Zak³ócenie homeostazy oksydacyjnej hepatocytów spowodowane

Zak³ócenie homeostazy oksydacyjnej hepatocytów
spowodowane teofilin¹ i glukoz¹, obecnymi
w preparacie Theophyllinum – badania in vitro
Nr 7-8/2007
Interference in oxidative homeostasis in hepatocytes, induced by theophylline
and glucose contained in drug named Theophyllinum – in vitro assay
Dr n. med. Ma³gorzata Stec1, dr n. med. Stefan Gawe³2, mgr farm. Cezary Wiœniewski1,
prof. dr hab. Maria Wardas1
1
Katedra i Zak³ad ¯ywnoœci i ¯ywienia, Wydzia³ Farmaceutyczny Œl¹skiej Akademii Medycznej,
ul. Jagielloñska 4, 41-200 Sosnowiec;
2
Wojewódzki Szpital Specjalistyczny Nr 5 im. Œw. Barbary, ul. 3-Maja 33, 41-200 Sosnowiec
Kierownik Katedry: prof. dr hab. Maria Wardas
Streszczenie
Teofilina jest lekiem rozszerzającym oskrzela i stymulującym oddychanie, skutecznym w leczeniu astmy ostrej i przewlekłej, bezdechów noworodków,
przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc (POChP)
i innych chorobach dolnych dróg oddechowych. Jest
ona stosowana pomocniczo w leczeniu zastoinowej
niewydolności serca i obrzęku ostrym. Podana dożylnie jest skuteczna w leczeniu stanów ostrych.
Stężenie teofiliny w surowicy pomiędzy 10 a 20
mikrogramów/ml stabilizuje nadmiernie aktywne
drogi oddechowe, charakterystyczne dla astmy.
Celem pracy była ocena zmian aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glutationowej (GPx) i reduktazy glutationowej (GR) hepatocytów inkubowanych w podłożu Hepatocyte Medium z preparatem Theophyllinum (do wlewu dożylnego, zawierającego rozpuszczoną glukozę) lub
z glukozą. Badania przeprowadzono na hepatocytach, izolowanych z wątrób szczurów metodą enzymatyczną z użyciem kolagenazy. Zaobserwowane
zmiany aktywności oznaczanych enzymów zależały
od stężenia preparatu Theophyllinum i od stężenia
glukozy oraz od czasu trwania inkubowania. Zwiększone aktywności oznaczonych enzymów w hepatocytach były wynikiem obrony przeciw stresowi
oksydacyjnemu, wywołanemu w komórkach przez
teofilinę i glukozę.
Abstract
Theophylline is a bronchodilator and respiratory
stimulant that is effective in treatment of acute and
chronic asthma, apnea/bradycardia episodes in
newborns, chronic obstructive lung disease
(COPD) and in other lower airways diseases. It is
also used as an adjunct in the treatment of
congestive heart failure and acute oedema.
Intravenous is appropriates for acute therapy. Serum
theophylline concentrations between 10 and 20
micrograms/ml stabilise the hyperactive airways
that characterise asthma. The aim of this works was
estimation of changes in activity of superoxide
dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and
glutathione reductase (GR) in hepatocytes
incubated in Hepatocyte Medium with drug, which
was Theophyllinum (for intravenous infusion; it
contains diluting glucose) or with glucose. The
studies were realised on hepatocytes isolated from
the rat livers by the enzymatic method with
collagenase. The observed changes of activity assayed
enzymes were dependent on concentration of the
Theophylline or concentration of glucose and on
incubation time also. The highest activities assayed
enzymes into hepatocytes were the result of defence
against oxidative stress induced by teophylline and
glucose into cells.
S³owa kluczowe:
Theophyllinum, glukoza, hepatocyty, dysmutaza
ponadtlenkowa, peroksydaza glutationowa, reduktaza glutationowa
Key words:
Theophylline, glucose, hepatocytes, Superoxide
Dismutase, Glutathione Peroxidase, Glutathione
Reductase
"
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
Nr 7-8/2007
Wstêp
Preparaty teofiliny są lekami stosowanymi u chorych na astmę o ciężkim przebiegu z koniecznością
hospitalizacji i wentylacji mechanicznej, w chorobach
przebiegających z hipowentylacją (między innymi
bezdechy noworodków [1]), w zespole bezdechu nocnego [2, 3], w przypadku astmy z przewagą napadów nocnych, a także w łagodnych postaciach astmy,
w przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc (POChP),
w przewlekłym zapaleniu oskrzeli oraz rozedmie płuc
[4,5,6,7,8]. Preparaty teofiliny działają głównie rozkurczająco na mięśnie gładkie oskrzeli i przeciwzapalnie na układ oddechowy. Korzystne działanie teofiliny w astmie polega na pobudzaniu oddychania,
zwiększeniu kurczliwości przepony i poprawie oczyszczania śluzowo-rzęskowego [9]. Jako nieselektywny
inhibitor fosfodiesterazy oraz antagonista receptorów
adenozynowych rozkurcza mięśnie gładkie dróg oddechowych [4], zmniejsza przepuszczalność naczyń
i poprawia przepływ nerkowy [10]. Wykazano też jej
korzystny wpływ na wymianę gazową w płucach, zwiększenie ciśnienia cząstkowego tlenu, zmniejszenie ciśnienia dwutlenku węgla i zwiększenie utlenowania
krwi tętniczej, zwłaszcza u chorych z zaawansowanymi zmianami obturacyjnymi [4], a także zmniejszenie dobowej zmienności pojemności wydechowej
pierwszosekundowej (FEV1) [4,11]. Poza bezpośrednim działaniem rozkurczającym na mięśnie gładkie
układu oddechowego, w małych stężeniach (5-10mg/
dm3) teofilina działa także przeciwzapalnie i immunomodulujaco [4,11,12]. Optymalne działanie lecznicze, z możliwym do przyjęcia ryzykiem działań niepożądanych, występuje przy stężeniu teofiliny w osoczu krwi wynoszącym 10-20 mg/dm3. Jednym ze stosowanych w lecznictwie preparatów teofiliny jest jej
roztwór do wlewu dożylnego pod nazwą Theophyllinum, w którym substancją dodatkową jest glukoza.
Celem pracy była ocena wpływu preparatu Theophyllinum oraz zawartej w nim glukozy, o stężeniu identycznym jak w preparacie Theophyllinum, na homeostazę oksydacyjną hepatocytów. Założony cel realizowano poprzez ocenę zmian aktywności dysmutazy
ponadtlenkowej, peroksydazy glutationowej i reduktazy glutationowej w hepatocytach inkubowanych in
vitro w obecności glukozy i preparatu Theophyllinum.
Materia³ i metody
Badania przeprowadzono na hepatocytach izolowanych metodą enzymatyczną [13] z wątrób trzymiesięcznych szczurów szczepu Wistar, pochodzących
z Centralnej Zwierzętarni Śląskiej Akademii Medycznej. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Śro-
Zak³ócenie homeostazy oksydacyjnej hepatocytów...
dowiskowej Komisji Bioetycznej. Żywotność komórek oceniono po ich wybarwieniu błękitem trypanu
i zliczeniu pod mikroskopem o komorze hematologicznej typu Fuchs-Rosenthal [14]. Do dalszych badań przeznaczono preparaty zawierające nie mniej niż
95% żywych komórek. Następnie hepatocyty inkubowano w podłożu „Hepatocyte Medium” (Sigma) z dodatkiem preparatu Theophyllinum – roztwór do wlewu dożylnego (Baxter Terpol Sp. z o.o.) o stężeniach
teofiliny 12,0mg/dm3 lub 20,0mg/dm3 podłoża oraz
z dodatkiem glukozy o stężeniach 540mg/dm3 lub
900mg/dm3 podłoża. Próbami kontrolnymi były hepatocyty inkubowane w podłożu z dodatkiem 0,9%
NaCl. Próby inkubowano w inkubatorze (typ BB-16,
firmy Heraeus) w atmosferze 5% CO2, w temperaturze 37oC. Czas inkubowania wynosił: 30, 60, 120
i 180 minut. Po odpowiednim czasie inkubowania
w homogenatach komórkowych oznaczono aktywność
dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glutationowej (GPx) i reduktazy glutationowej (GR) oraz
stężenie białka. Oznaczenia enzymatyczne wykonano
w termostatowanej kuwecie (w temp. 37o) na spektrofotometrze UV-VIS (Unicam) z wykorzystaniem
zestawów testowych firmy Randox, w których oznaczanie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej jest
oparte o metodę opisaną przez Beauchamp’a i Fridovich’a [15], aktywności peroksydazy glutationowej jest
oparte o metodę opisaną przez Paglia i Valentine [16],
a reduktazy glutationowej o metodę Goldberg’a i Sponer’a [17]. Stężenie białka w próbach oznaczano zmodyfikowaną metodą Lowry [18]. Oznaczone aktywności enzymów przeliczono na gram białka komórkowego.
Analiza statystyczna
Obliczenia statystyczne wykonano używając komputer z procesorem Intel Celeron D315 2,4GHz. Bazę
danych wyników utworzono w arkuszu kalkulacyjnym
Microsoft Excel, a obliczenia matematyczne (w tym
statystyczne) wykonano w arkuszu kalkulacyjnym
Microsoft Excel i programie Statistica for Windows
ver.6.1. Istotność statystyczną różnic między grupami oceniono testem istotności (test t Studenta) dla
prób niezależnych. Wnioskowano przy założeniu:
p>0,05 – brak znamienności statystycznej, a p<0,05
– znamienność statystyczna.
Wyniki
W przeprowadzonym eksperymencie stężenie preparatu Theophyllinum w pożywce inkubacyjnej hepatocytów było zbliżone do stężenia w surowicy krwi
ludzi poddanych leczeniu preparatem. Stężenie gluFarmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
#
Zak³ócenie homeostazy oksydacyjnej hepatocytów...
kozy w pożywce inkubacyjnej odpowiadało stężeniu
glukozy w preparacie Theophyllinum dodawanym do
pożywki. Uzyskane wyniki, dotyczące zmian aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) i reduktazy
glutationowej (GR) w hepatocytach w ciągu 180 minut trwania eksperymentu wykazują w odniesieniu
do kontroli jedno wspólne podobieństwo, polegające
na narastaniu aktywności wyżej wymienionych enzymów do 120 minuty eksperymentu, a następnie łagodne obniżenie aktywności w przypadku dysmutazy
ponadtlenkowej i stosunkowo gwałtowne w przypadku reduktazy glutationowej (ryc.1 i ryc.3). Charakter
zmian aktywności peroksydazy glutationowej (GPx)
jest zbliżony do zmian obserwowanych dla dysmutazy glutationowej i reduktazy glutationowej, za wyjątkiem znacznego obniżenia aktywności po 30 minutach inkubowania, czego nie obserwowano w przypadku dysmutazy ponadtlenkowej i reduktzay glutationowej. Nasilenie zmian aktywności wszystkich
trzech enzymów było inne dla preparatu Theophyllinum i inne dla glukozy, a zależało od stężeń obu substancji.
Zmiany aktywnoœci dysmutazy ponadtlenkowej
(SOD)
Po 30 minutach inkubowania obecność w pożywce glukozy o wyższym stężeniu powodowała wzrost
aktywności enzymu o około 15%, natomiast obecność
preparatu Theophyllinum powodowała obniżenie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej odpowiednio do
stosowanych stężeń o około 9% i 15% (ryc.1). Po 60,
120 i 180 minutach inkubowania obecność w pożywce glukozy, niezależnie od stosowanego stężenia,
powodowała wzrost aktywności dysmutazy ponadtlenkowej od 18% do 27%. Obecność w podłożu preparatu Theophyllinum powodowała w hepatocytach systematyczny wzrost aktywności SOD i to intensywniejszy (aż do około 77% po 120 minutach) w przypadku niższego stężenia preparatu (ryc. 1).
Zmiany aktywnoœci peroksydazy glutationowej
(GPx)
Po 30 minutach inkubowania, zarówno obecny
w pożywce preparat Theophyllinum, jak i glukoza
o wyższym stężeniu obniżyły aktywność peroksydazy
glutationowej prawie o połowę w porównaniu z oznaczoną w hepatocytach kontrolnych. Wydłużenie czasu inkubowania komórek do 60 minut powodowało
(w porównaniu z kontrolą) kilkunastoprocentowy
wzrost aktywności enzymu, zarówno w hepatocytach
inkubowanych w obecności glukozy, jak i w obecności preparatu Theophyllinum. Po 120 minutach in-
$
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
Nr 7-8/2007
kubowania nastąpił bardzo intensywny wzrost aktywności GPx w hepatocytach - odpowiednio dla niższego stężenia glukozy o około 89%, a dla wyższego
o około 67%, zaś dla preparatu Theophyllinum odpowiednio o około 145% i 121%. Wydłużenie czasu
inkubowania komórek do 180 minut spowodowało
(w porównaniu do inkubowania przez 120 minut)
znaczne obniżenie aktywności GPx, aczkolwiek była
ona jeszcze o kilkadziesiąt procent wyższa od aktywności oznaczonej w komórkach kontrolnych (ryc.2).
Zmiany aktywnoœci reduktazy glutationowej (GR)
Podobnie jak w przypadku dysmutazy ponadtlenkowej i peroksydazy glutationowej, aktywność reduktazy glutationowej w hepatocytach po 30 minutach
ich inkubowania w obecności glukozy i preparatu
Theophyllinum wykazała nieznaczne zmiany (ryc.3),
a inkubowanie odpowiednio przez 60 i 120 minut
wywołało sukcesywny wzrost aktywności reduktazy
glutationowej w komórkach. Po 60 minutach obecność preparatu Theophyllinum w pożywce (niezależnie od jego stężenia) spowodowała około 28% wzrost
aktywności reduktazy glutationowej w hepatocytach,
zaś po 120 minutach aż o około 60% w przypadku
niższego stężenia i o około 50% w przypadku wyższego stężenia. Obecność glukozy w pożywce także skutkowała wzrostem aktywności reduktazy glutationowej w hepatocytach po 60 minutach o około 5%
w przypadku niższego stężenia i o około 17% w przypadku wyższego jej stężenia, zaś po 120 minutach
odpowiednio o około 32% i aż o około 75%. Po 180
minutach inkubowania aktywność reduktazy glutationowej w hepatocytach gwałtownie zmalała i była
zaledwie kilka procent wyższa od oznaczonej w komórkach kontrolnych (ryc.3).
Dyskusja
Teofilina, podobnie jak większość ksenobiotyków,
jest metabolizowana w wątrobie, w której hepatocyty
stanowią około 80% komórek, dlatego też jako model
biologiczny w prezentowanej pracy wybrano hepatocyty. Na farmakokinetykę teofiliny w organizmie wpływa wiele czynników, między innymi te, które uszkadzają tkankę i zaburzają pracę narządu. Szereg z tych
czynników nie jest istotnych dla badań prowadzonych
na izolowanych hepatocytach, aczkolwiek mogą pojawić się nowe czynniki wynikające z faktu pozbawienia izolowanych komórek na przykład wzajemnego
kontaktu, czy sterowania hormonalnego. Jednym
z pierwszych objawów zakłócenia prawidłowego metabolizmu komórek jest naruszenie równowagi oksy-
Nr 7-8/2007
Zak³ócenie homeostazy oksydacyjnej hepatocytów...
Ryc. 1. Procentowe zmiany aktywności SOD w hepatocytach inkubowanych
w obecności glukozy i preparatu Theophyllinum w zależności od czasu inkubowania.
Wyniki są średnimi ±SE z 6 oznaczeń,
istotność statystyczna p<0,05.
Fig.1. Percentage changes in activity of
SOD in hepatocytes incubated with the
glucose and the drug Theophyllinum. Data
are presented as the mean ±SE (n=6;
p<0,05 compared with control group).
Ryc. 2. Procentowe zmiany aktywności GPx w hepatocytach inkubowanych
w obecności glukozy i preparatu Theophyllinum w zależności od czasu inkubowania.
Wyniki są średnimi ±SE z 6 oznaczeń,
istotność statystyczna p<0,05.
Fig. 2. Percentage changes in activity of
GPx in hepatocytes incubated with the
glucose and the drug Theophyllinum. Data
are presented as the mean ±SE (n=6;
p<0,05 compared with control group).
Ryc. 3. Procentowe zmiany aktywności GR w hepatocytach inkubowanych
w obecności glukozy i preparatu Theophyllinum w zależności od czasu inkubowania.
Wyniki są średnimi ±SE z 6 oznaczeń,
istotność statystyczna p<0,05.
Fig.3. Percentage changes in activity of
GR in hepatocytes incubated with the
glucose and the drug Theophyllinum. Data
are presented as the mean ±SE (n=6;
p<0,05 compared with control group).
dacyjno-redukcyjnej, a w konsekwencji również energetycznej.
Obecność glukozy w preparacie Theophyllinum,
wprowadzonym do pożywki inkubacyjnej, może oczywiście modyfikować działanie samej teofiliny choćby
dlatego, że glukoza jest głównym i szybko dostępnym źródłem energii dla komórek. Obserwowane
zmiany aktywności oznaczonych enzymów w hepatocytach traktowanych preparatem Theophyllinum i glukozą każdorazowo odnoszono do aktywności oznaczonej w komórkach kontrolnych, a zatem stwierdzone
podczas prowadzonych badań zmiany aktywności
badanych enzymów, zarówno w obecności preparatu
Theophyllinum, jak i samej glukozy, wskazują jednoFarmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
%
Zak³ócenie homeostazy oksydacyjnej hepatocytów...
znacznie na ingerencję obu substancji w homeostazę
oksydacyjną komórek. Obserwowany po 30 minutach
eksperymentu niewielki spadek aktywności wszystkich trzech enzymów w hepatocytach traktowanych
preparatem Theophyllinum, w porównaniu z kontrolą, należy przypisać działaniu teofiliny obecnej w preparacie, przy czym w stosunku do SOD i GPx efekt
ten nasila się dla teofiliny o wyższym stężeniu. Ponieważ obecność glukozy w pożywce, w porównaniu do
kontroli, nasila aktywność SOD, dlatego też obserwowany efekt działania preparatu Theophyllinum po
60 i 120 minutach jest działaniem wypadkowym
obecnej w preparacie teofiliny i glukozy. Niewielki
spadek aktywności SOD po 180 minutach, jak również obecny w tym czasie spadek aktywności GPx i GR
są zapewne efektem obniżenia „kondycji metabolicznej” hepatocytów już dość długo przebywających
w warunkach in vitro.
Wyniki dotyczące oznaczania aktywności GPx w hepatocytach inkubowanych z badanymi związkami korespondują z poziomem aktywności SOD, ponieważ
produkt reakcji katalizowanej przez SOD, tzn. nadtlenek wodoru (H2O2) jest substratem dla reakcji katalizowanej przez GPx. Zatem spadek aktywności SOD
skutkuje spadkiem aktywności GPx. W świetle przedstawionych powyżej obserwacji można przypuszczać,
że ani teofilina zawarta w preparacie Theophyllinum,
ani glukoza nie wpływają na aktywność GPx poprzez
ingerencję w metabolizm glutationu. Potwierdzają to
również zmiany aktywności reduktazy glutationowej,
które w zasadzie korespondują ze zmianami SOD
i GPx.
Wnioski
Efekt wywołany preparatem Theophyllinum był
konsekwencją obecności w pożywce zarówno teofiliny, jak i glukozy. Uzyskane wyniki pozwalają na stwierdzenie, że teofilina zawarta w preparacie Theophyllinum i glukoza wywołują w hepatocytach inkubowanych in vitro określony stres oksydacyjny, czemu komórki usiłują przeciwdziałać uruchamiając system
antyoksydacyjny, jakim były zmiany aktywności komórkowych enzymów antyoksydacyjnych.
&
Farmaceutyczny
Przegl¹d Naukowy
Nr 7-8/2007
Piœmiennictwo
1. Łoniewska B.: Zastosowanie teofiliny pod kontrolą monitorowania jej stężenia we krwi u noworodków przedwcześnie urodzonych, w czasie odzwyczajania ich od
mechanicznej wentylacji. Probl. Ter. Monitor., 2000;
11: 97-105.
2. Kassur-Siemiańska B., Milewska-Bobula B., Domeńska
H., Idzik M., Bauer A., Marciński P., Dunin-Wąsowicz
D., Lipka B., Migdał M.: Wyniki leczenia dzieci z dysplazją oskrzelowo-płucną -doświadczenia własne. Pediat.
Pol., 2001; 76: 771-776.
3. Kurzawa R., Doniec Z.: Zasady przewlekłego leczenia
farmakologicznego astmy oskrzelowej u dzieci. Pulmonol., 1995; 4: 26-31.
4. Chazan R.: Rola teofiliny w leczeniu chorych na astmę.
Medipress Chor. Ukł. Oddech., 1996; 1: 6-13.
5. Fromm R.E., Varon J.: Nagłe zaostrzenie choroby obturacyjnej płuc. Med. Dypl., 1995; 4: 51-59.
6. Jacobs M.: Leczenie podtrzymujące obturacyjnej choroby płuc. Med. Dypl., 1995; 4: 41-49.
7. Rogala B.: Teofilina w leczeniu chorób bronchoobturacyjnych. Wiad. Lek., 1998; 51 (3/4): 117-121.
8. Zieliński J.: Przewlekła obturacyjna choroba płuc (POCHP). Gab. Pryw., 2001; 4: 57-62.
9. Droszcz W.: Rola teofiliny w astmie. Pneumon. Alergol.
Pol., 1999; supl. 1.: 57-61.
10. Bochenek G., Kryj-Radziszewska E.: Współczesne poglądy na temat leczenia astmy oskrzelowej u dorosłych.
Prob. Med. Rodz., 1999; 1: 33-38.
11. Zawadzka- Krajeńska A.: Teofilina w leczeniu astmy
oskrzelowej. Nowa Pediatr., 1999; 3: 22-27.
12. Sulivan P., Songul B., Jaffar Z., Page C., Jeffery P., Costello J.: Anti- inflammatory effects of low-dose oral
theophylline in atopic asthma. Lancet, 1994; 343: 10061008.
13. Seglen P.O.: Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell. Biol., 1976; 13: 29-83.
14. Page R.A., Stowel K.M., Hardman M.J., Kitson K.E.: The
assessment of viability in isolated rat hepatocytes. Anal.
Biochem., 1992; 200: 171-175.
15. McCord J.M., Fridovich I.: Superoxide dismuthase. An
enzymatic function for erythrocuprein (hemocuprein).
J. Biol. Chem., 1969; 244: 6049-6055.
16. Paglia D.E., Valentine W.N.: Studies on the quantitative
and qualitative characterization of erythrocyte glutathione
peroxidase. Lab. Clin. Med., 1967; 70: 158-167.
17. Goldberg D.M., Sponer R.J.: Methods of enzymatic analysis. Bergmeyen, H.V.Ed 3rd edn. Verlog Chemie, Deerfield Beach, Fl., 1983; 3: 258-265.
18. Wang C.S., Smith R.L.: Lowry determination of protein
in the presence of Triton X-100. Anal. Biochem., 1975;
63: 414-417.