Tytuł projektu Chlorowane naftaleny jako czynniki zaburzające

Tytuł projektu
Chlorowane naftaleny jako czynniki zaburzające funkcje endokrynne jajnika
Finansowanie
Narodowe Centrum Nauki
Typ konkursu
PRELUDIUM
Numer
UMO-2012/07/N/NZ7/01142
Data rozpoczęcia
2013-09-13
Data zakończenia
2015-09-12
Zespół projektowy
mgr Justyna Barć – kierownik projektu
prof. dr hab. Ewa Łucja Gregoraszczuk – opiekun naukowy/promotor
W ramach projektu możliwe było wykonanie pracy doktorskiej:
„Chloronaftaleny jako czynniki zaburzające funkcje jajnika” – mgr Justyna Barć
Wyniki badań projektu:
Pierwszym celem niniejszego projektu, było określenie, który z kongenerów (CN73, CN74 czy
CN75) wchodzących w skład mieszaniny chlorowanych naftalenów Halowax 1051 odpowiedzialny jest
za, obserwowany wcześniej, androgenny efekt mieszaniny, a także odpowiedzenie na pytanie, czy
możliwe jest oszacowanie działania mieszaniny na podstawie znajomości działania pojedynczych
kongenerów wchodzących w jej skład. Pęcherzyki jajnikowe poddane zostały inkubacji z
pojedynczymi kongenerami Halowax 1051, a także ze sztucznie stworzonymi mieszaninami, przez 6
lub 24 godziny. Po zakończonej ekspozycji zebrano media hodowlane do zmierzenia poziomu
wydzielonych hormonów steroidowych: progesteronu (P4), androstendionu (A4), testosteronu (T)
oraz estradiolu (E2) testem EIA, a w pęcherzykach oznaczono ekspresję receptora węglowodorów
aromatycznych (AHR), enzymu CYP1A1 oraz enzymów zaangażowanych w steroidogenezę: CYP17,
CYP19 i 17 β-HSD metodą Western blot. CN73 w dawce 50 pg/ml po 6 godzinach ekspozycji nie miał
wpływu, a po 24 godzinach obniżał ekspresję AHR, ale w dawce 400 pg/ml podnosił ekspresję AHR po
6 godzinach, który to efekt utrzymywał się także po 24 godzinach. CN74 i CN75 w obu badanych
dawkach (25 i 50 pg/ml) podnosiły ekspresję AHR po 6 godzinach i obniżały ją po 24 godzinach.
Pojedyncze kongenery powodowały szybką aktywację ekspresji enzymu CYP1A1 z następującym
natężeniem: CN73 > CN74 = CN75. Wszystkie kongenery podniosły stosunek P4/A4 i T/E2
wydzielanych hormonów steroidowych i obniżyły stosunek A4/T, wskazując na ich androgenne i anty-
estrogenne działanie. Najsilniej działającym kongenerem okazał się CN73. Efekty sztucznych
mieszanin były porównywalne do efektów wywoływanych przez CN74 i CN75, ale nie były tak silne
jak działanie samego CN73. Otrzymane dane sugerują antagonistyczne działanie pojedynczych
kongenerów w mieszaninie, co tym samym wskazuje na brak możliwości przewidzenia działania
mieszaniny wyłącznie na podstawie efektów wywoływanych przez pojedyncze kongenery.
Drugim celem projektu było określenie receptorowgo mechanizmu działania Halowax 1051 w
pęcherzyku jajnikowym. Ekspresja genów dla receptora węglowodorów aromatycznych (AHR),
receptorów estrogenowych (ERα/β) i receptora androgenowego (AR) została określona metodą PCR
w czasie rzeczywistym, ekspresja białek receptorowych – metodą Western blot, a poziom
wydzielanych hormonów steroidowych: androstendionu (A4), testosteronu (T) oraz estradiolu (E2)
został zmierzony metodą EIA. Wyniki badań pokazały obniżenie ekspresji genu dla AHR po 6
godzinach ekspozycji i zahamowanie ekspresji białka po 24 godzinach; obniżenie ekspresji genów dla
ERα i ERβ oraz podniesienie ekspresji genu dla AR bez wpływu na ich poziom białka. W celu zbadania
zaangażowania AHR, ERα/β oraz AR w działanie chlorowanych naftalenów na steroidogenezę w
jajniku użyto specyficznych blokerów dla tych receptorów, odpowiednio: α-naftoflawonu, ICI-182,780
oraz hydroksyflutamidu. α-naftoflawon odwrócił działanie Halowax 1051 na sekrecję androstendionu
oraz wzmocnił jego efekt na sekrecję testosteronu, natomiast ani ICI-182,780 ani hydroksyflutamid
nie wpłynęły na działanie Halowax 1051 na sekrecję hormonów steroidowych. Wyniki tych badań
sugerują, że AHR, ale nie ERα/ERβ ani AR, jest zaangażowany w działanie chlorowanych naftalenów
na steroidogenezę jajnikową. Wskazują one także na także istnienie możliwego powiązania dróg
przekazywania sygnału (tzw. „cross-talk”) pomiędzy AHR i ERα/ERβ oraz między AHR i AR w
pęcherzykach jajnikowych.
Rys. 1. Schemat podsumowujący działanie mieszaniny chlorowanych naftalenów w pęcherzyku jajnikowym. (A)
Chlorowane naftaleny stymulują aktywność i ekspresję 17 β-HSD przy jednoczesnym zahamowaniu aktywności i
ekspresji CYP19, czego konsekwencją jest zwiększona sekrecja T i obniżona sekrecja E2. (B) W działanie PCN
zaangażowany jest receptor AHR, czego efektem jest zmiana ekspresji białek, m.in. aktywacja enzymu CYP1A1.
Związki te zmieniają także ekspresję genów, obniżają ekspresję ER α i ER β, a podnoszą ekspresję AR. (C)
Chlorowane naftaleny powodują zwiększenie aktywności i ekspresji CYP1A1, przy jednoczesnym zahamowaniu
aktywności i ekspresji COMT i SULT1A, co może prowadzić do akumulacji metabolitów w pęcherzyku
jajnikowym.
Doniesienia konferencyjne:
Justyna Barć, Ewa Łucja Gregoraszczuk, Receptor mediated action of polychlorinated naphthalenes
mixture Halowax 1051 in the porcines ovarian follicles, SEB Prague Annual Meeting, Praga, Czechy,
2015
Publikacje:
Barć J, Gregoraszczuk EŁ. Effects of individual polychlorinated naphthalene (PCN) components of
Halowax 1051 and two defined, artificial PCN mixtures on AHR and CYP1A1 protein expression,
steroid secretion and expression of enzymes involved in steroidogenesis (CYP17, 17β-HSD and
CYP19) in porcine ovarian follicles. Toxicology. 2014 Aug 1;322:14-22. IF = 4,017
Barć J, Gregoraszczuk EL. Halowax 1051 affects steroidogenesis by down-regulation of aryl
hydrocarbon and estrogen receptors and up-regulation of androgen receptor in porcine ovarian
follicles. Chemosphere 2015 144:467-474. (IF = 3,340)