Złącza szczelinowe i koneksony - budowa

Kalceina
Komunikacja międzykomórkowa –
między biologią a cytochemią
Jarosław Czyż
Zakład Biologii Komórki, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ
[email protected]
Złącza szczelinowe i koneksony - budowa
Jednostka strukturalna - koneksyna
• Koneksyny stanowią dużą konserwatywną rodzinę (wykazują homologię pod
względem sekwencji aminokwasowej w 60%). Geny kodujące różne rodzaje
koneksyn znajdują się na kilku chromosomach
• W jej skład wchodzi przynajmniej 20 konserwatywnych ewolucyjnie rodzajów
białek, które zaklasyfikowano do różnych grup i nazwano według ich mas
cząsteczkowych ( 26 – 60 kDa)
• Białka te w środowisku lipidowym spontanicznie formują heksamery
(koneksony)
• W jednej komórce możliwa jest ekspresja kilku różnych rodzajów koneksyn,
również w obrębie jednego koneksonu mogą występować różne koneksyny
•Koneksyny obecne są u kręgowców. U bezkręgowców
występują ineksyny
Budowa i funkcje złącz
NH
szczelinowych…
3
+
1
E1
- tworzenie kanałów łączących przedziały
cytoplazmatyczne sąsiednich komórek
2
- międzykomórkowa bierna wymiana
dobnocząsteczkowych metabolitów o
3
E2
4
_
COO
masie poniżej 1.5 kDa
Konekson
(Eckert &Huelser, zmienione)
4
Kanały łączące przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek
Tkankowo-specyficzne funkcje złącz szczelinowych
Sprzężenie elektryczne; np. w miokardium , układzie nerwowym i innych tkankach pobudliwych
Serce
Koneksyna
Cx40
Cx43
Cx45
Funkcja
- międzykomórkowy transfer jonów
wapnia
-synchronizacja aktywności
skurczowej kardiomiocytów
Układ nerwowy
Cx32
Cx37
Cx43
- przewodnictwo nerwowe
- wewnątrzcytoplazmatyczny transfer
metabolitów w komórkach Schwanna
Sprzężenie metaboliczne; np. wątroba i inne tkanki niepobudliwe
Np. wątroba i trzustka
Cx32
Cx36
- synchronizacja wydzielania insuliny
przez komórki β trzustki
- synchronizacja sekrecji glukozy
przez hepatocyty
Czynniki determinujące funkcje złącz
szczelinowych:
- poziom I – zależny od typu i lokalizacji koneksyny w danej komórce
- poziom ekspresji danej koneksyny
- typ koneksyny budującej złącze i ‘kompatybilność’ koneksonów
zbudowanych z różnych koneksyn
- selektywność kanałów złącz szczelinowych
- transport do błony i wewnątrzkomórkowa lokalizacja koneksyn
- poziom II – zależny od zewnętrznych regulatorów funkcji złącz szczelinowych
- regulatory przepuszczalności kanałów złącz szczelinowych np. pH, stężenie wewnątrzkomórkowego
wapnia
- aktywność szlaków sygnałowych determinujących przepuszczalność kanałów poprzez zmiany poziomu
fosforylacji koneksyn
-stabilizacja złącz przez białka adhezji międzykomórkowej - stabilizacja mechaniczna
Skład koneksonów decyduje o funkcji złącz jako
specyficznych mediatorów międzykomórkowej
wymiany informacji
Laird, 2007
Złącza szczelinowe wykazują selektywność dla cząsteczek, która
zależy od składu koneksonów
Selektywność złącz szczelinowych
zbudowanych z Cx32
Goldberg et al., 2002
Wniosek: złącza szczelinowe zbudowane z Cx32 wykazują selektywną
przepuszczalność dla cząsteczek o ładunku dodatnim
Ekspresja różnych izoform koneksyn w komórkach sugeruje
rolę interakcji między nimi w determinowaniu funkcji
koneksonów i złącz szczelinowych
homomeryczne heteromeryczne
- ze względu na budowę koneksonów
homotypowe
-ze względu na budowę kanałów
heterotypowe
heterotypowe-heteromeryczne
„Obrót” koneksyn
Saez et al., 2003
Kompleksy białkowe towarzyszące złączom szczelinowym
Winkulina
Mikrotubule
kateniny
N-kadheryna
Szlak Wnt
Wei et al., 2004
Białka związane z „kompleksem powierzchniowym” decydują zarówno o ekspresji,
jak i o funkcji złącz szczelinowych
Czynniki determinujące funkcje złącz
szczelinowych:
- poziom I – zależny od typu i lokalizacji koneksyny w danej komórce
- typ koneksyny budującej złącze i ‘kompatybilność’ koneksonów zbudowanych z różnych koneksyn
- selektywność kanałów złącz szczelinowych
- poziom ekspresji danej koneksyny
- transport do błony i wewnątrzkomórkowa lokalizacja koneksyn
- poziom II – zależny od zewnętrznych regulatorów funkcji złącz
szczelinowych
- regulatory przepuszczalności kanałów złącz szczelinowych np. pH,
stężenie wewnątrzkomórkowego wapnia
- aktywność szlaków sygnałowych determinujących przepuszczalność
kanałów poprzez zmiany poziomu fosforylacji koneksyn
-stabilizacja złącz przez białka adhezji międzykomórkowej - stabilizacja
mechaniczna
Zmiany stężenia jonów wpływają na przepuszczalność
kanałów złącz szczelinowych
Niskie Ca++
Wysokie Ca++
Sens – ochrona komórek przed „szokiem wapniowym” wynikającym z napływu
jonów wapnia do uszkodzonej sąsiedniej komórki
Właściwość ta służy utrzymaniu homeostazy wapniowej w tkankach
Szlaki sygnałowe warunkujące bramkowanie kanałów złącz
szczelinowych
closed
Kniga p. 47
Różnorodne szlaki sygnałowe wpływają na intensywność komunikacji
międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych w sposób
zależny od przewodnictwa kanałów
Kategorie składników „kompleksu powierzchniowego”
regulujących funkcje złącz szczelinowych
1. Białka sygnałowe
2. Białka strukturalne
Laird, 2005
Choroby związane z
dysfunkcją złącz
szczelinowych
- Mutacje genu kodującego Cx37 wywołują niepłodność samic myszy, co wynika z roli Cx37 w
komunikacji międzykomórkowej między oocytami, a komórkami granulosa
- Zahamowanie funkcji genu kodującego Cx40 prowadzi do arytmii pracy mięśnia sercowego,
poprzez upośledzenie przewodzenia bodźców elektrycznych między przedsionkami a komorami
- Zahamowanie funkcji genu kodującego Cx43 wywołuje wady rozwojowe mięśnia
sercowego, najprawdopodobniej wynikające ze zmian aktywności migracyjnej
komórek grzebienia neuralnego
- Spadek ekspresji Cx32 upośledza koordynację sekrecji glukozy przez hepatocyty
wywołanej bodźcem elektrycznym, a także znacznie zwiększa ryzyko rozwoju
nowotworów wątroby
- Mutacje genu kodującego Cx26 wywołują głuchotę, prawdopodobnie poprzez
upośledzenie międzykomórkowego transferu jonów potasu w obrębie ucha
16
wewnętrznego
Funkcja Cx32 w determinowaniu wewnątrzkomórkowego
transferu metabolitów w obrębie komórek Schwanna
Mutacje genu kodującego Cx32 (stwierdzono przynajmniej 90 ich typów !),
wywołują u człowieka chorobę Charcot-Marie-Tooth (CMTX), polegającą na
postępowej degeneracji nerwów peryferycznych, wynikającej z upośledzonej
komunikacji między fałdami komórek Schwanna
Xu, COCB 2004
Funkcja „niszy” czyli mikrośrodowiska komórek w
transformacji nowotworowej
Mediatory wymiany informacji
między komórką a „niszą” wspomagające
transformację nowotworową:
Neo
- zaburzenia funkcji endo- i egzogennych
czynników humoralnych– oddziaływania
„krynne”
- modyfikacje składu macierzy
międzykomórkowej oraz ekspresji receptorów
adhezji komórkowej, np. integryn i kadheryn
- zmiany równowagi mechanochemicznej w
obrębie „niszy”, prowadzące do zaburzeń
wymiany bodźców mechanicznych między
komórka a jej mikrośrodowiskiem
-deregulacja bezpośredniej wymiany
metabolitów za pośrednictwem złącz
szczelinowych
Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174
Involvement of gap junctional coupling in tumorigenesis
Stages of tumorigenesis
-Neoplasia (initiation)
-Promotion
-Progression – invasion/metastasis
Tranfected connexin
Breast Carcinoma
Cx26/Cx43
Cervical adenocarcinoma (HeLa) Cx43
Glioblastoma (U251T98G)
Cx43
Hepatoma (SKHep1)
Cx32
Lung carcinoma (PG)
Cx43
Melanomas (UACC903)
Cx43
Prostate cancer (LNCaP)
Cx32/Cx43
Reduced growth in vitro/in vivo (Hirschi et al.. 1996)
Reduced anchorage-independent growth (King et al.., 2000)
Decreased cell proliferation in vitro (Huang et al.. 1998)
Retarded tumorigenicity (Eghbali et al.., 1991)
Reduced growth rate (Zhang et al.., 1998)
Anchorage-dependent growth (Su et al.., 2000)
Inhibited growth (Mehta et al.., 1999)
19
Rola złącz szczelinowych w rozwoju
nowotworów
Efekt hamujący :
1.
2.
Spadek ekspresji koneksyn obserwowany jest na wczesnych etapach rozwoju nowotworów.
Re-ekspresja koneksyn w komórkach transformowanych przynajmniej częściowo przywraca
fenotyp charakterystyczny dla komórek prawidłowych.
3.
Koneksyny wpływają na aktywność szlaków sygnałowych zależnych od cyklin, w sposób
niezależny od komunikacji międzykomórkowej
Efekt promujący:
1.
Wiele linii komórek nowotworowych cechuje
wysoki poziom ekspresji koneksyn i wysoka
intensywność komunikacji międzykomórkowej
za pośrednictwem złącz szczelinowych
(Trosko, 2002)
20
Zmutowane somatyczne komórki macierzyste
jako źródło nowotworów
Rozwój guza pierwotnego
Inicjacja nowotworu
Czynniki inicjujące
Zaburzenia proporcji między podziałem
Mutacje genów regulatorowych
symetrycznym i asymetrycznym
Inwazyjna komórka macierzysta
Możliwe cechy odpowiedzialne za inwazyjność komórek
nowotworowych:
- Ruchliwość
- Cechy reologiczne
- Aktywność enzymów proteolitycznych
- Ekspresja białek adhezji
- Ekspresja koneksyn
- Reaktywność na chemoatraktanty
Guz wtórny
Rola złącz szczelinowych w rozwoju
nowotworów-rozwinięcie
Wiele linii komórek nowotworowych cechuje wysoki poziom ekspresji koneksyn i
wysoka intensywność komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem
złącz szczelinowych
Efekt promujący:
Czyż, 2008
22
Konkluzja:
23
Trosko, 2001
Techniki wizualizacji
struktury i funkcji
złącz szczelinowych
Wizualizacja budowy i składu złącz
szczelinowych
przy pomocy mikroskopii elektronowej
Huelser, 2000
Wizualizacja złącz szczelinowych - immunocytochemia
DNA
Cx43
Melanoma B16
Daniel et al., 2008
Zastosowanie GFP w wizualizacji koneksyn
Cx43-GFP
Pameleaire, 2005
Merge
Kalceina
Techniki analizy intensywności komunikacji
międzykomórkowej za pośrednictwem złącz
szczelinowych
1. Techniki elektrofizjologiczne
2. Pomiar międzykomórkowego przepływu jonów wapnia
Paemeleire et al.. 2005
Mikroiniekcja
Wybraną komórkę nastrzykuje się barwnikiem a następnie
obserwuje się tempo jego rozchodzenia do komórek sąsiednich…
„Scrape-loading”
Komórki uszkadza się, aby przez uszkodzoną błonę przeszedł barwnik
fluorescencyjny, który następnie przenika do sąsiednich komórek przez złącza
szczelinowe. Tempo rozchodzenia się barwnika jest miarą funkcji złącz
szczelinowych w badanej populacji
Gap-FRAP
Xie, 2007
Techniki analizy komunikacji międzykomórkowej za
pośrednictwem złącz szczelinowych
1.
Analizy elektrofizjologiczne (np. patch-clump)
2.
Analizy oparte na pomiarach intensywności międzykomórkowego transferu
cząsteczek np.:
- metabolitów znakowanych izotopami promieniotwórczymi (np. C14-glukoza, jony
wapnia)
- barwników fluorescencyjnych:
Techniki wprowadzania barwników fluorescencyjnych do komórki:
- mikroinjekcja
- elektroperforacja
- „dye-loading”
Calcein
DiI
Donor cell
Czyż et al., Exp. Cell Res. (2000),255:40-46
2h
Jakościowa analiza intensywności komunikacji
międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych
techniką wizualizacji międzykomórkowego transferu kalceiny
Czyz et al., 2000
Ilościowa analiza intensywności komunikacji międzykomórkowej za
pośrednictwem złącz szczelinowych techniką pomiaru międzykomórkowego
transferu kalceiny z wykorzystaniem cytometrii przepływowej
DiI
Calcein
Donor cell
Analiza funkcji złącz
szczelinowych oparta na
wykorzystaniu kalceiny w
połączeniu z kwantyfikacją
transferu barwnika za pomocą
cytometrii przepływowej stanowi
alternatywę dla innych technik np.
mikroiniekcji fluorochromu, co
przede wszystkim wynika z
możliwości zobiektywizowanej
analizy międzykomórkowej
komunikacji w układach
heterotypowych i
heterologicznych.
Czyż et al., 2000
2h
Ilościowa analiza intensywności komunikacji
międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych z
wykorzystaniem cytometrii przepływowej
Cr = Ngreen/Nred
Wykorzystanie cytometrii przepływowej
umożliwia zobiektywizowaną analizę funkcji złącz
szczelinowych w populacjach komórek
prawidłowych i nowotworowych
BICR/M1Rk
Cx43 RIN
3T3/SV40
HeLa Cx43
Hela Cx40
HeLa
Czyż et al., Exp. Cell Res. (2000),255:40-46
Analiza wpływu apigeniny na fizjologię komórek nowotworowych
Aktywność fizjologiczna:
- zmiatacz wolnych rodników
- antyutleniacz
- inhibitor kinaz białkowych
Reaktywność komórek na apigeninę:
- Apoptoza
- Zahamowanie proliferacji
- Indukcja funkcji złącz szczelinowych
1) Czy i w jaki sposób międzykomórkowa wymiana metabolitów wpływa na reaktywność
komórek na apigeninę ?
Analiza wpływu Cx43 na wrażliwość komórek linii HeLa na działanie
apigeniny z wykorzystaniem cytometrii przepływowej
10 µM Api
Control
Hela wt
30 µM Api
B
A
G1 - 36%
S - 33%
G2 - 31%
Apo - 0.5%
175
100
250
500
350
50 µM Api
C
G1 - 47%
S - 19%
G2 - 34%
Apo - 23%
G1- 55%
S - 22%
G2 - 23%
Apo - 2.4% 125
250
D
G1 - 42%
S - 18%
G2 - 40%
Apo - 44%
50
0
0
250
500
750
400
Hela Cx43
200
0
1000
E
G1 - 50%
S - 31%
G2 - 19%
Apo - 0,6%
250 500
750
0
250
500
750
400
200
1000
10000
F
250
500
200
250 500
750
0
1000
1000
G
G1 - 63%
S - 19%
G2 - 18%
Apo - 6,1% 100
0
750
250
… by-stander effect…
1000
1000
H
G1 - 39%
S - 23%
G2 - 38%
Apo - 61%
50
0
750
750
100
G1 - 50%
S - 18%
G2 - 32%
Apo - 43%
250 500
500
250 500
750
1000
Podsumowanie
Klasyfikacja technik analizy GJIC
1. Techniki wizualizacji koneksyn i składu złącz szczelinowych
2. Metody analizy intensywności komunikacji międzykomórkowej za
pośrednictwem złącz szczelinowych
3. Metody analizy selektywności złącz szczelinowych
GJIC- gap junctional intercellular coupling
Ruetz&Huelser, 2001
Goldberg, 2003