PDF file

Biosensoryczne właściwości
nanocząstek półprzewodnikowych
Bożena Sikora
Promotor: prof. Danek Elbaum
Zespół Fizyki Biologicznej
Instytut Fizyki Polskiej Akademii Nauk
1
Cel badań
Wczesne wykrywanie chorób neurodegeneracyjnych
(choroba Alzheimera, choroba Parkinsona)
Choroby neurodegeneracyjne
grupa wrodzonych lub nabytych postępujących chorób układu nerwowego, w których
podstawowym zjawiskiem patologicznym jest utrata komórek nerwowych.
W wyniku procesu chorobowego dochodzi do wystąpienia szeregu uszkodzeń neurologicznych
(np. uszkodzenia związane z funkcją motoryczną, uszkodzenia związane z pamięcią).
Proces prowadzący do wystąpienia objawów choroby neurodegeneracyjnej rozpoczyna się
znacznie wcześniej i przebiega przez długi czas (często latami) bezobjawowo. Pierwsze
objawy pojawiają się kiedy znacząca ilość neuronów ulegnie uszkodzeniu lub uszkodzenie
dotyczy określonej części ośrodkowego układu nerwowego.
Neurony – komórki nie
dzielące się
Brak diagnostyki na
wczesnym etapie rozwoju
choroby, dlatego brak jest
skutecznych leków
2
Koloidalne nanocząstki półprzewodnikowe
(nanokryształy, kropki kwantowe)
• kryształy o rozmiarach nanometrowych
• ograniczenia kwantowe (quantum confinement effect)
Rysunek: W. H. Suh,
Suh, K. S. Suslick,
Suslick, G. D. Stucky,
Stucky, Y. H. Suh,
Suh, Progress in Neurobiology, 2009, 87, 133133-170.
• interesujące właściwości optyczne
¾ możliwość regulowania długości fali
luminescencji poprzez rozmiar
¾ duży współczynnik ekstynkcji
¾ wysoka wydajność kwantowa
¾ duży stosunek powierzchni do objętości
¾ brak fotowybielania (utrata zdolności do
luminescencji po wyemitowaniu określonej
liczby fotonów)
Wady: brak specyficzności w systemach
biologicznych, niska czułość na środowisko
= brak „inteligencji” biologicznej
Rysunek: W. H. Suh,
Suh, K. S. Suslick,
Suslick, G. D. Stucky,
Stucky, Y. H. Suh,
Suh,
Progress in Neurobiology, 2009, 87, 133133-170.
3
„Inteligencja” koloidalnych nanocząstek
półprzewodnikowych
Pokrywanie nanocząstek związkami organicznymi
• stabilizacja przeciw agregacji
• modyfikacja właściwości powierzchni
(hydrofobowe, hydrofilowe, amfifilowe)
• Grupy funkcyjne wykorzystywane do
przyłączania innych molekuł (np. molekuł
biologicznie aktywnych)
Nanocząstka (5 nm) pokryta różnymi hydrofilowymi
ligandami: MAA (kwas merkaptooctowy), MPA (kwas
merkaptopropionowy), MUA (kwas
merkaptoundekanowy), MSA (kwas
merkaptobursztynowy) DHLA (kwas dihydroliponowy),
Nanocząstka (5 nm) pokryta różnymi
hydrofobowymi ligandami: TOPO (tlenek bis-sulfonowana trifenylofosfina, mPEG5-SH, mPEG45SH (2000 g/mol), krótki peptyd (CALNN)
trioktylofosfiny),TPP (trifenylofosfina),
DDT (dodekanotiol), TOAB (bromek
tetrabutyloamoniowy)
R. A. Sperling, Surface Modification and Functionalization of Colloidal Nanoparticles, 2008, Marburg
4
„Inteligencja” koloidalnych nanocząstek
półprzewodnikowych
Przyłączanie biologicznie aktywnych
molekuł nadaje biologiczną „inteligencję”
•
•
•
•
•
•
•
lipidy (składniki błon komórkowych)
witaminy
peptydy
cukry
białka (np. przeciwciała)
enzymy
DNA i RNA
Nanocząstka (5 nm) pokryta warstwą organiczną (10 nm)
z aktywnymi grupami, do których mogą być przyłączone:
molekuły poliglikolu etylenowego PEG (2000 g/mol), PEG
(5000 g/mol), streptoawidyna, transferyna, przeciwciało
(IgG), albumina, pojedyncza nić DNA
R. A. Sperling, Surface Modification and Functionalization of Colloidal Nanoparticles, 2008, Marburg
5
Toksyczność koloidalnych nanocząstek
półprzewodnikowych
Toksyczność nanocząstek
półprzewodnikowych CdSe/ZnS:
¾ wysoka toksyczność spowodowana
dysocjacją metali ciężkich[1],[2] powodujących
śmierć komórek
Toksyczność nanocząstek metali (Ag, Au)
¾ średnia toksyczność spowodowana
przyłączaniem się do nici DNA[3]
Toksyczność nanocząstek tlenków i
nanocząstek polimerowych
¾ najmniejsza → rozpadają się całkowicie w
ciele, sugerując, że są one najbardziej
biokompatybilne [4],[5]
[1] E. Chang, E. Thekkek, W. W. Yu, V. L. Colvin, R. Drezek, Small, 2006,
2, 1412–1417, [2] A. M. Derfus, W. C. W. Chan, S.N. Bhatia, Nano Lett.
2004, 4, 11–18, [3] M. Tsoli, H. Kuhn, W. Brandau, H. Esche, G. Schmid,
Small, 2005, 1(8-9), 841-844, [4] R. Weissleder, D. Stark, B. L. Engelstad,
B. R. Bacon, C. C. Compton, D. L. White, P. Jacobs, J. Lewis, American
Journal of Roentgenology, 1989, 152, 167-173, [5] E. I. Altinoglu, T. J.
Russin, J. M. Kaiser, B. M. Barth, B. C. Eklund, M. Kester, J. H. Adair, ACS
Nano, 2008, [6] D. R. Cooper, J. L. Nadeau, Nanoscale, 2009
Nanocząstki CdSe z przyłączoną molekułą
biologiczną, specyficzną dla danego receptora:
• mogą być rozłożone do nanocząstek i biomolekuł
przed przyłączeniem się receptora. Takie CdSe
mogą uwalniać jony Cd2+, które są pochłaniane
przez komórkę.
• rozkład kompleksu może zachodzić wewnątrz
komórki, gdzie są uwalniane jony Cd2+
• jony Cd2+ i biologiczne cząsteczki mogą wchodzić
do jądra komórkowego [6]
• jony Cd2+ wiążą się z atomami siarki, tlenu i
wodoru zmieniając strukturę elementów komórki
• jony Cd2+ zaburzają obieg mikroelementów: Fe,
Cu, Mg, Ca, Se, Zn
6
Dlaczego nanocząstki ZnO i Fe2O3?
1. Niska toksyczność
33,6 mg/kg
Cd2+/mysz
1,9 g/kg
Zn2+/mysz
Zaleznosc smiertelnosci myszy od
dawki jonów Cd2+
Zaleznosc smiertelnosci myszy od
dawki jonów Zn2+
Jung D. Park et.al., Toxicology, 2001, 163, 93–100
2. Ciekawe właściwości optyczne nanocząstek ZnO i magnetyczne
nanocząstek Fe2O3
3. Bardzo wydajna, niedroga, „łatwa” i bezpieczna procedura
otrzymywania w koloidach
7
Właściwości luminescencyjne
Trap State
h
Pasmo walencyjne
Długość fali [nm]
Pasmo wzbronione
Pasmo przewodnictwa
e
Nanocząstki ZnO mają dwa pasma emisyjne:
- Wąskie pasmo emisji ekscytonowej przy
długości fali około 380 nm,
- Szerokie , intensywne pasmo przy długości fali
około 535 nm przypisane stanom defektowym
(trap state) np. luki tlenowe.
N. S. Norberg, D. R. Gamelin, J. Phys. Chem. B, 109, 2005, 20810-20816.
8
Dalszy wzrost nanocząstek ZnO w roztworach
0,6
7,0E+05
po syntezie
po 21 h
5,0E+05
po 45h
0,4
Emisja
po 672 h
0,3
0,2
po 100 min
po 21h
po 45h
4,0E+05
3,0E+05
2,0E+05
0,1
1,0E+05
0
300
350
400
450
500
0,0E+00
375
Długość fali [nm]
425
475
525
długość fali [nm]
575
Widma absorbancji i luminescencji nanocząstek ZnO otrzymanych z octanu cynku (1 mM)
oraz wody (407 mM) w temperaturze 35 °C w izopropanolu w zależności od czasu
przechowywania.
10
9,5
9
8,5
2R [nm]
Absorbancja
0,5
6,0E+05
Wykres zależności promienia nanocząstek
ZnO od czasu ich przechowywania w
temperaturze pokojowej.
8
7,5
7
6,5
6
5,5
5
0
10000
20000
30000
czas [min]
40000
50000
Synteza nanocząstek ZnO/MgO rdzeń/powłoka
Zn(OAc)2*2H2O
w alkoholu
Dodanie H2O lub NaOH
w alkoholu
(CH3COO)2Zn → 2CH3COO- + Zn2+
H2O ↔ H+ + OH- or NaOH → Na+ + OHZn2+ + 2OH- ↔ Zn(OH)2 ↔ ZnO + H2O
ZnO
Dodanie
Mg(OAc)2*4H2O
w alkoholu
i NaOH
ZnO
ZnO/MgO
rdzeń/powłoka
(CH3COO)2Mg → 2CH3COO- + Mg2+
NaOH → Na+ + OHMg2+ + 2OH- ↔ Mg(OH)2 ↔ MgO + H2O
10
Dlaczego powłoka MgO?
1. Doświadczalnie wykazano zapobieganie dalszego wzrostu nanocząstek ZnO [1] –
potwierdzenie B. Sikora
2. Jest nietoksyczna i biokompatybilna
3. Powoduje znaczny wzrost luminescencji pochodzącej od defektów rdzenia ZnO [1][2] i
wzrost luminescencji ekscytonowej rdzenia ZnO [2]
MgO
2,56 eV
ZnO
EC
EgMgO = 7,8 eV
EgZnO = 3,44 eV
Ev
-1,74 eV
Heterozłącze I rodzaju systemu
rdzeń/powłoka:
1). Minimum poziomu przewodnictwa powłoki ma
energię wyższą niż energia poziomu przewodnictwa
rdzenia
2). Maksimum poziomu walencyjnego powłoki ma
energię niższą niż energia poziomu walencyjnego
rdzenia
3). W tym systemie ekscyton jest ograniczony do
materiału rdzenia, powłoka pasywuje defekty
odpowiadające za przejścia niepromieniste na
powierzchni ZnO i przeciwdziała narażeniu ekscytonu
na środowisko zewnętrzne
[1] J. Lee, J. Bang, H. Yang, J. Phys. D: Appl. Phys. 2009, 42, 1-6, [2] X. Q. Meng, H. Peng, Y. Q. Gai, J. Li J. Phys. Chem. C,
11
2010, 114 (3), 1467–1471
Charakteryzacja nanocząstek ZnO/MgO
rdzeń/powłoka
Absorbancja
0,6
Wykresy zależności absorbancji i emisji
nanocząstek ZnO/MgO w wodzie w
zależności od czasu przechowywania
(stosunek Mg/Zn wynosi 37 %).
ZnO/MgO in H2O
ZnO/MgO 21 days in H2O
ZnO/MgO 42 days in H2O
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
300
350
400
450
500
550
długość fali [nm]
Luminescencja
2,E+06
600
Średnia średnica nanocząstek ZnO/MgO
core/shell wyznaczona z początku widm
absorbancji korzystając z przybliżenia
masy efektywnej.
ZnOMgO in H2O
ZnOMgO 21 days in H2O
1,E+06
t [dni]
ZnOMgO 42 days in H2O
rozpuszczone w
wodzie
8,E+05
2R [nm]
6,2
4,E+05
21
5,9
0,E+00
42
5,9
366
416
466
516
566
długość fali [nm]
12
Pomiar AFM
Pomiar TEM
Histogram
100
C ounts
80
60
40
20
0
1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0
2R [nm]
Pomiar X-Ray
ZnO /M gO
18000
Intensity (arb. units)
16000
002
101
100
14000
12000
0.9λ
t=
B cos θ
t – średnica cząstki (Å)
λ – długość fali (1,54 Å)
B – szerokość połówkowa
(radiany)
10000
8000
110
102 103200
6000
4000
2000
0
0
20
40
60
80
o
2θ ( )
100
120
2RX-ray
[nm]
2Ropt
[nm]
2RTEM
[nm]
2RAFM
[nm]
~7.9
~6.0
~5,5
~5,4
13
Ale po co to wszystko?
Trzy strategie budowania biosensorów:
1. Fluorescencyjny Rezonansowy Transfer Energii (FRET) między nanocząstką ZnO a
barwnikiem organicznym czułym na środowisko zewnętrzne
2. Biosensor optyczno – magnetyczny do wykrywania krótkich oligomerów β-amyloidu
(wczesne wykrywanie choroby Alzheimera)
3. FRET między nanocząstką ZnO pokrytą przeciwciałem a białkiem do którego zostaje
przyłączona
14
Ale po co to wszystko?
Trzy strategie budowania biosensorów:
1. Fluorescencyjny Rezonansowy Transfer Energii (FRET) między nanocząstką ZnO a
barwnikiem organicznym czułym na środowisko zewnętrzne
2. Biosensor optyczno – magnetyczny do wykrywania krótkich oligomerów β-amyloidu
(wczesne wykrywanie choroby Alzheimera)
3. FRET między nanocząstką ZnO pokrytą przeciwciałem a białkiem do którego zostaje
przyłączona
15
Pierwsza strategia budowania biosensorów
Fluorescencyjny Rezonansowy Transfer Energii (FRET) między nanocząstką ZnO a
barwnikiem organicznym czułym na środowisko zewnętrzne
FRET – Fluorescence Resonance Energy
Transfer
mechanizm przenoszenia energii między
dwoma chromoforami na drodze innej niż
promieniowanie.
Donor w stanie wzbudzonym może
przekazywać energię wzbudzenia akceptorowi
znajdującemu się w odległości nie większej niż
10 nm.
Obraz TEM i histogram wielkości ZnO/MgO
S. Rakshit et al., ACS Nano, vol. 2, no. 7, 2008, 1473-1479
Data: Count1_Count
Model: Gauss
Equation: y=y0 + (A/(w*sqrt(PI/2)))*exp(-2*((x-xc)/w)^2)
Weighting:
y
No weighting
Chi^2/DoF
= 22.43883
R^2
= 0.94944
liczba czastek
40
y0
xc
w
A
0.27333
5.26222
2.63185
150.47841
±2.61713
±0.11411
±0.29893
±20.78988
30
20
10
0
4
6
8
rozmiar czastek [nm]
10
16
FRET: nanocząstka ZnO/MgO rdzeń/powłoka
pokryta CMCD (donor) i Czerwień Nilu (akceptor)
Schemat syntezy nanocząstek
ZnO/MgO pokrytych karboksymetylobeta-cyklodekstryną.
β – cyklodekstryna
- składa się z 7 merów glukozowych
tworzących strukturę cykliczną
- wnętrze otworu – hydrofobowe
- całość cząsteczki - hydrofilowa
- tworzy kompleksy inkluzyjne typu „gość –
gospodarz” (funkcja gospodarza)
1). Zmiana rozpuszczalności
nanocząstek w wodzie (zwiększenie
hydrofilowości)
2). Nie zmienia absorpcji i emisji
nanocząstek ZnO/MgO
S. Rakshit et al., ACS Nano, vol. 2, no. 7, 2008, 1473-1479
17
1,0E+07
9,0E+06
ZnO/MgO/CMCD
0,16uM NR
0,40 uM N R
0,81 uM NR
1,6 uM NR
3,2 uM NR
6,4 uM NR
9,7 uM NR
13 uM NR
16 uM NR
19 uM NR
23 uM NR
26 uM NR
29 uM NR
32 uM NR
35 uM NR
39 uM NR
42 uM NR
45 uM NR
48 uM NR
8,0E+06
6,0E+06
5,0E+06
4,0E+06
3,0E+06
2,0E+06
FRET:
ZnO/MgO/CMCD
Æ Czerwień Nilu
1,0E+06
0,0E+00
420
470
520
570
620
670
długość fali [nm]
1,4E+06
ZnO/MgO/CMCD
3,2 uM NR
1,2E+06
0,060 g/l ZnO/MgO + Nile Red
ex: 356 nm
Tło
6,4 uM NR
9,7 uM NR
13 uM NR
16 uM NR
1,0E+06
luminescencja
luminescencja
7,0E+06
4 g/l ZnO/MgO/CMCD + Nile Red
ex: 356 nm
19 uM NR
23 uM NR
8,0E+05
26 uM NR
29 uM NR
32 uM NR
6,0E+05
35 uM NR
39 uM NR
42 uM NR
45 uM NR
4,0E+05
48 uM NR
2,0E+05
0,0E+00
420
470
520
570
dlugosc fali [nm]
620
67018
FRET: ZnO/MgO/CMCD i Czerwień Nilu
1
0,9
Q=
Wydajnosc RET
0,8
0,7
I ZnO − I ZnO − NR
I ZnO
r = 3,4 nm.
0,6
0,5
0,4
nR06
Q=
nR06 + r 6
0,3
0,2
0,1
exp
teor
0
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
Nile Red / ZnO/MgO
IZnO – intensywność luminescencji donora ZnO/MgO/CMCD w wodzie w przypadku braku Czerwieni Nilowej
IZnO-NR - intensywność luminescencji donora ZnO/MgO/CMCD w wodzie w obecności różnych stężeń Czerwieni Nilowej
(stężenie donora jest stałe)
r – odległość między donorem a akceptorem
R0 – krytyczna odległość (promień Forster’a), przy której transfer i spontaniczny zanik ekscytowanego donora są równie
prawdopodobne, kZnO-NR = τZnO-1.
19
Wpływ temperatury na wydajność FRET
0,6
45
Wydajnosć RET
0,5
45
45
45
20
0,4
20
20
0,3
20
20
0,2
Q=
I ZnO − I ZnO − NR
I ZnO
0,1
0
temperatura [0C]
Q – efektywność FRET
IZnO – intensywność ZnO/MgO/CMCD w danej temperaturze
IZnO-NR – intensywność ZnO w układzie ZnO/MgO/CMCD/NR
20
Wpływ temperatury na położenie piku
luminescencji Czerwieni Nilu
653
79 mg/l ZnO/MgO
20 g/l ZnO/MgO/CMCD
13uM Nile Red
652
λ
max
[nm]
651
650
649
648
647
646
645
644
15
20
25
30
35
40
temperatura [0C]
45
50
55
21
ZnO/MgO/CMCD/Czerwień Nilu w komórkach
HeLa
Pobudzenie 560 nm
Emisja 450 – 700 nm
Pobudzenie 488 nm
Autofluorescencja
Emisja 520 – 560 nm
Nalożenie
Skład:
20 g/l ZnO/MgO/CMCD
(w tym 79 mg/l ZnO/MgO) i
13 umol/l Czerwieni Nilowej w wodzie
Do komórek HeLa zostało
dodane 20 ul roztworu kompleksu
Inkubacja 48 h z lipofektaminą
22
ZnO/MgO/CMCD/Czerwień Nilu w komórkach
HeLa
yz
xz
23
Widma luminescencji
pobudzenie 560 nm w zależnosci od miejsca na/w
komórce HeLa
140
200
poza komórkami HeLa
160
luminescencja
100
luminescencja
w komórkach HeLa
180
120
80
60
40
140
120
100
80
60
40
20
20
0
0
500
550
600
650
700
750
800
500
550
600
dlugosc fali [nm]
0,045
na komórkach HeLa
750
800
750
800
komórki HeLa bez ZnO/MgO/CMCD/NR
0,04
0,8
0,035
0,7
luminescencja
luminescencja
700
dlugosc fali [nm]
1
0,9
650
0,6
0,03
0,025
0,5
0,4
0,02
0,015
0,3
0,01
0,2
0,005
0,1
0
0
500
550
600
650
700
dlugosc fali [nm]
750
800
500
550
600
650
700
dlugosc fali [nm]
24
Zestawienie
λ max ± SD
poza komórką
λ max ± SD
na komórce
λ max ± SD
w komórce
600 ± 3 nm
597 ± 9 nm
619 ± 3 nm
I max
poza komórką
I max
na komórce
I max
w komórce
23 – 120 arb. units
0,47 – 0,87 arb. units
54 – 167 arb. units
25
Widma luminescencji
pobudzenie 560 nm
Komórki bez ZnO/MgO/CMCD/NR
0,045
0,04
luminescencja
0,035
0,03
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
500
550
600
650
700
750
800
dlugosc fali [nm]
Autofluorescencja komórek
Pobudzenie 405 nm
26
ZnO/MgO/CMCD/Czerwień Nilu w komórkach
HeLa
Filtr pobudzający: 377 ± 25 nm
Filtr emisyjny: 593 ± 20 nm
FRET
Filtr pobudzający: 377 ± 25 nm
Filtr emisyjny: 536 ± 20 nm
ZnO + autofluorescencja
Filtr pobudzający: 377 ± 25 nm
Filtr emisyjny: red
FRET
Filtr pobudzający: 482 ± 17 nm
Filtr emisyjny: 536 ± 20 nm
autofluorescencja
27
ZnO/MgO/CMCD/Czerwień Nilu w komórkach
HeLa
Filtr pobudzający: 377 ± 25 nm
Filtr emisyjny: 593 ± 20 nm
28
ZnO/MgO/CMCD/Czerwień Nilu w komórkach
HeLa
Filtr pobudzający: 377 ± 25 nm
Filtr emisyjny: red
29
Komórki HeLa - kontrola
Filtr pobudzający: 377 ± 25 nm
Filtr emisyjny: 593 ± 20 nm
Filtr pobudzający: 377 ± 25 nm
Filtr emisyjny: red
Filtr pobudzający: 377 ± 25 nm
Filtr emisyjny: 536 ± 20 nm
Filtr pobudzający: 377 ± 25 nm
Filtr emisyjny: 692 ± 20 nm
30
Kolejny etap:
Zmiana sondy (Czerwień Nilu) na sondę czułą na
rodniki Æ znaczenie w chorobach
neurodegeneracyjnych
31
Ale po co to wszystko?
Trzy strategie budowania biosensorów:
1. Fluorescencyjny Rezonansowy Transfer Energii (FRET) między nanocząstką ZnO a
barwnikiem organicznym czułym na środowisko zewnętrzne
2. Biosensor optyczno – magnetyczny do wykrywania krótkich oligomerów β-amyloidu
(wczesne wykrywanie choroby Alzheimera)
3. FRET między nanocząstką ZnO pokrytą przeciwciałem a białkiem do którego zostaje
przyłączona
32
Druga strategia budowania biosensorów
Biosensor optyczno – magnetyczny do wykrywania krótkich oligomerów
β-amyloidu (wczesne wykrywanie choroby Alzheimera)
Cząsteczki
Analit
Przeciwciało do analitu
Nanocząstka ZnO (właściwości emisyjne)
Nanocząstka Fe2O3 (właściwości magnetyczne)
33
Druga strategia budowania biosensorów
Nanocząstki ZnO/MgO
Cząsteczki
Analit
Przeciwciało do analitu
Nanocząstka ZnO (właściwości emisyjne)
Nanocząstka Fe2O3 (właściwości magnetyczne)
34
Druga strategia budowania biosensorów
Cząsteczki
Analit
Przeciwciało do analitu
Nanocząstka ZnO (właściwości emisyjne)
Nanocząstka Fe2O3 (właściwości magnetyczne)
35
Druga strategia budowania biosensorów
Nanocząstki Fe2O3
Cząsteczki
Analit
Przeciwciało do analitu
Nanocząstka ZnO (właściwości emisyjne)
Nanocząstka Fe2O3 (właściwości magnetyczne)
36
Druga strategia budowania biosensorów
Cząsteczki
Analit
Przeciwciało do analitu
Nanocząstka ZnO (właściwości emisyjne)
Nanocząstka Fe2O3 (właściwości magnetyczne)
37
Druga strategia budowania biosensorów
Magnes
Cząsteczki
Analit
Przeciwciało do analitu
Nanocząstka ZnO (właściwości emisyjne)
Nanocząstka Fe2O3 (właściwości magnetyczne)
38
Druga strategia budowania biosensorów
Detekcja luminescencji nanocząstek ZnO/MgO
Magnes
Cząsteczki
Analit
Przeciwciało do analitu
Nanocząstka ZnO (właściwości emisyjne)
Nanocząstka Fe2O3 (właściwości magnetyczne)
Zalety:
-) możliwość wykonywania
testów w warunkach polowych
-) nie potrzebny jest
wysublimowany sprzęt
laboratoryjny
39
Nanocząstki Fe2O3
Właściwości strukturalne
Potwierdzenie romboedrycznej struktury Fe2O3 (hematyt)
Pomiar X-Ray
przed wygrzewaniem
o
Fe2O 3 (po wygrzaniu w 400 C)
1,0
0,9
Intensity [a.u.]
Pomiar TEM
0,8
0,7
104
0,6
012
0,5
110
113
024 116
214
300
122
0,4
0,3
0,2
0
20
40
60
80
2 θ [o ]
100
2R TEM [nm]
~2,8
120
140
2R x-Ray [nm]
2R x-Ray [nm]
(przed wypaleniem)
(po wypaleniu)
~ 2,5
~ 37,5
40
Nanocząstki Fe2O3
Właściwości magnetyczne
Temperaturowa zależność
magnetyzacji ZFC-FC
zmierzona dla kropek
kwantowych Fe2O3 w polu
magnetycznym o wartości
10 Oe.
Μ(emu/g)
Nadprzewodnikowy interferometr kwantowy (SQUID)
1,0x10
-3
9,0x10
-4
8,0x10
-4
7,0x10
-4
6,0x10
-4
5,0x10
-4
4,0x10
-4
3,0x10
-4
2,0x10
-4
1,0x10
-4
0,0
ZFC
FC
ZFC – schładzanie próbki w zerowym polu
magnetycznym
FC – schładzanie próbki w polu magnetycznym
0
50
T (K )
100
150
Powyżej TBmax (temperatura blokowania) cząstki wykazują zachowanie
superparamagnetyczne, czego przejawem jest superpozycja krzywych ZFC i FC
oraz spadek wartości magnetyzacji w miarę wzrostu temperatury
41
Nanocząstki Fe2O3
Właściwości magnetyczne
Nanocząstki przed wygrzaniem
(2R = 2,5 nm)
Nanocząstki Fe2O3 po wygrzaniu
(2R = 37,5 nm)
Kolejny etap: Pokrywanie nanocząstek ZnO/MgO i Fe2O3 związkami organicznymi w
celu przyłączenia przeciwciał do oligomerów β-amyloidu
42
Ale po co to wszystko?
Trzy strategie budowania biosensorów:
1. Fluorescencyjny Rezonansowy Transfer Energii (FRET) między nanocząstką ZnO a
barwnikiem organicznym czułym na środowisko zewnętrzne
2. Biosensor optyczno – magnetyczny do wykrywania krótkich oligomerów β-amyloidu
(wczesne wykrywanie choroby Alzheimera)
3. FRET między nanocząstką ZnO pokrytą przeciwciałem a białkiem do którego zostaje
przyłączona
• pokrycie nanocząstek ZnO/MgO związkami organicznymi zakończonymi grupami
karboksylowymi (-COOH), np. kwas oleinowy
• przyłączenie przeciwciała specyficznego do danego miejsca w komórce bez denaturacji
białka
43
Ale po co to wszystko?
Trzy strategie budowania biosensorów:
1. Fluorescencyjny Rezonansowy Transfer Energii (FRET) między nanocząstką ZnO a
barwnikiem organicznym czułym na środowisko zewnętrzne
2. Biosensor optyczno – magnetyczny do wykrywania krótkich oligomerów β-amyloidu
(wczesne wykrywanie choroby Alzheimera)
3. FRET między nanocząstką ZnO pokrytą przeciwciałem a białkiem do którego zostaje
przyłączona
4. FRET między nanocząstką NaYF4: Er, Yb wykazującą właściwości „upconvertujące” pokrytą
przeciwciałem a białkiem do którego zostaje przyłączona lub barwnikiem przyczepionym do
jej powierzchni
44
Upkonwersja
1. Upkonwersja opisuje konwersję promieniowania o niskiej energii (bliska podczerwień) do
wyższego energetycznie promieniowania (widzialnego Er oraz ultrafioletu Gd) przez
multifotonową absorpcję i późniejszą luminescencję.
2. Większość biologicznych struktur absorbuje światło w paśmie widzialnym i ultrafioletowym.
Bliska podczerwień (długość fali 700 – 1000 nm) jest mało absorbowana przez molekuły
biologiczne.
3. Układy biologiczne pobudzane bliską podczerwienią wykazują także mniej autofluorescencji
niż pobudzane promieniowaniem ultrafioletowym.
4. Emisja w świetle widzialnym pozwala obserwować procesy życiowe wewnątrz komórek, a
emisja w świetle UV pozwala na selektywne uśmiercanie komórek rakowych.
45
Mechanizm upkonwersji z transferem energii
(ang. Energy transfer upconversion ETU)
F. Wang, X. Liu, Chem. Soc. Rev, 2009, 38, 976-989
2H
7/2
2H
11/2
4S
3/2
4F
9/2
4I
9/2
4I
11/2
655 nm
520 nm
Yb 3+
540 nm
2F
5/2
980 nm
Mechanizm jest oparty na
sekwencyjnej absorpcji dwóch
fotonów powodującej obsadzenie
wyższego poziomu.
Pobudzenie odbywa się przez
transfer energii między dwoma
sąsiadującymi jonami ziem rzadkich
(między iterbem a erbem). Jeden
jon działa jako absorber (donor
energii) - iterb a drugi jako
aktywator (akceptor energii) – erb.
Aktywator jest pobudzany do stanu
wyższego przez pierwszy
niepromienisty transfer energii
podczas gdy absorber relaksuje do
stanu podstawowego. Drugie
pobudzenie aktywatora i kolejny
transfer energii umożliwia
powstanie stanu emitującego.
4I
13/2
4I
15/2
2F
7/2
Er 3+
46
Mechanizm upkonwersji z transferem energii
(ang. Energy transfer upconversion ETU)
ET – Energy Transfer
EBT – Energy Back
Transfer
Mechanizm:
-) Transfer energii między erbem (aktywator) a gadolinem (aktywator) (ET1 i ET2)
-) Transfer energii między iterbem (absorber) a gadolinem (aktywator)
-) Obserwujemy luminescencję przy dlugosci fali 246 nm, 252 nm, 276 nm, 311 nm
G. Chen, H. Liang, H. Liu, G. Somesfalean, Z. Zhang, Optics Express, 2009, vol. 17, No. 19, 16366-16371.
47
Dlaczego NaYF4?
Wydajność upkonwersji zależy od:
-) stężenia absorbera i aktywatora (stężenia domieszek, co determinuje odległość między
sąsiadującymi jonami domieszkowymi)
-) struktury krystalicznej kryształu matrycowego
-) wielkości nanocząstek (im większa średnica tym większa intensywność emisji) – ze względu
na mniejszy stosunek powierzchni do objętości. Na powierzchni nanocząstki atomy metali
ziem rzadkich nie wykazują właściwości upkonwertujących.
Kryształ matrycowy powinien mieć sieć krystaliczną dopasowaną do jonów domieszkowych i
niską energię fononową, aby zminimalizować niepromieniste procesy relaksacji. Te
wymagania spełniają fluorki.
48
Synteza nanocząstek NaYF4: Er, Yb, Gd
(1-0,02-x) mmol Y2O3
x mmol Yb2O3
0,02 mmol Er2O3
Y2O3 + 6HNO3 → 2Y(NO3)3 + 3H2O
+ 10 ml 10 % HNO3
Yb2O3 + 6HNO3 → 2Yb(NO3)3 + 3H2O
(ogrzewanie w celu usunięcia wody)
Er2O3 + 6HNO3 → 2Er(NO3)3 + 3H2O
4 mmol NH4F
w glikolu etylenowym 80 °C
Y(NO3)3, Yb(NO3)3, Er(NO3)3
+ 10 ml glikolu etylenowego
+ 0,5560 g PVP + 1mmol NaCl,
ogrzewanie 80 °C
Reakcja: 2 h, 160 °C
NaYF4: xYb, 0,02Er / PVP
Na+ + (1 – 0,02 – x)Y3+ + xYb3+ + 0,02Er3+ + 4F- → NaYF4: xYb, 0,02 Er
X. Li, Y. Zhang, Angew. Chem. Int. Ed, 2006, 45, 7732-7735
49
Pokrywanie nanocząstek NaYF4: Er, Yb, Gd warstwą
SiO2
NaYF4: xYb, 0,02Er / PVP
0,06 ml tetraetoksysilan (TEOS)
w 10 ml etanolu
Do 20 ml etanolowego roztworu
nanocząstek (0,05 mmol) dodano 4 ml H2O i
0,5 ml 30 % amoniaku
Reakcja: ~ 15h, 25 °C
NaYF4: xYb, 0,02Er / SiO2
Hydroliza TEOS w obecności wodorotlenku amonu jako katalizatora
O
O Si O Si
OEt
EtO Si OEt
OEt
TEOS
NH4OH
-EtOH
OH
HO Si OH
-H2O
OH
Kwas monosilanowy
X. Li, Y. Zhang, Angew. Chem. Int. Ed, 2006, 45, 7732-7735
OH
OH
HO Si O Si OH
OH
O
O
Si O Si
OH
Kwas disilanowy
SiO2
50
Luminescencja nanocząstek NaYF4: Er, Yb, Gd
7,0E+03
6,0E+03
luminescencja
5,0E+03
10,9 g/l NaYF4/PVP
10,8 g/l NaYF4: 10% Yb, 2 % Er /PVP
10,1 g/l NaYF4: 18% Yb, 2 % Er /PVP
10,8 g/l NaYF4: 30% Yb, 2 % Er /PVP
11,4 g/l NaYF4: 20% Yb, 2 % Er, 5 % Gd /PVP
4,0E+03
Długość fali pobudzania: 980 nm
3,0E+03
2,0E+03
1,0E+03
0,0E+00
500
550
600
długość fali [nm ]
650
700
Próbka
Stosunek powierzchni pod
pikiem 660 nm do 540 nm
(średnia 3 pomiarów)
2 % Er, 10 % Yb
6,4
2 % Er, 18 % Yb
5,9
2 % Er, 30 % Yb
11,4
20 % Yb, 2% Er, 5 % Gd
7,4
Wielkość i struktura nanocząstek NaYF4: Er, Yb, Gd
1,4E+05
111
NaYF4:
NaYF4:
NaYF4:
NaYF4:
NaYF4
1,2E+05
Intensywność
1,0E+05
8,0E+04
2 % Er,
2 % Er,
2 % Er,
2 % Er,
/ PVP
30
20
18
10
%
%
%
%
Yb /
Yb /
Yb /
Yb /
PVP
PVP
PVP
PVP
220
6,0E+04
31
1
200
4,0E+04
2,0E+04
222
0,0E+00
10
30
50
420
400 311 422
70
90
o
2 theta [ ]
Dyfrakcja rentgenowska –
potwierdzenie kubicznej struktury
511
440 531 600
110
130
150
Próbka NaYF4
Średnica
[nm]
0 % Er, 0 % Yb
~30
2 % Er, 10 % Yb
~30
2 % Er, 18 % Yb
~30
2 % Er, 20 % Yb
~36
2 % Er, 30 % Yb
~28
20 % Yb, 2 % Er, 5 % Gd
~32
Wielkość i struktura nanocząstek NaYF4: Er, Yb, Gd
Transmisyjny Mikroskop Elektronowy
Obraz nanocząstek NaYF4: 30 % Yb, 2 % Er / PVP
Potwierdzenie kubicznej struktury
Otoczka SiO2
Próbka NaYF4
Średnica [nm]
0 % Er, 0 % Yb
~35
2 % Er, 10 % Yb
~45
2 % Er, 18 % Yb
~45
2 % Er, 20 % Yb
~55
2 % Er, 30 % Yb
~35
20 % Yb, 2 % Er, 5 % Gd
~50
Nanocząstki NaYF4: Er, Yb, Gd wewnątrz komórek
HeLa
Kolor zielony: autofluorescencja (pobudzenie 488 nm),
Kolor czerwony: nanocząstki (pobudzenie 960 nm)
1,2
5
6
1
2
3
1
2
3
4
lu m in e s c e n c ja
7
1
0,8
4
0,6
6
5
7
0,4
0,2
0
480
530
580
630
680
dlugosc fali [nm]
54
Nanocząstki NaYF4: Er, Yb, Gd wewnątrz komórek
HeLa
Kolor zielony: autofluorescencja (pobudzenie 488 nm),
Kolor czerwony: nanocząstki (pobudzenie 960 nm)
xz
yz
55
Kolejny etap:
Pokrycie nanocząstek NaYF4 warstwą organiczną w
celu przyłączenia białka lub barwnika organicznego
czułego na środowisko
56
Podsumowanie
1. Nanocząstki ZnO/MgO/CMCD użyto do zbudowania biosensora czułego na
środowisko zewnętrzne dzięki fluorescencyjnemu rezonansowemu transferowi
energii między nanocząstkami ZnO/MgO (donor) a Czerwienią Nilu (akceptor)
ulokowaną wewnątrz cyklodekstryny
2. Nanocząstki ZnO/MgO/CMCD/Czerwień Nilu zostały wprowadzone do komórek
nowotworowych HeLa i zaobserwowano zmianę luminescencji Czerwieni Nilu w
zależności od miejsca ulokowania w/na/obok komórkach HeLa.
3. Prawdopodobnie zaobserwowano FRET wewnątrz komórek HeLa.
4. Utworzono nanocząstki Fe2O3 wykazujące właściwości superparamegnetyczne
w temperaturze pokojowej w celu użycia ich razem z nanocząstkami ZnO/MgO do
budowy biosensora do wykrywania krótkich oligomerów β - amyloidu (znaczenie
w chorobie Alzheimera)
5. Zsyntetyzowano i scharakteryzowano nanocząstki NaYF4: Er, Yb, Gd
wykazujące właściwości upkonwertujące i wprowadzono je do wnętrza komórek
HeLa.
57
Podziękowanie
Zespól Fizyki Biologicznej
Prof. Danek Elbaum
Dr Krzysztof Fronc
Instytut Fizyki PAN
Mgr Anna
Baranowska - Korczyc
Mgr Izabela Kamińska
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN
Mgr Kamil Sobczak – pomiary TEM
Mgr Piotr Dziawa – pomiary SQUID
Dr Roman Minikayev – pomiary X-ray
Prof. Wojciech Paszkowicz – pomiary X-ray
Wydział Fizyki UAM
Sebastian Szewczyk – synteza NaYF4: Er, Yb
Kamil Koper – wprowadzanie cząstek do komórek
Prof. Piotr Stępień
Instytut Podstawowych Problemów Techniki PAN
Dr Piotr Krakowian – mikroskop konfokalny
Prof. Tomasz Kowalewski
Dr Sławek Błoński, Mgr Krzysztof Zembrzycki –
pomoc
Instytut Biologii Doświadczalnej PAN
Prof. Grzegorz Wilczyński – mikroskop konfokalny
Dr Jakub Wlodarczyk – mikroskop konfokalny
58
Wpływ temperatury na intensywność
luminescencji w układzie ZnO/MgO/CMCD i
Czerwień Nilu
6,0E+06
Nile Red w FRET
20
ZnO w FRET
5,0E+06
ZnO/MgO/CMCD
20
20
20
20
Intensywność
4,0E+06
ZnO/MgO
20
3,0E+06
2,0E+06
1,0E+06
45
45
45
45
45
45
0,0E+00
temperatura [0C]
∆intNRwFRET
∆intZnOwFRET
∆intZnO/MgO/CMCD
∆intZnO/MgO/CMCD
2,3*10-6
1,0*10-6
1,3*10-6
1,4*10-6
59
FRET: ZnO/MgO/CMCD i Czerwień Nilu
Równanie Fostera pozwala na określanie odległości między donorem a akceptorem, dlatego
też jest używane przez chemików jako „elektroniczna suwmiarka”
Przyjmując założenia:
1). Donor oddziałuje z wieloma akceptorami
2). Transfer energii do każdego z akceptorów można rozważać jako niezależne zdarzenie
to wydajność transferu energii może być wyrażona równaniem:
nR06
Q= 6 6
nR0 + r
n – liczba molekuł akceptora
Dla układu ZnO/MgO/CMCD Æ Czerwień Nilowa R0 = 3,4 nm [1]
Wartość r, odległość donora od akceptora w układzie ZnO/MgO/CMCD Æ Czerwień
Nilowa, może być wyznaczona przez dopasowanie powyższego równania do
eksperymentalnie obserwowanych zależności między wydajnością rezonansowego
transferu energii a stężeniem akceptora
[1] S. Raksshit, S. Vasudevan, ACS Nano,
2008, 2(7), 1473 – 1479
60
FRET: ZnO/MgO/CMCD i Czerwień Nilu
Wydajność rezonansowego transferu energii:
I −I
Q = ZnO ZnO − NR
I ZnO
IZnO – intensywność luminescencji donora
ZnO/MgO/CMCD w wodzie w przypadku braku
Czerwieni Nilowej
IZnO-NR - intensywność luminescencji donora
ZnO/MgO/CMCD w wodzie w obecności różnych
stężeń Czerwieni Nilowej (stężenie donora jest stałe)
9000(ln 10)κ 2γ D0
R0 =
J (λ )
5
4
128π N Aη
κ2 – czynnik orientacyjny, który wynosi 2/3 dla
losowo zorientowanych dipoli donor – akceptor,
γD0 – wydajność kwantowa donora w
nieobecności akceptora
NA – liczba Avogadro
η - współczynnik załamania światła
k ZnO − NR
R06
Q=
= 6 6
−1
k ZnO − NR + τ ZnO
R0 + r
τZnO – czas zaniku emisji donora ZnO/MgO w
nieobecności Czerwieni Nilowej
kZNO-NR – stała szybkości emisji donora
ZnO/MgO/CMCD w obecności akceptora Czerwieni
Nilowej
r – odległość między donorem a akceptorem
R0 – krytyczna odległość (promień Forster’a), przy
której transfer i spontaniczny zanik ekscytowanego
donora są równie prawdopodobne, kZnO-NR = τZnO-1.
∞
J (λ ) = ∫ I D (λ )ε A (λ )λ4 dλ
0
J(λ) – spektralne nałożenie emisji donora i
absorpcji akceptora:
S. Rakshit et al., ACS Nano, vol. 2, no. 7, 2008,
1473-1479
61
Toksyczność krótkich oligomerów β-amyloidu
Zaobserwowano, po przebadaniu surowicy 20 pacjentów z Chorobą Alzheimera (AD) i 18
pacjentów zdrowych, zwiększoną ilość oligomerów i krótkich włókien amyloidowych w
obecności surowicy z AD w porównaniu do populacji kontrolnej. Ma to potencjalna wartość
diagnostyczną.
Nowicka, et.al., JAD, 2010
62
Struktura Czerwieni Nilu
63