RT31-020, RT31-100

RT31-020, RT31-100
RT31-020, RT31-100
Zestaw TRANSCRIPTME RNA zawiera wszystkie niezbędne składniki do przeprowa­
dzenia syntezy pierwszej nici cDNA na matrycy mRNA lub całkowitego RNA. Uzyskany
jednoniciowy cDNA nadaje się do stosowania w kolejnych etapach reakcji RT-PCR
i/lub RT-qPCR. Zestaw TRANSCRIPTME RNA został opracowany w celu zapewnienia
wysokiej wydajności syntezy cDNA oraz zwiększenia czułości reakcji RT-qPCR. Pozwala
na syntezę cDNA w zakresie 10 pg – 5 µg matrycowego RNA.
W skład zestawu wchodzi TRANSCRIPTME Enzyme Mix zawierający rekombinowaną
termostabilną odwrotną transkryptazę M-MuLV (bez aktywności RNazy H) oraz
inhibitor RNaz RIBOPROTECT; ponadto zoptymalizowany bufor reakcyjny zawierający
mieszaninę starterów oligo(dT)18, random heksamerów X6, MgCl2 oraz mieszaninę
dNTPs. Odwrotna transkryptaza TRANSCRIPTME charakteryzuje się podwyższoną
termostabilnością, co umożliwia prowadzenie reakcji w wyższej temperaturze
(optimum aktywności w temp. 50°C). Dzięki temu zwiększona zostaje wydajność
i specyficzność transkrypcji regionów RNA z dużą zawartością par GC i/lub struktur
drugorzędowych. Enzym nie posiada aktywności RNazy H i 3’5’ egzonukleazy,
umożliwiając tworzenie produktów cDNA o długości powyżej 10 kb.
Zastosowanie rekombinowanego inhibitora RNaz RIBOPROTECT zabezpiecza
matrycowe RNA przed degradacją. Do zestawu dołączona jest również RNaza H,
która służy do specyficznej degradacji RNA w hybrydach RNA:cDNA tworzonych
po syntezie pierwszej nici cDNA. Ten opcjonalny etap może znacznie poprawić czułość
reakcji RT-qPCR, poprzez zwiększenie dostępności miejsc wiązania się starterów do
matrycy cDNA w reakcji PCR. Trawienie RNazą H jest zalecane w przypadku wysokich
stężeń wyjściowego matrycowego RNA, a także układów PCR wrażliwych na obecność
pozostałości RNA.
DNA-Gdańsk | [email protected] | www.dnagdansk.com
Właściwości i zalety
pp Wysoka wydajność syntezy pełnej długości produktów cDNA (nawet >10 kb)
pp Zwiększona czułość w reakcjach RT-qPCR i RT-PCR
pp Zmniejszona do minimum ilość etapów pipetowania – obniżone ryzyko
wprowadzenia kontaminacji
pp Zestaw zawiera zarówno oligo(dT)18 jak i random heksamery X6, dzięki czemu
możliwa jest jednoczesna synteza cDNA na matrycy mRNA oraz rRNA
pp Materiał wyjściowy: 10 pg do 5 µg całkowitego RNA
pp Optymalna temperatura reakcji: 50°C
pp Odwrotna transkryptaza bez aktywności RNazy H oraz 3’5’ egzonukleazy
o podwyższonej termostabilności, odpowiednia do amplifikacji
trudnych matryc RNA
pp Inhibitor RNaz zabezpiecza matrycowe RNA przed degradacją
pp Dodatkowy etap trawienia RNazą H może znacznie poprawić czułość reakcji
RT-qPCR w przypadku układów wrażliwych na obecność pozostałości RNA
po syntezie cDNA
Zastosowania
pp Synteza pierwszej nici cDNA w RT-PCR i RT-qPCR
pp Konstrukcja bibliotek cDNA
pp Analiza RNA
RT31-020, RT31-100
Protokół syntezy pierwszej nici cDNA
1. Do sterylnej, wolnej od nukleaz probówki typu Eppendorf umieszczonej
w lodzie lub w statywie mrożeniowym należy dodać następujące składniki
reakcji we wskazanej kolejności (dla większej ilości prób zaleca się przygo­
towanie Master Mix-u bez matrycowego RNA):
Składnik
Ilość
2x RT Master Mix
10 µl
TRANSCRIPTME Enzyme Mix
RNA
woda wolna od nukleaz
2 µl
≤ 5 µg
uzupełnić do 20 µl
2. Delikatnie wymieszać i inkubować w temp. 25°C przez 10 min.
3. Inkubować w temp. 50°C przez 30 min.
4. Inaktywować reakcję poprzez ogrzewanie w temp. 85°C przez 5 min., a następnie
niezwłocznie schłodzić w lodzie.
Opcjonalnie *: dodać 1 µl RNazy H i inkubować w temp. 37°C przez 20 min.,
a następnie inaktywować reakcję przez ogrzewanie w temp. 85°C przez 5 min.
* Etap trawienia RNazą H może znacznie poprawić czułość reakcji RT-qPCR w przypadku układów
wrażliwych na obecność pozostałości RNA.
5. Produkt cDNA może być użyty bezpośrednio w reakcjach PCR lub qPCR
(nierozcieńczony lub rozcieńczony w wodzie wolnej od nukleaz lub w TE),
bądź przechowywany w temp. -20°C lub -70°C do czasu dalszych analiz.
Praca z RNA
Wysoka jakość nienaruszonego RNA, wolnego od pozostałości genomowego DNA i RNaz
jest istotna do syntezy wysokiej jakości pełnej długości produktów cDNA oraz dokładnej
analizy ilościowej RNA (qPCR).
W związku z tym należy przestrzegać następujących zaleceń dotyczących pracy z RNA:
pp Utrzymywać aseptyczne warunki pracy: używać jednorazowych rękawiczek
i w miarę potrzeby często je zmieniać; używać probówek i tipsów wolnych
od RNaz (RNase-free); wyznaczyć specjalny obszar i sprzęt do pracy tylko z RNA.
pp DNaza I (brak w zestawie) może być zastosowana w celu wyeliminowania
zanieczyszczeń genomowym DNA w wyjściowych preparatach RNA.
pp Preparaty RNA powinny być przechowywane w temp. -70°C, najlepiej
rozporcjowane. Należy unikać częstego rozmrażania/zamrażania próbek.
Dodatkowe informacje
pp Do izolacji całkowitego RNA z tkanek zwierzęcych lub linii komórkowych
polecamy zestaw EXTRACTME TOTAL RNA (EM09) lub EXTRACTME TOTAL
RNA PLUS (EM11).
pp Wszystkie odczynniki zestawu TRANSCRIPTME RNA należy przechowywać
w lodzie lub w statywie mrożeniowym podczas przygotowywania reakcji RT-PCR.
pp Wszystkie odczynniki zestawu należy przechowywać szczelnie zamknięte
w temp. -20°C lub -70°C.
pp W przypadku układów wrażliwych na obecność pozostałości RNA można
poprawić czułość reakcji RT-PCR lub RT-qPCR poprzez przeprowadzenie
trawienia RNazą H.
pp Podczas przeprowadzania reakcji PCR lub qPCR na matrycy zsyntetyzowanego
cDNA, należy użyć cDNA w ilości nie większej niż 1/10 końcowej objętości reakcji
PCR, np. 2,5 µl cDNA w 25 µl reakcji PCR.
pp Aktywność odwrotnej transkryptazy TRANSCRIPTME hamowana jest w obecności
substancji chelatujących jony metali (np. EDTA), nieorganicznego fosforanu,
pirofosforanu i poliamin.
Kontrola jakości
Preparat wolny od nukleaz oraz zanieczyszczeń kwasami nukleinowymi. Produkt
testowano w reakcjach odwrotnej transkrypcji, a następnie na otrzymanych
matrycach cDNA przeprowadzono szereg reakcji PCR i qPCR.
DNA-Gdańsk | [email protected] | www.dnagdansk.com
Możliwe problemy i ich rozwiązywanie
Problem
Prawdopodowna przyczyna
Rozwiązanie
Brak lub niska
wydajność syntezy
cDNA
RNA jest podegradowane
Zalecane jest przechowywanie
RNA w temp. -70°C. Należy
unikać częstego rozmrażania
i zamrażania próbek.
Po rozmrożeniu próbka RNA
powinna być niezwłocznie
umieszczona w lodzie lub
w statywie mrożeniowym.
Należy sprawdzić jakość
wyizolowanego RNA w żelu
w warunkach denaturujących.
Do reakcji użyto za mało RNA
lub RNA o niskiej jakości
Zwiększyć ilość RNA.
Usunąć inhibitory reakcji
(m.in. SDS, EDTA, fosforan sodu,
spermidyna, sole guanidyny,
formamid itd.) poprzez
precypitację RNA, włączając etap
płukania 70% etanolem.
Próbka wyizolowanego RNA
zawiera genomowe DNA
Traktować zanieczyszczoną
próbkę RNA DNazą I.
Nieoczekiwane
prążki podczas
analizy elektroforetycznej amplifikowanych produktów
RT31-020
20 reakcji
RT31-100
100 reakcji
RT31-S
3 reakcje
TRANSCRIPTME Enzyme Mix (1)
40 µl
5 x 40 µl
7 µl
2x RT Master Mix 200 µl
5 x 200 µl
33 µl
RNase H (E. coli)
20 µl
5 x 20 µl
4 µl
Nuclease-free water
180 µl
5 x 180 µl
35 µl
Zawartość
(2)
1) Zawiera odwrotną transkryptazę TRANSCRIPTME oraz inhibitor RNaz RIBOPROTECT.
2) Zawiera bufor do RT-PCR, startery oligo(dT)18, random heksamery, MgCl2 oraz mieszaninę dNTPs.
Przechowywanie i transport
Warunki przechowywania
Wszystkie elementy zestawu należy przechowywać w temp. -20°C.
Trwałość może być przedłużona przy przechowywaniu zestawu w temp. -70°C.
Warunki transportu
Transport w warunkach chłodniczych.
do badań naukowych
Data zakupu
DNA-Gdańsk
[email protected] | www.dnagdansk.com
Gwarancja
12 miesięcy od daty zakupu