceniem: Nieużywane paski należy usunąć z ramki i zaraz umieścić z powrotem w zamykanej torebce ze środkiem suszącym, starannie zamknąć i przechowywać w temperaturze 2-8°C. Można je zużyć w ciągu 12 tygodni po pierwszym otwarciu, jeśli są przechowywane w podany sposób. Rozcieńczalnik próbek - Gotowy do użycia. Niezużyty przechowywać w temperaturze 2-8°C. Roztwór hamujący reakcję zawiera kwas siarkowy (0,46mol/L). Unikać kontaktu z oczyma i skórą przez noszenie ochronnej odzieży i okularów. 8.1.3 Nie jeść, nie pić, nie palić, nie przechowywać ani nie przygotowywać żywności, ani nie stosować kosmetyków w miejscu przeznaczonym do pracy z odczynnikami i próbkami. 8.1.4 Nie pipetować ustami. 8.1.5 Nosić jednorazowe rękawiczki podczas pracy z materiałem klinicznym i zawsze myć ręce po pracy z materiałem zakaźnym. 8.1.6 Usuwać wszelkie pozostałości próbek klinicznych zgodnie z miejscowymi przepisami. 8.1.7 Arkusz dotyczący bezpieczeństwa dostępny na żądanie dla osób zawodowo przygotowanych. 8.1.8 Substrat TMB zawiera 1-metylopirolidon (NMP) w stężeniu >5% i <10%, klasyfikowany zgodnie z odnośnymi dyrektywami EWG jako Repro. Kat. 2. Poniżej podano odpowiednie określenia dotyczące ryzyka (zwroty R) i bezpieczeństwa (zwroty S) R61 Może działać szkodliwie na dziecko w łonie matki. S53 Unikać narażenia - przed użyciem zapoznać się z instrukcją S45 W przypadku awarii lub jeżeli źle się poczujesz, niezwłocznie zasięgnij porady lekarza (pokaż etykietę jeśli to możliwe) 8.2. UWAGI TECHNICZNE 8.2.1 Koncentrat buforu płuczącego - Dostarczany w postaci stężonej x25. Przed użyciem rozcieńczyć, dodając jedną objętość koncentratu do 24 objętości świeżej destylowanej lub dejonizowanej wody (lub dodać całą zawartość do 1200mL świeżej destylowanej lub dejonizowanej wody). Bufor płuczący o stężeniu roboczym należy przygotować w dniu, w którym zostanie wykorzystany. Niezużyty koncentrat przechowywać w temperaturze 2-8°C. Niewykorzystanego buforu o stężeniu roboczym przechowywać do następnego użycia (zob. część 8.2.11). Wszystkie surowice dawców, użyte jako kontrole IgG, zostały przebadane indywidualnie i ustalono, że są ujemne, jeśli chodzi o antigen powierzchniowy wirusa hepatitis B i przeciwciała przeciwko HIV i wirusowi hepatitis C. 8.1.2 Studzienki - Otworzyć torebkę z mikropłytką, tnąc wzdłuż zamknięcia. Odłamać potrzebną ilość pasków ze studzienkami i umieścić je z powrotem w ramce. Jeden pasek pozwala na podwójne oznaczenie próbki od jednego pacjenta, pozostałe sześć studzienek wykorzystuje się na próbę ślepą (rozcieńczalnik próbek) oraz kontrolę ujemną i dodatnią. Każdy następny pasek umożliwia oznaczenie próbek od czterech osób badanych. Jeśli wykorzystuje się naraz całą płytkę, można zbadać próbki od 45 osób badanych. 8.2.2 nie Nie należy używać składników zestawu po upływie daty ważności podanej na etykietach. Nie mieszać ani nie zamieniać odczynników z różnych zestawów i serii, z wyjątkiem standardowych składników (Sample Diluent, Wash Buffer Concentrate, Substrate and Stop Solution), które wchodzą też w skład zestawu IDEIA™ Borrelia burgdorferi, IgM ( K603011-2) i IDEIA™ Lyme Neuroborreliosis ( K602811-2). Odczynniki są dostarczane w ustalonych stężeniach roboczych. Wynik testu może nie być wiarygodny, jeśli są one mieszane, rozcieńczane lub przechowywane w warunkach innych niż wskazane w rozdz. 5.2. - 8.2.3 Gotowa do użycia. Przechowywać niezużytą IgG cut-off control w temperaturze 2-8°C. 8.2.4 żywać osobnych pipet lub jednorazowych końcówek U do każdej próby badanej, kontroli czy odczynnika, aby uniknąć zanieczyszczenia I błędnych wyników. 8.2.5 Przechowywać wodę destylowaną lub dejonizowaną do rozcieńczania koncentratów odczynników w czystych pojemnikach, aby zapobiec zanieczyszczeniu mikrobiologicznemu. 5.2.4 4. D EFINICJE Poniższe symbole zostały użyte w informacji o produkcie. 10.1.1 Dostępne są zasady stosowania tego testu w otwartych systemach automatycznych. Proszę się skontaktować z miejscowym przedstawicielem lub dystrybutorem Oxoid 5.2. PRZYGOTOWANIE, PRZECHOWYWANIE I POWTÓRNE UŻYCIE SKŁADNIKÓW ZESTAWU 5.2.3 10.1.UWAGI DOTYCZĄCE WYKONANIA Plastikowa pokrywka do mikropłytki Spektrofotometr lub czytnik ELISA do odczytu 96 studzienkowej płytki złożonej z ośmiostudzienkowych pasków, przy długości fail 450nm z odczytem odniesienia w zakresie 620-650nm (opcjonalne, rozdz. 10.3, Odczyt wyników testu) 25mL r oztworu hamującego 0,46mol/L kwas siarkowy. 5.2.2 Czysty ręcznik papierowy do osuszania mikropłytki Uwaga: jeśli mniej niż osiem studzienek jest używanych do testu i płukanych w automatycznej płuczce przewidzianej na osiem studzienek, należy dopełnić pasek pustymi studzienkami 12mL substatu stabilizowany roztwór nadtlenku i 3,3’-5,5’-tetrametylobenzydyny w rozcieńczonym roztworze buforowym. TMB została uznana za niekarcynogenną, jednak zaleca się używanie środków ochrony osobistej, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu. 5.2.1 Pojemniki na odczynniki do pipety wielokanałowej (opcjonalnie) 10. WYKONANIE TESTU PROSZĘ ZAPOZNAĆ SIĘ Z ROZDZ. 8.2, „UWAGI TECHNICZNE” PRZED WYKONANIEM TESTU. Automatyczna płuczka do mikropłytek (opcjonalnie) lub inny sprzęt potrzebny do wypłukania 8 studzienkowych pasków (rozdz.10.2.3) 13mL znakowanego przeciwciała anty-IgG królicze przeciwciało przeciwko ludzkiej IgG koniugowane peroksydazą chrzanową i barwione na jasnoniebiesko. W stadium I, w ciągu kilku dni do kilku tygodni od ugryzienia przez kleszcza rozwija się wysypka skórna, rumień wędrujący (erythema migrans = EM). Zakażeniu mogą towarzyszyć nieswoiste objawy, takie jak bóle głowy, złe samopoczucie, gorączka, bóle mięśni i stawów; w stadium II – pojawiającym się tygodnie lub miesiące później – choroba zwykle objawia się limfocytarnym zapaleniem opon i korzeni nrewowych z lub bez zajęcia nerwów czaszkowych i porażeniem kończyn (zespół Bannwartha), zapaleniem wsierdzia lub stawów; stadium III, obejmujące skórę, centralny układ nerwowy lub stawy, może przebiegać jako zanikowe zapalenie skóry częsci obwodowych kończyn (ACA), przewlekłe postępujące zapalenie mózgu i opon mózgowych lub zapalenie stawów, do których może dochodzić wiele lat po zakażeniu. Mikropipety i końcówki jednorazowe, do podawania objętości 10-1000µL Kontrola punktu odcięcia (ujemna) Numer produktu i numer katalogowy 5.2.5 Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Gotowa do użycia. Przechowywać niezużytą IgG positive control w temperaturze 2-8°C. Kontrola dodatnia - do użytku laboratoryjnego 5.2.6 Koniugat (przeciwciało przeciwko IgG) 9. ZBIERANIE I PRZYGOTOWANIE PRÓBEK Test IDEIA Borrelia burgdorferi IgG nadaje się wyłącznie do badania próbek ludzkiej surowicy. Badanie próbek mętnych lub lepkich może prowadzić do nieprawdziwych wyników z powodu błędów pipetowania. Próbki surowicy mogą być przechowywane przez 14 dni w temperaturze 2-8°C przed badaniem, lub do 6 miesięcy w temperaturze –20°C lub poniżej. Minutnik laboratoryjny 2,5mL IgG kontroli punktu odcięcia ludzka surowica w buforze ze środkiem przeciwbakteyjnym, barwiona na jasnozielono. Zakażenie B. burgdorferi charakteryzuje się dużą różnorodnością objawów i przebiega w trzech stadiach3. Probówki o pojemności około 5mL Wytrząsarka do mikropłytek o zakresie do 500rpm przy średnicy obrotu 3-4mm. W sprawie przydatności posiadanego sprzętu proszę skontaktować się z miejscowym przedstawicielem lub dystrybutorem Oxoid Jedna buteleczka każdego z następujących odczynników: Test immunoenzymatyczny do oznaczania przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato. Cylinder miarowy (2L) Wielokanałowa pipeta (osiem kanałów) do podawania 100µL (opcjonalnie) 96 studzienkowa płytka (12 pasków po 8 studzienek) pokryta natywnym flagellum Borrelia. Nadająca się do powtórnego zamknięcia torebka foliowa służy do przechowania niezużytych pasków studzienek IDEIA Borrelia burgdorferi IgG 7. WYPOSAŻENIE Wymagane jest następujące wyposażenie: 8.2.6 Unikać zanieczyszczenia jonami metali lub środkami utleniającymi. 8.2.7 Nie używać substratu enzymatycznego, który ma niebieski kolor przed dodaniem do studzienek. Temperatura przechowywania Gotowy do użycia. Przechowywać niezużyty anti-IgG conjugate w temperaturze 2-8°C. Numer serii 5.2.7 Gotowy do użycia. Przechowywać niezużyty substrat w temperaturze 2-8°C. 8.2.8 Chronić substrat przed światłem. Zużyć przed 8.2.9 Studzienki nie mogą być użyte powtórnie. Wyprodukowany przez 5.2.8 8.2.10 Ręczny lub automatyczny sprzęt płuczący musi być wolny od zanieczyszczń mikrobiologicznych, wykalibrowany i utrzymany zgodnie z zaleceniami producenta. 8.2.11 Niewykorzystanego buforu o stężeniu roboczym nie przechowywać do następnego użycia. Aktualnie niewykorzystywane zbiorniki na bufor płuczący należy przepłukać wodą dejonizowaną lub destylowaną, a następnie pozostawić do wyschnięcia. Substrat - Roztwór hamujący reakcję - Gotowy do użycia. Przechowywać niezużyty roztwór hamujący w temperaturze 2-8°C. 6. DODATKOWE ODCZYNNIKI 6.1. ODCZYNNIKI Świeża woda destylowana lub dejonizowana do przygotowania rozcieńczonego buforu płuczącego. 10.2.WYKONANIE TESTU UWAGA: Wykonanie testu wymaga użycia wytrząsarki. W sprawie informacji o przydatności posiadanej wytrząsarki proszę skontaktować się z miejscowym dystrybutorem. Jeśli używa się kilku pasków, zaleca się podawanie koniugatu, substratu i roztworu hamującego reakcję pipetą wielokanałową. 10.2.1 Dodawanie próbek i kontroli Umieścić wymaganą liczbę pasków w ramce. Dodać 100µL rozcieńczonej surowicy do odpowiednich studzienek. Dodać 100µL kontroli dodatniej, kontroli punktu odcięcia (ujemnej) i rozcieńczalnika próbek do osobnych studzienek. (Co najmniej 3 kontrole ujemne, 2 kontrole dodatnie i 1 studzienka z rozcieńczalnikiem próbek powinny zostać uwzględnione przy każdym oznaczaniu surowic osób badanych). 10.2.2 Inkubacja próbek Przykryć i inkubować studzienki w temperaturze pokojowej (2025°C) wytrząsając przez 60 minut. 10.2.3 Płukanie studzienek Studzienki powinny zostać wypłukane rozcieńczonym buforem płuczącym (patrz rozdz. 5.2.3). Właściwe płukanie jest bardzo istotne dla wiarygodnych wyników (patrz rozdz. 8.2.10) i powinno zostać wykonane tak, żeby za każdym razem maksymalnie napełnić studzienki (co najmniej 350µL buforu płuczącego) i całkowicie je opróżnić. Ważne jest wykonanie czterech cykli płukania, albo automatycznie, albo ręcznie, przy czym cykl powinien zawierać dwuminutowe namoczenie studzienek podczas drugiego płukania albo namoczenie na w sumie 2 minuty podczas całego cyklu. Ręczne płukanie Jeśli płucze się studzienki ręcznie, należy odsysać zawartość studzienek albo usuwać bufor przez strząśnięcie i napełniać ponownie całkowicie opróżnione studzienki świeżo przygotowanym roztworem buforu płuczącego, dbając o to, żeby i opróżnienie, i napełnienie było całkowite. Podczas każdego cyklu płukania resztkę buforu ze studzienek należy usuwać przez umieszczenie mikropłytki dnem do góry na arkuszu czystego ręcznika papierowego. Skuteczność ręcznego płukania zapewnia także napełnianie studzienek pod kątem, aby bufor zawirował w każdej studzience. Po ostatnim płukaniu należy odwrócić płytkę dnem do góry na arkuszu czystego ręcznika papierowego i do końca usunąć resztkę buforu. Płukanie automatyczne Płukanie automatyczne powinno zostać zaprogramowane na cztery kompletne cykle i zawierać dwuminutowe namaczanie studzienek w czasie całego cyklu. Płuczka musi zostać odpowiednio skalibrowana, aby napełnianie i opróżnianie studzienek było całkowite. Po ostatnim płukaniu należy odwrócić płytkę dnem do góry na arkuszu czystego ręcznika papierowego i do końca usunąć resztkę buforu. 10.2.4 Dodanie koniugatu anty IgG (Anti-IgG Conjugate) Dodać 100µL koniugatu anty-IgG do każdej studzienki. 10.2.5 Inkubacja z koniugatem - Sprawdzić w instrukcji stosowania Unikać zanieczyszczenia odczynników. miejscowym przedstawicielem lub dystrybutorem co do stosownego protokołu. Przykryć i inkubować studzienki w temperaturze pokojowej (2025°C) wytrząsając przez 60 minut. 10.2.6 Płukanie studzienek Studzienki należy wypłukać zgodnie z zaleceniami z rozdz.10.2.3. 10.2.7 Dodanie substratu i inkubacja Dodać 100µL substratu do każdej studzienki. Przykryć i inkubować w temperaturze pokojowej (20–25°C) bez wstrząsania przez 10 minut. 10.2.8 Zatrzymanie reakcji Dodać 100µL roztworu hamującego reakcję do każdej studzienki. Starannie wymieszać zawartość. Produkt barwny jest trwały przez 30 minut. Nie wystawiać na bezpośrednie światło słoneczne, ponieważ dochodzi do utraty zabarwienia pod wpływem światła. 10.3.ODCZYT WYNIKÓW 11.4.1 Interpretacja jakościowa 10.3.1 Odczyt fotometryczny Granica wykrywalności (OD WYKRYWALNOŚĆ IgG) w odniesieniu do przeciwciał IgG przeciw bakterii Borrelia burgdorferi jest obliczana jako ODCut-Off x 0,5. Odczytu powinno się dokonać w ciągu 30 minut od dodania roztworu hamującego reakcję. Zawartość studzienek należy zmieszać przez delikatne postukanie w narożnik ramki i odczytać absorbancję dla każdej studzienki w odpowiednim spektrofotometrze lub czytniku ELISA, przy długości fali 450nm. Przed odczytem należy się upewnić, czy dno studzienek jest czyste od spodu, a do środka nie przedostały się zanieczyszczenia. Probą odniesienia jest powietrze, to znaczy w czasie zerowania nie ma ramki w czytniku. Zamiennie, jeśli spektrofotometr lub czytnik ELISA pozwala na zastosowanie odczytu przy dwóch długościach fail (i długością odniesienia może być 620 do 650nm), można zastosować taki podwójny odczyt, ponieważ pozwala on na wyeliminowanie wyników błędnych z powodu zanieczyszczeń lub nierówności w plastiku mikropłytki Poziom, powyżej którego istnieje prawdopodobieństwo występowania przeciwciał spowodowanej aktywną infekcją, jest równy ODIgG Cut-Off. Wartości OD między tymi dwoma stężeniami świadczą o niskim poziomie przeciwciał w próbkach, co należy interpretować ostrożnie. Interpretacja jest następująca: ODPróbka < ODWYKRYWALNOŚĆ IgG Wynik negatywny w odniesieniu do przeciwciał IgG przeciw bakterii B. burgdorferi ODPróbka > ODWYKRYWALNOŚĆ IgG i < ODIgG wartość graniczna 10.4.STRESZCZENIE PROCEDURY BURGDORFERI IgG TESTU IDEIA BORRELIA Doprowadzić odczynniki do temperatury pokojowej (15–30°C) przed użyciem Rozcieńczyć próbki 1/200 dodając 10µL surowicy do 2mL rozcieńczalnika próbek 100µL kontroli lub próbki badanej Inkubować w 20–25°C wstrząsając przez 60 minut Wypłukać (x4) Dodać100µL koniugatu anty -IgG Przeciwciała są obecne. Zaleca się pobranie próbki kontrolnej po dwóch tygodniach w celu potwierdzenia stanu pacjenta. ODPróbka > ODIgG wartość graniczna 11.4.2 Interpretacja półilościowa (jednostki umowne) W zakresie wartości OD pomiędzy ODIgG Cut-Off i ODIgG Positive, wartości OD odpowiadają bezpośrednio logarytmowi umownych jednostek swoistych przeciwciał. Ilustruje to rycina 1, pokazująca wyniki dla rozcieńczeń seryjnych surowicy dodatniej co do przeciwciał przeciwko B. burgdorferi w surowicy ujemnej. 2.500 IgG Positive Control Dodać 100µL roztworu hamującego reakcję Odczytać absorbancję przy 450nm (odniesienie: 620-650nm) IgG Cut-Off Control 0.000 1 10 100 1000 Log Rozcieñczenia Rycina 1 Wyniki dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych surowicy dodatniej co do przeciwciał IgG przeciwko B. burgdorferi w surowicy ujemnej. Dodatkowo pokazano wartości OD dla kontroli ujemnej (IgG Cut-Off Control) I dodatniej (IgG Positive Control). Poziom swoistych przeciwciał w kontroli ujemnej przyjęto za 1 (UIgG Cut-Off = 1 jednostka). Poziom swoistych przeciwciał w kontroli dodatniej przyjęto za 8 x UIgG Cut-Off (UIgG Positive = 8 jednostek). Dla próbki badanej ilość jednostek umownych swoistych przeciwciał (UPróbki) wylicza się następująco: 11. KONTROLA JAKOŚCI I INTERPRETACJA WYNIKÓW TESTU 11.1.ROZCIEŃCZALNIK PRÓBEK Wartość OD dla rozcieńczalnika próbek musi wynosić mniej niż 0,100, ale więcej niż 0.000 (przy odczycie z podwójną długością fali). Jeżeli wartość wynosi powyżej 0.100, prawdopodobną przyczyną jest niedokładne wypłukanie lub zanieczyszczenie substratu. Jeżeli wartość wynosi mniej niż 0.000, należy raz jeszcze wyzerować czytnik wobec powietrza i raz jeszcze odczytać absorbancję dla wszystkicjh studzienek. Jeśli te wymagania nie zostaną spełnione, wyniki są niewiarygodne i oznaczenie należy powtórzyć. 11.2.KONTROLA PUNKTU ODCIĘCIA (UJEMNA) I DODATNIA Obliczyć średnie wartości OD dla 3 studzienek przewidzianych dla kontroli ujemnej (IgG Cut-Off Control) (ODIgG Cut-Off) i dwóch dla kontroli dodatniej (IgG Positive Control) (ODIgGPositive). Poszczególne wartości nie powinny się różnić o ponad 25% od średniej wartości OD. Jeśli jedna z trzech wartości OD dla kontroli ujemnej różni się o ponad 25% od średniej wartości OD, należy ją pominąć i obliczyć średnią tylko dla dwóch pozostałych. Różnica pomiędzy wartością OD dla kontroli ujemnej i dodatniej musi wynosić co najmniej 0,500. Jeżeli wynosi mniej niż 0,500, prawdopodobną przyczyną jest niedostateczne wypłukanie, niedostateczne wstrząsanie podczas inkubacji lub za niska temperatura, zwłaszcza podczas inkubacji z substratem. Jeśli te wymagania nie zostaną spełnione, wyniki są niewiarygodne i oznaczenie należy powtórzyć. ODPróbki - ODIgG Cut-off UPróbki=10a, a = ODIgG Positive- ODIgG Cut-off Objaw kliniczny Rumień wędrujący Limfocytarne zapalenie opon i korzeni nerwowych Zanikowe zapalenie skóry obwodowych części kończyn Czułość diagnostyczna 36% 77% 100% 14. SZCZEGÓŁOWE WARTOŚCI CHARAKTERYZUJĄCE TEST 14.1.SWOSTOŚĆ Swoistość testu IDEIA™ Borrelia burgdorferi, IgG została wyliczona w niezależnym laboratorium rutynowym w Szwecji. Badania przeprowadzono na zestawie 200 próbek surowicy pochodzących od zdrowych dawców krwi, mieszkających na obszarach endemicznego występowania boreliozy Czułośc diagnostyczną testu IDEIA Borrelia burgdorferi, IgG wyliczono w niezależnym laboratorium rutynowym w Szwecji. Badania przeprowadzono na trzech zestawach próbek badanych od chorych z niektórymi najbardziej typowymi objawami klinicznymi zakażenia B. burgdorferi: 45 próbek od chorych z rumieniem wędrującym, 38 próbek od chorych z limfocytarne zapalenie opon i korzeni nerwowych i 20 próbek od chorych z zanikowym zapaleniem skóry części obwodowych kończyn. Wyniki porównano z uprzednio opisywanymi spodziewanymi wartościami6,8 Objaw kliniczny Rumień wędrujący Limfocytarne zapalenie opon i korzeni nerwowych Zanikowe zapalenie skóry obwodowych części kończyn Czułość diagnostyczna Spodziewana Wyliczona* 36% 38% 77% 79% 100% 100% * Wyniki niejednoznaczne uznano za ujemne. x 0,9* *logUIgG Positive -logUIgG Cut-off = log8 - log1 = 0,9 Wyniki niejednoznaczne. Granica wykrywalności przeciwciał IgG wynosi 0,65 jednostki. Powyżej 1 jednostki istnieje prawdopodobieństwo obecności przeciwciał spowodowane aktywną infekcją. Próbki zawierające poniżej 0,9 jednostki specyficznych przeciwciał są interpretowane jako negatywne pod względem zawartości przeciwciał IgG przeciw bakterii B. burgdorferi. Wartości od 0,9 do 1,1 jednostki wskazują na niski poziom przeciwciał, który należy interpretować ostrożnie. Zaleca się pobranie próbki po dwóch tygodniach w celu potwierdzenia stanu pacjenta. Próbki zawierające 1,1 lub więcej jednostek specyficznych przeciwciał są interpretowane jako pozytywne w kierunku obecności przeciwciał IgG przeciw bakterii B. Burgdorferi. Dla próbek o wartościach OD powyżej wartości dla kontroli dodatniej ODIgG Positive, wynik testu należy podać jako więcej niż 8 jednostek swoistych przeciwciał IgG przeciwko B. burgdorferi. Zmiana w poziomie przeciwciał u danej osoby badanej może być uznana za istotną, jeśli ilość jednostek umownych w kolejnych badaniach podwoiła się lub zmalała o połowę. Są to jednak jedynie ogólne wytyczne. 11.3.PRÓBKI BADANE 11.4.3 Komentarze do interpretacji wyników Obliczyć średnią wartość OD dla każdej próbki badanej (ODPróbki). Poszczególne wartości dla danej próbki nie powinny różnić się o ponad 25% od średniej. Jeśli by tak było, próbkę należy zbadać ponownie. Jednak jeżeli w obu studzienkach wynik jest ujemny, a wartości różnią się o ponad 25%, można zaakceptować wynik, gdyż niskie wartości OD są mierzone z mniejszą dokładnością. Wyniki ujemne 11.4.INTERPRETACJA WYNIKÓW Wynik dodatni wskazuje na niedawną ekspozycję na B. burgdorferi. Test IDEIA Borrelia burgdorferi IgG obejmuje kontrolę wartości granicznej, zawierającą określoną ilość specyficznych przeciwciał IgG przeciw bakterii Borrelia burgdorferi. Poziomy przeciwciał oznaczone powyżej wartości granicznej wskazują na aktywną infekcję spowodowaną przez bakterię Borrelia burgdorferi. Za pomocą zestawu IDEIA Borrelia burgdorferi IgG można oznaczać przeciwciała na poziomie poniżej tej specyficznej wartości granicznej. Mogą to być ukryte przeciwciała, pochodzące z wcześniejszej infekcji lub bardzo niskie poziomy przeciwciał występujące niedługo po świeżej infekcji. Niski poziom przeciwciał należy interpretować ostrożnie. Dla uzyskania pewności co do znamienności niskiego poziomu przeciwciał, zaleca się kontrolę drugiej próbki od pacjenta po co najmniej dwóch tygodniach w celu określenia zmian w poziomie przeciwciał. 13. S PODZIEWANE WARTOŚCI Poziom kontroli punktu odcięcia (IgG Cut-Off Control) został tak dobrany, aby miał swoistość 98% dla normalnych surowic. Odpowiedź produkcją przeciwciał na wić B. burgdorferi zależy od klinicznych objawów zakażenia i czasu trwania choroby. W przypadku niektórych najczęstszych objawów klinicznych zakażenia B. burgdorferi, diagnostyczna czułość pośredniego testu do wykrywania IgG z użyciem oczyszczonego antygenu flagellum B. burgdorferi została opisana następująco6,8 14.2.CZUŁOŚĆ DIAGNOSTYCZNA 1.000 0.500 Inkubować w 20–25°C przez 10 minut 12.4.Wyniki testu są wątpliwe, jeśli odczynniki uległy modyfikacji lub były przechowywane inaczej niż zalecono w sekcji 5.2. Swoistość Spodziewana Wyliczona* 98% 98.5% *Wyniki niejednoznaczne uznano za ujemne OD 1.500 Wypłukać (x4) Dodać 100µL substratu 12.3.Wszystkie wyniki dodatnie muszą być poddane interpretacji w odniesieniu do całej dostępnej informacji klinicznej i epidemiologicznej, a nie usprawiedliwiają podjęcia leczenia. Możliwość ekspozycji na ugryzienie przez kleszcza musi być zawsze brana pod uwagę. Wynik pozytywny w odniesieniu do aktywnego wytwarzania przeciwciał IgG przeciw bakterii B. burgdorferi. 2.000 Inkubować w 20–25°C wstrząsając przez 60 minut 12.2.Wynik dodatni wskazuje na uprzedni kontakt z antygenami, a nie jest dowodem bieżącego, aktywnego zakażenia. Ujemny wynik badania nie wyklucza ekspozycji na B. burgdorferi. Jeśli nadal podejrzewa się boreliozę z Lyme, należy poddać badaniom kolejną próbkę, pobraną później. Wyniki dodatnie 14.3.REAKTYWNOŚĆ KRZYŻOWA Surowice od chorych na kiłę lub choroby zapalne (z dodatnim czynnikiem reumatoidalnym, RF) badano testem IDEIA Borrelia burgdorferi IgG, uzyskując następujące wyniki: Surowice Liczba próbek Liczba dodatnich * badane Kiła 25 0 RF 18 1 * Wyniki niejednoznaczne uznano za ujemne. 15. LITERATURA 1. Burgdorferi W, Barbour AG, Hayes SF, Benach JL, Grunwaldt E, Davis JP. (1982) Lyme disease - a tick-borne spirochetosis? Science 216: 1317-9. 2. Steere AC, Grodzicki RL, Kornblatt AN, Craft JE, Barbour AG, Burgdorferi W, et al. (1983) The spirochetal etiology of Lyme disease. N Engl J Med 308: 733-40. 3. Steere AC. (1989)Lyme disease. N Engl J Med 321: 586-96. 4. Craft JE, Duncan KF, Shimamoto GT, Steere AC. (1986) Antigens of Borrelia burgdorferi recognized during Lyme disease. Appearance of a new immunoglobulin M response and expansion of the immunoglobulin G response late in the illness. J Clin Invest 78: 934-9. 5. 5.Zöller L, Burkard S, Schäfer H. (1991) Validity of Western immunoblot band patterns in the serodiagnosis of Lyme borreliosis. J Clin Microbiol 29: 174-82. 6. Hansen K, Pii K, Lebech A-M. (1991) Improved immunoglobulin M serodiagnosis in Lyme borreliosis by using a µ-capture enzyme-linked immunosorbent assay with biotinylated Borrelia burgdorferi flagella. J Clin Microbiol 29: 166-73. 7. Hansen K, Hindersson P, Pedersen NS. (1988) Measurement of antibodies to the Borrelia burgdorferi flagellum improves serodiagnosis in Lyme disease.J Clin Microbiol 26: 338-46. 8. 8.Karlsson M. (1990) Western immunoblot and flagellum enzyme-linked immunosorbent assay for serodiagnosis of Lyme borreliosis. J Clin Microbiol 28: 2148-50. Wyniki podejrzane (niejednoznaczne) Wynik zawarty pomiędzy ±20% wartości OD dla kontroli ujemnej (IgG Cut-off) powinien być uznany za niejednoznaczny i interpretowany ostrożnie. Zaleca się powtórne poddanie badaniom tej samej próbki. Ponadto niejednoznaczny wynik powinien skłonić do pobrania od tej samej osoby i zbadania kolejnej próbki, w ciągu dwóch tygodni. Jeśli obie próbki (albo kolejne pobrane) nadal dają taki sam niejednoznaczny wynik, osoba badana może zostać uznana za ujemną co do przeciwciał IgG przeciwko B. burgdorferi. 12. O GRANICZENIA TESTU 12.1.Ujemny wynik nie wyklucza możliwości zakażenia B. burgdorferi u osoby badanej. Niewykrycie B. burgdorferi może być wynikiem działania takich czynników jak pobranie materiału w nieodpowiednim czasie, przed pojawieniem się wykrywalnych przeciwciał, nieprawidłowe pobranie lub obchodzenie się z próbką. Wczesna terapia antybiotykowa może stłumić odpowiedź humoralną, a niektóre osoby nie produkują przeciwciał na wykrywalnym poziomie. X7841 poprawione października 2011 OXOID Limited, Wade Road, Basingstoke, Hampshire, RG24 8PW, Verenigd Koninkrijk Wszelkie pytania prosimy kierować do miejscowego przedstawicielstwa lub dystrybutora Oxoid