Wyznaczanie sta³ej Ki dehydrogenaza bursztynianowej

IZOLOWANIE MITOCHONDRIÓW Z BULWY ZIEMNIAKA.
HAMOWANIE AKTYWNOŚCI DEHYDROGENAZY
BURSZTYNIANOWEJ PRZEZ MALONIAN.
WYZNACZANIE STAŁEJ INHIBICJI – KI
WSTĘP
Dehydrogenaza bursztynianowa (EC 1.3.99.1) jest flawoproteiną integralnie związaną z wewnętrzną błoną mitochondrialną.
Ryc 1. Organizacja łańcucha transportu elektronów w obrębie wewnętrznej błony mitochondriów roślin (Buchanan, Gruissem, Jones).
Grupą prostetyczną enzymu jest cząsteczka FAD kowalencyjnie związana z białkiem. Pierścień
izoalloksazynowy FAD wiąŜe się z enzymem przez resztę histydyny. Dehydrogenaza bursztynianowa jest białkiem Ŝelazo-siarkowym, które oprócz FAD zawiera 3 atomy Ŝelaza niehemowego. Zredukowany FADH2 powstający w trakcie utleniania bursztynianu nie oddysocjowuje
od enzymu, a dwa elektrony z FADH2 są przenoszone bezpośrednio na ugrupowania Fe-S. Na-
1
turalnym akceptorem wodorów odbierającym 2H z dehydrogenazy bursztynianowej (z FADH2)
jest koenzym Q (ubichinon).
Ryc. 2. Proponowana struktura i sposób ułoŜenia dehydrogenazy bursztynianowej (kompleks II)
w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (Buchanan, Gruissem, Jones).
W warunkach fizjologicznych enzym utlenia bursztynian do fumaranu w myśl reakcji:
COOH
FAD
CH2
FADH2
H
COOH
C
CH2
C
COOH
HOOC
H
Dehydrogenaza bursztynianowa
Bursztynian
Fumaran
W oznaczeniach aktywności dehydrogenazy bursztynianowej uŜywane są „sztuczne” akceptory wodoru takie jak: błękit metylenowy czy barwniki tetrazoliowe (błękit nitrotetrazoliowy, 2[p-jodofenylo-(3-p-nitrofenylo)-5-fenylotetrazoliowy chlorek]. W metodzie stosowanej w obecnym ćwiczeniu „sztucznym” akceptorem wodorów jest chlorek jodo-nitro-tetrazoliowy (INT),
który ulega redukcji do barwnego formazanu w myśl reakcji:
2
NO 2
NO 2
Cl -
Cl FADH 2 FAD
+
N=N
2
N=N
2
N-N
N-N
H
I
I
INT
INT – formazan
Powstający w reakcji INT-formazan jest rozpuszczalny w mieszaninie octan etylu/etanol i wykazuje maksimum absorbancji przy 470 nm.
Hamowanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej przez malonian
Niektóre związki o strukturze zbliŜonej do cząsteczki substratu mogą konkurować z nim o
centrum katalityczne enzymu. W przypadku dehydrogenazy bursztynianowej moŜe to być malonian lub szczawian.
COO
_
CH2
CH2
CH2
COO
COO
_
COO
_
COO
_
COO
_
_
bursztynian
malonian
szczawian
Centrum aktywne dehydrogenazy nie odróŜnia tych związków od bursztynianu w wyniku
czego powstaje kompleks enzym-inhibitor, który nie ulegając rozpadowi na enzym i produkt
blokuje centrum aktywne dehydrogenazy. Ten typ hamowania nazywany jest hamowaniem
kompetycyjnym. Hamowanie tego typu jest uzaleŜnione od stosunku stęŜenia inhibitora do stęŜenia substratu. Typ hamowania (kompetycyjny lub niekompetycyjny) oraz wartość stałej inhibicji (Ki) moŜna określić metodą graficzną wg Dixona. Metoda ta jest oparta na wyznaczaniu
szybkości reakcji (v) przy kilku stęŜeniach substratu [S] oraz kilku stęŜeniach inhibitora [I]. Na
podstawie wyznaczonych szybkości reakcji wykreślamy krzywą zaleŜności 1/v od [I] dla po3
szczególnych stęŜeń substratu. Wykres pozwala ustalić typ hamowania oraz wartość Ki (patrz
Ryc.3).
a)
b)
Ryc. 3. Krzywa Dixona: 1/v = f [I] dla inhibitora kompetycyjnego (a) i niekompetycyjnego (b).
MATERIAŁY I METODY
Odczynniki:
A. Roztwór do izolowania frakcji mitochondrialnej
•
0.3 M sacharoza, 1 mM EGTA , 2 mM β-merkaptoetanol w 50 mM buforze
Tris-HCl, pH 7.5 (bufor homogenizacyjny)
•
25 mM bufor Tris-HCl, pH 7.5 (do zawieszania osadu mitochondriów)
B. Roztwory do oznaczania aktywności dehydrogenazy bursztynianowej
•
25mM i 62.5 mM bursztynian w 0.25 M buforze fosforanowym, pH 7.4
•
0.4% roztwór INT
•
0.065 M kwas malonowy
•
mieszanina octanu etylu z etanolem (1 : 1) (v/v) zawierająca 5% kwas trójchlorooctowy
(TCA) (do hamowania reakcji)
WYKONANIE
Przygotowanie homogenatu i uzyskanie frakcji mitochondrialnej
4
OdwaŜony kawałek (25 g) obranego ziemniaka zetrzeć na tarce, a następnie zhomogenizować z
25 ml roztworu do homogenizacji (roztw. 1) w homogenizatorze noŜykowym. Homogenat przesączyć przez nylon i rozlać do dwóch probówek wirówkowych o objętości 30 ml. Odwirować
resztki tkanki, skrobię, ściany komórkowe, jądra stosując wirowanie przy 1000 x g (4000 obr/min w wirniku o promieniu 7 cm) przez 10 min. Nadsącz (supernatant) ostroŜnie zebrać pipetką Pasteura znad osadu do czystych dwóch probówek wirówkowych i po zrównowaŜeniu odwirować przy 11 000 x g (15 000 obr/ min w wirniku o promieniu 7 cm), przez 20 min. Supernatant ostroŜnie zlać, a osad mitochondriów zawiesić w małej objętości (ok.1-2 ml) 25 mM buforu
Tris-HCl, pH 7.5 (roztw. 2). Zawiesinę przenieść do cylindra miarowego i uzupełnić 25 mM
buforem Tris-HCl, pH 7.5 do objętości 6 ml.
Uwaga: roztwory, homogenat i zawiesina wyizolowanych mitochondriów powinny być cały
czas przechowywana w lodzie!
Wykonanie oznaczeń
Przygotowanie roztworów inhibitora
Z wyjściowego 65 mM roztworu kwasu malonowego przygotować 5 rozcieńczeń w następujący
sposób: odmierzamy – 0.25, 0.50, 0.75, 1.0 i 1.5 ml 65 mM kwasu malonowego, a następnie
uzupełniamy wodą destylowaną do 5 ml. Otrzymujemy roztwory kwasu malonowego o rosnących stęŜeniach. Oblicz jakie są to stęŜenia!
Roztwory substratu
Środowisko reakcyjne będzie zawierało dwa róŜne stęŜenia bursztynianu. Na stanowisku są
przygotowane roztwory 25 mM i 62.5 mM bursztynianu w 250 mM buforze fosforanowym pH
7.4.
Przygotowania mieszaniny reakcyjnej
Do oznaczeń przygotować i opisać 26 probówek. Do 12 probówek (6 x 2) pipetujemy po 0.4
ml zbuforowanego 25 mM bursztynianu sodowego, a do kolejnych 12 probówek (6 x 2 ) po 0.4
ml 62.5 mM bursztynianu. Do pozostałych dwóch probówek (próby zerowe) dodajemy po 0.4
ml 250 mM buforu fosforanowego, pH 7.4 (pipetowanie roztworów proszę zaczynać od prób
zerowych; próby zerowe nie zawierają substratu!).
Do wszystkich (26) probówek dodać po 0.2 ml 0,4 % INT, a następnie z kaŜdego zestawu 12
probówek (6 x 2), które zawierają dwa róŜne stęŜenia bursztynianu, wydzielamy dwie próby
kontrolne (próby kontrolne nie będą zawierać inhibitora). Do prób kontrolnych dodajemy po 0.2
ml H2O, natomiast do pozostałych 10 prób (5 x 2) pipetujemy po 0.2 ml kwasu malonowego o
5
wzrastającym stęŜeniu (przygotowane rozcieńczenia malonianu). Do prób zerowych (nie zawierających bursztynianu) moŜemy zamiast malonianu dodać po 0.2 ml wody. Wszystkie próby
wstawiamy do termostatu (300C) i po 5-cio minutowej preinkubacji w celu doprowadzenia
temp. środowiska reakcyjnego do 300C, rozpoczynamy reakcję dodając po 0.2 ml zawiesiny
mitochondriów (w oznaczeniach uŜywamy stopera). Reakcję przerywamy po 15 min. inkubacji,
dodając do kaŜdej próby po 1.5 ml mieszaniny - octan etylu/etanol/TCA. KaŜdą próbę natychmiast bardzo dokładnie wytrząsać, aŜ do zaniku zmętnienia. NatęŜenie barwy jednorodnego
roztwory zawierającego powstały INT-formazan zmierzyć wobec próby zerowej przy λ = 470
nm.
OPRACOWANIE WYNIKÓW
Korzystając z podanego współczynnika (k = 1.95; wartość będzie wyraŜona w nmolach INTformazanu na próbę) obliczyć ilość powstającego INT-formazanu w czasie 1 minuty. Wyliczyć
wartość 1/v i sporządzić wykres zaleŜności 1/v od stęŜenia malonianu (krzywa Dixona). Określić typ inhibicji i wyliczyć wartości Ki.
UWAGA !
-roztwór uŜywany do hamowania reakcji proszę pipetować pipetą szklaną z nasadką
-pomiarów absorbancji nie moŜna dokonywać w kuwetach plastikowych
-przed sporządzeniem wykresu naleŜy obliczyć końcowe stęŜenie substratu i inhibitora w mieszaninach reakcyjnych
6