Liposomy – nośniki leków przeciwnowotworowych

Liposomy – nośniki leków
przeciwnowotworowych
mgr Patrycja Kozub
„Projektowanie,
synteza
i
badanie
nanonośników
liposomowych do transferu leków – (porfiryn, chloryn) do
komórek nowotworowych” (prof. dr hab. Alicja Ratuszna).
Wprowadzenie do technologii
liposomowej
Liposomy – z gr. ciałka lipidowe. Są to struktury
powstające samoistnie z fosfolipidów. Mają postać
pęcherzyków zbudowanych z kilku lub kilkunastu
przestrzeni wodnych oddzielonych od siebie
zamkniętymi
koncentrycznie
dwuwarstwami
fosfolipidowymi.
http://dolinabiotechnologiczna.pl
Budowa liposomu
http://ebiolog.pl/a-7-3.html
Rodzaje fosfolipidów
DSPC 18:0 - disterylofosfatydylocholina
DPPC 16:0 - dipalmitylofosfatydylocholina
DPPG 16:0 - dipalmitylofosfatydyloglicerol
DSPG 18:0 - disterylofosfatydyloglicerol
DSPE-PEG 2000 18:0 – disterylofosfatydyloetanoloamina
-glikol polietylenowy
DOTAP 18:1 - dioleoilometyloamoniopropan
http://www.avantilipids.com/
HSPC – uwodorniona fosfatydylocholina
Mechanizm powstawania liposomów
A. Kozubek, Wstęp do
technologii
liposomowej, Wrocław
2004
Podział liposomów
1. Wielowarstwowe
pęcherzyki (MLV) o
wielkości od 200 nm do
kilku mikronów.
2. Duże jednowarstwowe
pęcherzyki (LUV) o
wielkości od 100 nm do
400 nm.
3. Małe jednowarstwowe
pęcherzyki o wielkości
od 25 nm do 100 nm.
A. Sharma, U.S. Sharma, Int. J. Pharm., 1997,
154, 123-140
Inne podziały
• Ze względu na skład:
 konwencjonalne
 stabilne sferycznie
 modyfikowane
• Ze względu na ładunek:
 Jonowo obojętne
 kationowe
 anionowe
K. Stebelska et al., Adv. Clin. Med. 2002,
11, 2, 229-242
Preparatyka liposomów
1. Metoda cienkiego filmu fosfolipidowego.
A. Kozubek,
Wstęp do
technologii
liposomowej,
Wrocław 2004
2. Modyfikacje metody 1.
a) Sonikacja
A. Kozubek, Wstęp do technologii liposomowej, Wrocław 2004
b) Kalibracja przez filtry poliwęglanowe o ściśle określonej
wielkości porów.
A. Kozubek, Wstęp do technologii liposomowej, Wrocław 2004
c) Prasa Frencha
2. Wstrzykiwanie
roztworu etanolowego
A. Kozubek, Wstęp do technologii liposomowej, Wrocław 2004
Wykorzystanie liposomów jako nośników
leków w terapii fotodynamicznej
A.C. Kübler, Med Laser Appl, 2005, 20, 37-45
Leki zamknięte w formulacjach liposomowych
Substancja czynna
Stosunek lipid:lek
Skład liposomów
Zastosowanie
1990
Amfoterycyna B
7:1
HSPC/Chol/DSPG
-Alfa-tokoferol
4.26:1.04:1.68:0.
13
Poważne infekcje
grzybicze
Doxil
1995
Doksyrubicyna
8:1
HSPC/Chol/DSPE
-PEG 2000
6.5:3.5:0.5
Leczenie mięsaka
Kaposiego u
pacjentów z AIDS
ABELCET
1995
Amfoterycyna B
1:1
DMPC/DMPG
7:3
Poważne infekcje
grzybicze
DaunoXome
1996
Daunorubicyna
15:1
DSPC/Chol
2:1
Leczenie mięsaka
Kaposiego u
pacjentów z AIDS
Visudyne
2000
Werteporfiryna
-
Zwyrodnienie
plamki żółtej
2001
Chlorowodorek
doksorubicyna
19:1
EPC/Chol
2.5:1
Leczenie kobiet z
rakiem piersi z
przerzutami
Nazwa produktu
AmBisome
Myocet
Rok zatwierdzenia
DepoCyte
2002
cytarabina
-
Zapalenie opon
mózgowych w
wyniku przebiegu
chłoniaka
DepoDur
2004
Morfina
-
Ból po operacji
Materiał badawczy
Chloryna D
Preparatyka liposomów – metoda
cienkiego filmu fosfolipidowego
Rodzaje badanych liposomów:
1.
•
•
2.
•
•
3.
•
•
Obojętne:
HSPC/Chol 7:3
HSPC/DSPE-PEG 2000 9.5:0.5
Kationowe
HSPC/DOTAP/Chol 6:1:3
HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 8.5:1:0.5
Anionowe
DPPC/DPPG 9:1
HSPC/DSPG/DSPE-PEG 2000 8.5:1:0.5
Stężenie chloryny w 1 mL zawiesiny liposomów 100 μM.
Ocena stopnia miejsca zamykania się
związku w liposomach
Mikroskop fluorescencyjny
Nikon Eclipsce 90i
Wykonanie zdjęć
• Seria 4 zdjęć:
 film lipidowy przed wzbudzenie
 film lipidowy po wzbudzeniu
 film lipidowy po podgrzaniu
 film lipidowy po podgrzaniu i wzbudzeniu
Do wzbudzenia oraz obserwacji fluorescencji
używano filtru TRITC (wzbudzenie – światło
zielone, emisja – światło czerwone).
HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000
z chloryną D
100 µm
Film lipidowy po
wzbudzeniem
Film lipidowy przed
wzbudzeniem
100 µm
HSPC/DOTAP/Chol
z chloryną D
100 µm
Film lipidowy po
podgrzaniu i wzbudzeniu
Film lipidowy po
podgrzaniu
100 µm
HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000
z chloryną D
100 µm
Film lipidowy po
podgrzaniu i wzbudzeniu
Film lipidowy po
podgrzaniu
100 µm
Analizator wielkości cząstek
Zetasizer Nano ZS firmy Malver – określenie wielkości
pęcherzyków,
ich
stabilności
oraz
ocena
polidyspersyjności.
Wykonanie pomiarów
• Kuweta polistyrenowa, cztery ścianki czynne
optycznie.
• Źródło światła oświetlającego – laser 633 nm.
• Detekcja światła wstecznie rozproszonego pod
kątem 173o.
• Pomiar wykonywany w temperaturze 25oC.
• Wyniki uśredniano z 5 pomiarów.
Pomiar średnicy pęcherzyków
HSPC/DOTAP/Chol
Średnica: 217±6.21
PDI:0.21±0.02
HSPC/DOTAP/DSPEPEG 2000
Średnica:
121.8±2.58
PDI:0.12±0.01
Stabilność
0,25
HSPC/DOTAP/Chol z chl D
200
0,2
150
0,15
PDI
d [nm]
250
100
0,05
0
0
48 h
72 h
Po 3 miesiącach
24 h
150 HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 z chl
D
72 h
Po 3 miesiącach
chl D
0,2
100
50
48 h
0,25 HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 z
PDI
d [nm]
0,1
50
24 h
HSPC/DOTAP/Chol z chl D
0,15
0,1
0,05
0
24 h
0
48 h
72 h
Po 3 miesiącach
24 h
48 h
72 h
Po 3 miesiącach
Test MTS – ocena przeżywalności
komórek
Płytka kontrolna
k
k
k
Płytka naświetlana
1uM
1uM
1uM
1uM
1uM
1uM
2uM
2uM
2uM
2uM
2uM
2uM
2.5
uM
2.5
uM
2.5
uM
2.5
uM
2.5
uM
2.5
uM
5uM
5uM
5uM
5uM
5uM
5uM
Oświetlacz halogenowy wyposażony
w 4 żarówki o mocach 250 W oraz
filrt odcinający długości fali poniżej
630 nm.
k
k
k
Wykonanie eksperymentu
Kontrola
1 μM
1.5 μM
2 μM
5 μM
20 J/cm2
12 J/cm2
4 J/cm2
20 J/cm2
12 J/cm2
4 J/cm2
20 J/cm2
12 J/cm2
4 J/cm2
20 J/cm2
12 J/cm2
4 J/cm2
20 J/cm2
12 J/cm2
4 J/cm2
Frakcja przeżywająca [%]
120
HSPC/DOTAP/CHOL z chloryną D
100
80
60
40
20
0
10 μM
0
Kontrola
1 μM
1.5 μM
2 μM
5 μM
20 J/cm2
12 J/cm2
4 J/cm2
20 J/cm2
12 J/cm2
4 J/cm2
2 μM
20 J/cm2
12 J/cm2
4 J/cm2
20 J/cm2
12 J/cm2
4 J/cm2
20 J/cm2
12 J/cm2
Frakcja przeżywająca [%]
140
HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 z chloryną D
120
100
80
60
40
20
10 μM
Podsumowanie
• Mikroskop fluorescencyjny – związek zamyka się w
dwuwarstwie fosfolipidowej.
• Średnica badanych typów liposomów jest w okolicy 100 nm
za wyjątkiem liposomów kationowych z cholesterolem.
• Pod kątem zmian średnicy cząsteczek w czasie liposomy są
stabilne,
jednakże
występują
zmiany
wartości
współczynnika polidyspersyjności (PDI < 0.3).
• Efekt PDT – około 20% komórek nowotworowych przeżywa
terapię.
• Cytotoksyczność ciemna występuje w przypadku podania
związku zamkniętego w liposomach, ale dopiero powyżej
stężenia 2µM.
Dziękuję za uwagę.