Wprowadzenie do cytometrii \(3\) [tryb zgodności]

Fakultet: Cytometria – zastosowanie w
badaniach biologicznych
Wprowadzenie do cytometrii
przepływowej:
zasady projektowania doświadczeń
Nadzieja Drela
Zakład Immunologii WB UW
[email protected]
Przygotowanie prób do analizy w
cytometrze przepływowym
1. Komórki z hodowli in vitro
2. Komórki izolowane z tkanek
limfoidalnych
3. Komórki z innych tkanek niż
limfoidalne
4. Izolowanie komórek z krwi
obwodowej
Gotowe procedury
http://www.bdbiosciences.com/resources/flowcytometry/index.jsp
http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/index.jsp
http://www.ebioscience.com/media/pdf/best-protocols/cellpreparation-for-flow-cytometry.pdf
http://www.abdserotec.com/resources/flow-cytometryebook/common-protocols/methods.html
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-andServices/Applications/Cell-Analysis/Flow-Cytometry/SamplePreparation-Assays-for-Flow-Cytometry.html
http://www.biolegend.com/isotype-controls-5327/
Wybór procedury
Wpływ trawienia enzymatycznego na
żywotność komórek
http://www.ebioscience.com/catalog/product/gallery/id/9840/
Kontrola negatywna
Kontrola izotypowa
Czynniki wpływające na poziom fluorescencji przeciwciał
swoistych:
1. Wiązanie przez receptory komórkowe (dla fragmentu
Fc przeciwciał)
2. Nieswoiste interakcje białek z białkami, lipidami i
węglowodanami
3. Autofluorescencja
Wybór właściwej kontroli izotypowej
1. Zidentyfikować izotyp przeciwciała użytego do
znakowania specyficznego
2. Wybrać przeciwciało do kontroli izotypowej: gatunek
(mysz, szczur, chomik, koza itp.), izotyp (IgG1, IgG2a,
IgG2b...) i fluorochrom sprzężony z tym
przeciwciałem
3. Zastosować takie stężenie p-ciała izotypowego jak
specyficznego
Rekomendowane kontrole
Fluorescence Minus One (FMO)
Fluorescence Minus One (FMO)
A
B
Fluorescence Minus One (FMO)
Tube #
Description
FL1
CD3 FITC
FL2
FL3
1
Experimental Sample
CD4 PE CD8 Cy5PE
2
3
4
Compenstaion Controls CD3 FITC
(Single stains – one for
each fluorochrome
used in the
experiment)
CD4 PE
5
6
7
Gating Controls (FMO –
-*
leave out one
CD3 FITC
fluorochrome at a
CD3 FITC
time)
CD4 PE CD8 Cy5PE
CD8 Cy5PE
CD4 PE
-
8
9
10
Experimental Controls
(fully stain healthy or
untreated samples to
compare to
experimental sample)
CD3 FITC
CD3 FITC
CD3 FITC
CD4 PE CD8 Cy5PE
CD4 PE CD8 Cy5PE
CD4 PE CD8 Cy5PE
CD8 Cy5PE
-
* no stain added or add isotype matched control stain.
3 ważne decyzje przy znakowaniu markerów
wewnątrzkomórkowych
1. Wybór buforu do permeabilizacji (antygeny
cytoplazmatyczne, antygeny jądrowe)
2. Wybór kontroli negatywnych
3. Miareczkowanie przeciwciał przeciwko markerom
wewnątrzkomórkowym (zbyt duże stężenie p-ciał
nasila tło fluorescencji i utrudnia wyróżnienie
populacji komórek pozytywnych)
Wybór kontroli negatywnych
Komórki niestymulowane jako kontrola negatywna
http://info.ebioscience.com/bid/68300/3-Choices-to-Make-Before-Intracellular-Staining
Niestymulowana vs stymulowana
http://info.ebioscience.com/bid/68300/3-Choices-to-Make-Before-Intracellular-Staining
Obrazowanie danych i analiza
Obrazowanie wyników
• Linear Scaling
• Log Scaling
• Biexponential Scaling
Skala liniowa vs.
vs. log
Wartości negatywne
Wynik poza skalą
Skala bieksponencjalna
•
•
•
Połączenie skali logarytmicznej i liniowej
Umożliwia wyróżnienie elementów/komórek na
granicy detekcji fluorescencji
Umożliwia rozróżnienie populacji rozproszonej,
słabo wyznakowanej lub o bardzo ałabej
ekspresji markera
Log vs. Biexponential Scaling
log scaling
biexponential scaling
Log vs. Biexponential Scaling
log scaling
biexponential scaling
Log vs. Biexponential Scaling
log scaling
biexponential scaling
Analiza 11-; 2
2-- i wieloparametrowa
Analiza 1 parametrowa
Ctrl
isot. c
ASM
21.37%
1.44%
43.35%
isot. c
Ctrl
ASM
CD127
Analiza 2 parametrowa
CD4
Intact
UL = 14.29%
UR = 78.02%
LL = 1.89%
LR = 5.80%
PBS
UL = 16.74%
UR = 70.10%
LL = 1.86%
LR = 11.30%
UL = 13.68%
UR = 76.24%
LL = 1.85%
LR = 8.23%
ASM
UL = 28.53%
UR = 53.90%
LL = 2.35%
LR = 15.22%
Drela N., Żeśko I. Immunopharmacol.Immunotoxicol. 2003,25:101
CD8
Analiza 3 parametrowa
ASM
CD4
Ctrl
R2
R2
CD25
CD8
4.52%
5.82%
CD4
Analiza 3 parametrowa…i więcej
A Young
B
Old
CD8
R2
R2
CD4
CD25
3.61%
5.48%
CD4
Analiza 1 parametrowa…po przejściach: pomiar
aktywności supresorowej limfocytów nTreg
B
7.00 – 8.00 a.m.
7.00 – 8.00 p.m.
48,49%
16,11%
With nTreg
With nTreg
59,26%
Without
nTreg
Without
nTreg
Contr
1,71%
0
20
40
60
80
59,14%
Contr
0,43%
0
20
40
60
80
Przechowywanie wyznakowanych
komórek
Podstawowe zasady przechowywania prób
1. W lodówce: 4 stopnie C, w ciemności (pamiętać o
biologicznej aktywności komórek np. fagocytozie)
2. Utrwalone do 3 dni
3. Zasady zależne od rodzaju komórek, ich traktowania
(permeabilizacja), fluorochromów, badanego
procesu (apoptoza, zmiany potencjału błonowego)
4. O ile to możliwe: analiza tuż po wyznakowaniu
komórek
FAQ
http://www.ebioscience.com/resources/faq/flow-cytometry-faq.htm
http://www.flow-cytometry.us/index.php?page=stability
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Tutorials.html
http://www.protocol-online.org/forums/forum/46-flow-cytometry/
Dziękuję za uwagę