Manna_Streszczenie_PL_26-03

Streszczenie
Izomery heksachlorocykloheksanu (HCH) wykorzystywane głównie w rolnictwie jako
pestycydy są chlorowcopochodnymi stanowiącymi wysoce uporczywe zanieczyszczenie
środowiska. Ich stosowanie zostało zakazane w większości krajów, pozostał jednak problem
usunięcia ich z zanieczyszczonych terenów. Na przestrzeni kilku ostatnich dekad badacze
środowiskowi i biochemicy w ośrodkach naukowych na całym świecie podejmowali próby
opisania roli dehydrohalogenazy LinA i dehalogenazy LinB w procesie degradacji izomerów
HCH. Jednakże, szczegóły mechanizmów stojących za tymi przemianami nie zostały dotąd
poznane. W przedstawionej rozprawie wykorzystane zostały metody chemii obliczeniowej do
poprawienia naszej wiedzy dotyczącej mechanizmów biodegradacji HCH katalizowanej przez
LinA i LinB oraz do oceny czy kinetyczne efekty izotopowe będące potężnym narzędziem
doświadczalnym do badania mechanizmów reakcji chemicznych i biochemicznych również
i w tym przypadku mogłyby odegrać rolę mechanistycznego wskaźnika i jeśli tak to w jakim
stopniu.
LinA katalizuje dehydrohalogenację izomerów α-, γ- i δ, natomiast jej aktywność w
stosunku do izomeru  jest bardzo niska. W centrum aktywnym LinA, para His73-Asp25
pełni rolę katalitycznej diady. Obliczenia struktury elektronowej dla uproszczonych
(klastrowych) modeli centrum aktywnego LinA pozwoliły wstępnie zaproponować
mechanizm reakcji katalizowanej przez ten enzym. Pokazano, że eliminacja jednej pary H/Cl
zachodzi według uzgodnionego mechanizmu E2, istnieją jednak znaczące różnice pomiędzy
izomerami. Struktura stanu przejściowego dla -HCH jest inna niż struktura stanów
przejściowych zlokalizowanych dla pozostałych izomerów. Przewidziane kinetyczne efekty
izotopowe chloru, węgla oraz wodoru okazały się być dodatkowym, przydatnym narzędziem
umacniającym wnioski płynące z analizy struktur stanów przejściowych oraz dokowania
czterech izomerów do centrum aktywnego LinA.
-HCH jest chętniej metabolizowany przez drugą dehalogenazę z rodziny Lin - LinB.
Reakcja ta przebiega według mechanizmu SN2 przy udziale Asp125 jako nukleofila.
Wymodelowana reakcja dehalogenacji jak i przewidziane kinetyczne efekty izotopowe chloru
zarówno przy użyciu klastrowych modeli centrum aktywnego jaki i całego modelu enzymu z
powodzeniem wpasowują się w istniejącą już bibliotekę podobnych przemian katalizowanych
przez inne dehalogenazy hydrolityczne. Dodatkowo metody symulacji dynamiki molekularnej
zostały zastosowane do określenia możliwych różnic pomiędzy wiązaniem się różnego
rozmiaru substratów w centrum aktywnym LinB (-HCH, 1-chlorobutan, -heksabromocyklododekan).
Obliczenia QM/MM mające na celu wyznaczenie energii swobodnych zostały również
zastosowane do określenia roli stanu uprotonowania His73 w centrum aktywnym LinA w
reakcji dehydrohalogenacji izomerów  i . Dwie różne ścieżki reakcji (mechanizm
uzgodniony i etapowy) zostały znalezione dla izomeru  i tylko jedna (mechanizm etapowy)
dla formy . W reakcji etapowej, w pierwszym etapie ma miejsce przeniesienie protonu
między His73 a Asp25, w drugim zaś anionowa forma His73 odrywa proton od cząsteczki
substratu i dochodzi do zerwania wiązania węgiel-chlor. W mechanizmie uzgodnionym zaś
neutralna forma His73 odpowiedzialna jest za zainicjowanie eliminacji pary H/Cl. Reakcja z
-HCH zachodzi jedynie z silniejszą zasadą (tj. anionową formą His73).
Dość znaczne różnice pomiędzy kinetycznymi efektami izotopowymi chloru i wodoru
przewidzianymi dla izomerów  i  oraz dla różnych mechanizmów ich degradacji,
podstawienia nukleofilowego w przypadku LinB oraz eliminacji w przypadku LinA, są
obiecującą obserwacją dla wykorzystania efektów izotopowych jako mechanistycznego
wskaźnika celem określenia typu zanieczyszczenia oraz organizmu odpowiedzialnego za jego
utylizację.
Swobodne energie aktywacji obliczone przy użyciu metody QM/MM oraz różnych
obliczeniowych technik do opisu reakcji są w zgodzie z wartościami wyznaczonymi na
podstawie danych doświadczalnych.