wczesne wyniki makroskopowe i histologiczne

64
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Rekonstrukcja tkanki chrzęstnej biomateriałami polimerowymi
– wczesne wyniki makroskopowe i histologiczne
Cartilage tissue reconstruction by the polymer biomaterials
– early macroscopic and histological results
Wojciech Ścierski, Aleksandra Polok, Grzegorz Namysłowski, Jerzy Nożyński1,
Lucyna Turecka, Natalia Urbaniec, Elżbieta Pamuła 2
Otolaryngol Pol 2009;
63 (7 ): 64-72
SUMMARY
Introduction: The surgical treatment of large cartilage defects in the region
of head and neck is often impossible because of the atrophy of surrounding
tissues and lack of suitable material for reconstruction. In the surgical treatment many of methods and reconstructive materials have been used. For many
years the suitable synthetic material for the cartilage defects reconstruction
has been searched for.
The aim of the study: was to evaluate two different biomaterials with proper
mechanical and biological features for the cartilage replacement.
Material and methods: Two type of biomaterials in this study were used:
resorbable polymer - poly(L-lactide-co-glycolide) (PLG) acting as a supportive
matrix. A thin layer of sodium hyaluronate (Hyal) was also deposited on the
surface as well in the pore walls of PLG scaffolds in order to provide biologically
active molecules promoting differentiation and regeneration of the tissue. The
studies were performed on the 50 animals – rabbits divided into 2 groups. The
animals were operated in the general anaesthesia. The incision was done along
the edge of the rabbit’s auricle. Perichondrium and cartilage of the auricle on
the surface 4 x 3 cm were prepared. Subperichondrically 1 x 1 cm fragment of
the cartilage was removed by the scissors. This fragment was then replaced
by the biomaterials: PLG in first group of 25 rabbits and PLG-Hyal in second
group 25 rabbits. The tissues were sutured with polyglycolide Safil® 3-0. The
animals obtained Enrofloxacin® for three days after the operation. Then 1, 4
and 12 weeks after the surgery the animals were painlessly euthanized by an
overdose of Morbital®. Implants and surrounding tissues were excised and
observed macroscopically and using an optical microscope.
Results: In all the observation periods we observed proper macroscopic healing process of biomaterials. We didn’t stated strong infl ammatory process
and necrosis around the implanted biomaterials.
Conclusions: The histological and macroscopic examinations indicated that
both materials developed in this study have properties similar to cartilaginous
tissue and seem to be good for her restoration. Although the quickest tissue
regeneration was found after implantation of PLG-Hyal.
©by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów
– Chirurgów Głowy i Szyi
Otrzymano/Received:
02.06.2009
Zaakceptowano do druku/Accepted:
22.06.2009
Katedra i Oddział Kliniczny Laryngologii
w Zabrzu Śląskiego Uniwersytetu Medycznego
w Katowicach
Kierownik Kliniki: Prof. dr hab. med.
Grzegorz Namysłowski
1
Pracownia Histopatologii Śląskiego Centrum
Chorób Serca w Zabrzu
Kierownik: dr med. Jerzy Nożyński
2
Katedra Biomateriałów Akademii GórniczoHutniczej w Krakowie
Kierownik: Prof. dr hab. inż. Stanisław Błażewicz
Wkład pracy autorów/Authors contribution:
Wojciech Ścierski – opracowanie koncepcji pracy,
eksperyment zwierzęcy,
Aleksander Polok – opracowanie koncepcji pracy,
eksperyment zwierzęcy,
Grzegorz Namysłowski – opracowanie koncepcji
pracy,
Jerzy Nożyński – badanie histopatologiczne,
Lucyna Turecka – udział w redagowaniu publkacji,
Natalia Urbaniec – udział w redagowaniu pracy.
Konflikt interesu/Conflicts of interest:
Autorzy pracy nie zgłaszają konfliktu interesów.
Adres do korespondencji/
Address for correspondence:
imię i nazwisko: Wojciech Ścierski
adres pocztowy:
Katedra i Oddział Kliniczny Laryngologii
Śląskiego UM w Zabrzu
ul. Skłodowskiej-Curie 10
41-800 Zabrze
tel. 32 271 74 20
e-mail [email protected]
Hasła indeksowe: rekonstrukcja tkanki chrzęstnej, materiały syntetyczne, kopolimer glikolidu i L-laktydu (PLG), kwas hialuronowy
Key words: Cartilage tissue reconstruction, synthetic biomaterials, poly (glycolide-co-L-lactide) PGLA, hyaluronic acid (Hyal).
Wprowadzenie
Tkanka chrzęstna pojawia się u zarodka w 5 tygodniu
życia i występuje u dorosłego człowieka pod postacią
tkanki chrząstkowej (chondroidalnej) oraz chrząstki.
Wyróżniamy różne odmiany chrząstki, takie jak:
miąższowa, włóknista, sprężysta oraz najbardziej
zróżnicowana chrząstka szklista. Wszystkie rodzaje chrząstki rozwijają się na podłożu mezenchymy,
a na ich budowę duży wpływ wywierają czynniki
mechaniczne.
Rekonstrukcja ubytków tkanki chrzęstnej w obrębie
narządów głowy i szyi takich jak tchawica, krtań, ucho
zewnętrzne oraz przegroda nosa stanowi nadal duży
problem zarówno dla otolaryngologów jak i chirurgów plastycznych. Do dnia dzisiejszego nie znaleziono
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
ani idealnej metody leczenia chirurgicznego ubytków
i perforacji chrząstki, ani odpowiedniego biomateriału,
którym można by ją zastąpić.
W dostępnej literaturze istnieje szereg doniesień
na temat prób zastosowania resorbowalnego kopolimeru laktydu i glikolidu (PLG) należącego do grupy
poliestrów alifatycznych oraz kwasu hialuronowego
w rekonstrukcji tkanki chrzęstnej [1–5]. Wykorzystano
doskonałe właściwości mechaniczne tych biomateriałów, łatwość ich modyfikowania oraz biokompatybilność
idealnie korelującą ze strukturą chemiczną chondrocytów. Prowadzono badania nad wykorzystaniem PLG
w rekonstrukcji ubytków tkanki chrzęstnej w obrębie
głowy i szyi (leczenie ubytków i złamań kości czaszki,
rekonstrukcje podczas operacji uszu, operacje plastyczne w zakresie twarzoczaszki), a także w procesie
osteogenezy w ortopedii oraz chirurgii szczękowo-twarzowej. Eksperymenty przeprowadzano na zwierzętach
(myszy, szczury, króliki, owce) a ich wyniki nie były
w pełni zadowalające. Brak informacji o wykorzystaniu
PLG i jego kompozycji z kwasem hialuronowym (PLGHyal) w chirurgii rekonstrukcyjnej małżowiny usznej
i nosa skłoniły autorów do przeprowadzenia własnych
badań w tym zakresie.
Pomimo stosowania różnych metod operacyjnych
i materiałów w rekonstrukcji ubytków przegrody nosa,
jak dotąd nie znaleziono idealnego rozwiązania. Wykorzystywanie tkanek własnych z najbliższego otoczenia
(małżowina nosowa dolna, boczna ściana nosa) związane jest z dużymi ograniczeniami i niewielkim odsetkiem
powodzeń. Zastosowanie materiałów syntetycznych nie
przyniosło dotychczas spodziewanych efektów. Wciąż
zatem poszukuje się materiału, który byłby skuteczny
w odbudowie brakującego chrzęstnego fragmentu przegrody nosa. Materiał ten poza odpowiednimi cechami
biologicznymi musi spełniać określone właściwości fizykomechaniczne upodabniające go do tkanki chrzęstnej
przegrody nosa. Celem podjętych badań była ocena kliniczna zmodyfikowanych biomateriałów polimerowych
(PLG i PLG-Hyal) w eksperymentalnej rekonstrukcji
ubytków tkanki chrzęstnej oraz ocena histologiczna
tkanek otaczających implantowane biomateriały.
Materiał i metodyka
1. Biomateriały do rekonstrukcji tkanki chrzęstnej
Do badań wykorzystane zostały dwa rodzaje biomateriałów: resorbowalny kopolimer L-laktydu z glikolidem (PLG) zawierający 85% mol L-laktydu i 15%
mol glikolidu (PAN Zabrze) oraz kopolimer L-laktydu
z glikolidem modyfikowany kwasem hialuronowym
(PLG-Hyal). Materiały te przetworzono do postaci przestrzennych gąbek z wykorzystaniem substancji porotwórczej – chlorku sodu o frakcji ziarnowej 250–320 μm
(POCh, Gliwice) (ryc. 1). Próbki przygotowywano w następujący sposób: do roztworu PLG w chlorku metylenu
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
dodawano odpowiednią ilość chlorku sodu, tak, aby
udział objętościowy porogenu wynosił 85%. Następnie
mieszaninę homogenizowano, odlewano do szalki Petriego, suszono i umieszczano w wodzie destylowanej
w celu wypłukania soli. Próbki PLG-Hyal otrzymano
poprzez ciekłą impregnację pod ciśnieniem gąbek PLG
roztworem kwasu hialuronowego. Następnie próbki
wysuszono w suszarce próżniowej. Oba materiały zostały wyjałowione za pomocą plazmy nadtlenku wodoru
(Sterrad 120, ASP, Johnson&Johnson). Biomateriały
przygotowywano pod postacią pasków o wymiarach
0,5 x 1,0 cm i grubości 2 mm.
2. Eksperyment zwierzęcy
Eksperyment zwierzęcy z użyciem biomateriałów
został przeprowadzony na 50 królikach rasy Białe
Nowozelandzkie, pochodzących z hodowli konwencjonalnej, ze stada własnego Centralnej Zwierzętarni
Doświadczalnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego
w Katowicach. Ze względu na dobry dostęp operacyjny materiały implantacyjne wszczepione zostały
w chrząstkę małżowiny usznej, która wykazuje bardzo duże podobieństwo do elementów chrzęstnych
przegrody nosa. Zwierzęta operowano w znieczuleniu
ogólnym. Z cięcia wzdłuż brzegu małżowiny usznej
królika wypreparowywano płat skórno-ochrzęstnowy i odsłaniano chrząstkę na powierzchni 4 x 3 cm.
Podochrzęstnowo usuwano fragment chrząstki małżowiny o wymiarach 1 x 1 cm, który następnie uzupełniano przy pomocy biomateriału. 50 zwierząt doświadczalnych podzielono na dwie grupy. W grupie
pierwszej 25 zwierząt ubytek chrzęstny małżowiny
uzupełniono za pomocą PLG. W grupie drugiej 25
zwierząt ten sam ubytek uzupełniono przy pomocy
PLG zmodyfikowanego kwasem hialuronowym. Po
rekonstrukcji ubytku chrzęstnego przykładano na
niego płaty skórno-ochrzęstnowe, a ranę szyto dwoma
lub trzema szwami resorbowalnymi z poliglikolidu
(3-0). Zwierzęta zostały poddane eutanazji po 1, 4
i 12 tygodniach obserwacji, za pomocą preparatu
Morbital® w dawce 200 mg/kg masy ciała dosercowo,
poprzedzonego w premedykacji podaniem Domitoru®
z Ketaminą. Do badań pobierano całą małżowinę
uszną wraz z implantowanym biomateriałem. Badając
proces gojenia dokonano oceny makroskopowej i histologicznej. Preparaty pochodzące z miejsc implantacji
utrwalano w 4% zbuforowanej formalinie, poddawano
je rutynowej obróbce histologicznej, barwiono rutynowo Hematoksyliną i Eozyną. Oceniono zarówno biomateriały jak i otaczającą tkankę chrzęstną małżowiny
usznej. Badania histologiczne zostały przeprowadzone
w Akademii Górniczo-Hutniczej w Krakowie oraz
w Pracowni Histopatologicznej Śląskiego Centrum
Chorób Serca w Zabrzu. Na przeprowadzenie badań
uzyskano zgodę Komisji Etycznej do spraw Doświadczeń na Zwierzętach ŚUM w Katowicach (nr zgody
17/2007 z dnia 21 lutego 2007 roku).
65
66
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
1
2
Ryc. 1. Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu elektronowego skaningowego gąbek PLG i PLG-Hyal.
3. Analiza statystyczna
Analiza statystyczna zmian mikroskopowych obejmowała ocenę półilościową, rangową obfitości nacieku
zapalnego, obecności komórek resorpcyjnych wielojądrowych, włóknienia oraz waskularyzacji. Nasilenie
zmian ustalano w skali umownej, gdzie: 0 – oznaczało
brak danej zmiany, 1 – zmianę nieznaczną, 2 – występowanie częstsze, 3 – występowanie umiarkowanie
nasilone, 4 – zmianę bardzo wyraźną, 5 – zmianę
dominującą w obrazie. Oceniono statystykę opisową
każdej z grup czasowych porównywanych ze sobą.
Właściwą wartością przeciętną jest mediana. Porównania wzajemne przeprowadzono z użyciem testu nieparametrycznego Manna-Whitneya. Przeprowadzono też
analizę korelacji testem Spearmana, w której oceniono
współzależność obserwowanych zmian z czasem obserwacji, upływającym od implantacji każdego z polimerów. Oceniono siłę korelacji na podstawie wartości
i znaku współczynnika r Spearmana oraz znamienność
tej zależności. Za wynik znamienny przyjęto prawdopodobieństwo p mniejsze lub równe 0,05. Obliczenia
statystyczne przeprowadzono z wykorzystaniem pakietu Statistica 99.
Wyniki i ich omówienie
U żadnego z królików nie wystąpiły powikłania związane z operacją i znieczuleniem. Proces gojenia rany
był podobny u wszystkich zwierząt. We wszystkich
przypadkach przez pierwsze 10 dni obserwowano
umiarkowany obrzęk w okolicach cięcia małżowiny
usznej bez objawów nasilonego stanu zapalnego. Zauważano jedynie niewielkie symetryczne zgrubienie
brzegów rany, a przy obmacywaniu nie wyczuwano
chełbotania mogącego świadczyć o obecności krwiaka lub wydzielinie przyrannej. Rana skórna goiła się
przez rychłozrost do 14 dni od zabiegu operacyjnego.
Nieznaczne zgrubienia tkanek w pobliżu cięcia skórnego obserwowano do około dwóch miesięcy od zabiegu
operacyjnego.
1. Badania histologiczne implantu
1. Pierwszy tydzień po implantacji
Okres pierwszego tygodnia po implantacji polimeru PLG wykazywał obfity naciek zapalny, w którym
dominowały liczne makrofagi i rozproszone limfocyty.
Naczynia krwionośne były nieliczne, z reguły słabo
widoczne wśród obfitego nacieku. Naciek idąc obwodowo tracił swoją obfitość na korzyść wydłużonych
fibroblastów oraz słabo widocznych włókien kolagenowych, tworzących jego torebkę. Chrząstka w okolicy implantu nie wykazywała zmian wstecznych oraz
zapalnych, zachowując prawidłową barwliwość istoty
pozakomórkowej i typowy układ chondrocytów (Ryc. 2).
Implantacja drugiego z badanych materiałów PLG-Hyal,
wykazywała żywszy odczyn zapalny, z liczniejszymi
limfocytami, domieszką makrofagów oraz licznymi
poszerzonymi naczyniami kapilarnymi, sugerując ostry
stan zapalny. Torebka łącznotkankowa obfitowała w fibroblasty z nieznaczną domieszką nacieku zapalnego.
Zauważano także pojedyncze komórki wielojądrowe.
Chrząstka, pomimo istnienia ostrego odczynu zapalnego nie wykazywała zmian (Ryc. 3).
2. Czwarty tydzień po implantacji
Czwarty tydzień poimplantacyjny PLG wykazywał spadek obfitość i rozrzedzenie nacieku zapalnego,
w którym dominującym elementem obrazu były cechy
zapalenia resorpcyjnego, z obecnością licznych komórek
olbrzymich wielojądrzastych przylegających do resztek
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
1
2
3
Ryc. 2. Implant PLG – 1 tydzień obserwacji: naciek zapalny złożony głównie z makrofagów i limfocytów obejmuje fragmenty
polimeru PLG (1). Torebka wokół nacieku z włókien kolagenowych i fibroblastów (2) (pow. 400x). Chrząstka wokół PLG nie wykazuje zmian (3) (pow. 200x). Barwienie HE.
1
2
3
Ryc. 3. Implant PLG-Hyal – 1 tydzień obserwacji: Naciek zapalny składający się z limfocytów i histiocytów, widoczne młode
naczynia krwionośne (1) (pow. 400x). Torebka otaczająca ziarninę zapalną z licznymi fi broblastami (2) (pow. 150x). Chrząstka bez zmian patologicznych (3) (pow. 250). Barwienie HE.
1
2
3
Ryc. 4. Implant PLG – 4 tydzień obserwacji. Liczne komórki resorpcyjne wielojądrzaste otaczają fragmenty polimeru. W zrębie widoczny rozproszony naciek limfocytarno-histiocytarny (1). Komórka olbrzymia zawierająca dwójłomne resztki polimeru
(2) (pow. 400x). Miejsce nacięcia chrząstki z wytworzeniem blizny z młodej dojrzewającej chrząstki tworzącej strefy izogeniczne (3) (pow. 150x). Barwienie HE.
polimeru. Nadal dostrzegano domieszkę limfocytów.
Wewnątrz części komórek olbrzymich dało się zauważyć
dwójłomne resztki trawionego polimeru PLG. Chrząstka
uszkodzona w okolicy implantacji polimeru ujawniaO t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
ła z kolei cechy regeneracji, zauważano zaburzony
układ chondrocytów odpowiadający bliźnie chrzęstnej,
z obecnością młodej, słabo zasadochłonnej istoty pozakomórkowej i różnicującym się układem młodych drob-
67
68
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
1
2
3
Ryc. 5. Implant PLG-Hyal - 4 tydzień obserwacji: Liczne ziarniniaki resorpcyjne zawierające komórki olbrzymie wielojądrowe.
Włóknienie zrębu. (1) (pow. 200x). Chrząstka o zwiększonej zasadochłonności istoty podstawowej i włóknienie ochrzęstnej.
Zwiększona ilość fi broblastów. Obok widoczne ziarniniaki resorpcyjne wokół fi lamentów PLG-Hyal (2,3) (pow. 400x).
1
2
3
Ryc. 6. Implant PLG – 12 tydzień obserwacji: Ziarniniaki resorpcyjne zawierające komórki wielojądrowe otoczone mankietem
nacieku limfocytarnego i tkanką łączną (1) (pow. 200x). Apoptotyczny rozpad komórki olbrzymiej (2) (pow. 1000x). Zwłóknienie ochrzęstnej w sąsiedztwie z ziarniną resorpcyjną (3) (pow.50x).
1
2
3
Ryc. 7. Implant PLG-Hyal – 12 tydzień obserwacji: Liczne pobudzone limfocyty. Cytoplazma komórki olbrzymiej zawiera
fragmenty polimeru (1) (pow. 600x). Wzmożona zasadochłonność istoty podstawowej chrząstki, resztki (cienie) chondrocytów, brak jąder komórkowych oraz warstwa chondroblastów (2) (pow. 100x). Chrząstka z zachowaną izogenicznością, istota
podstawowa wykazuje normochromię, liczne chondrocyty zawierają jądra komórkowe (3) (pow. 200x).
nych chondrocytów w kolumny izogeniczne (Ryc. 4).
Czterotygodniowa obserwacja implantów PLG-Hyal wykazywała podobne zmiany. W obrazie mikroskopowym
dominowały liczne ziarniniaki resorpcyjne otaczające
resztki polimeru, cechy zapalenia ostrego zanikały,
pojawiało się włóknienie zrębu. Chrząstka wykazywała
wzrost zasadochłonności istoty podstawowej pozakomórkowej, chondrocyty nie wykazywały zmian wsteczO t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
nych. Natomiast okolica ochrzęstnej zlokalizowana
blisko polimerowego implantu i ziarniniaków ulegała
włóknieniu, pojawiały się w niej naczynia kapilarne
i zwiększała się ilość fibroblastów (Ryc. 5).
3. Dwunasty tydzień po implantacji
Dwunasty tydzień po implantacji PLG wykazywał
histologiczne zmiany zbliżone do tygodnia czwartego.
W obrazie nadal dostrzegano ziarniniaki resorpcyjne
zawierające komórki olbrzymie wielojądrowe, ilość limfocytów ulegała zmniejszeniu, zaś w obwodzie ziarniniaków obserwowano zwiększenie się ilości tkanki łącznej.
Niektóre z ziarniniaków imitowały odczyn sarkoidalny,
w części pozostałych dostrzegany był apoptotyczny
rozpad komórek z tworzeniem bezpostaciowych mas
zawierających pył chromatynowy z rozpadłych jąder
komórkowych. Chrząstka nie wykazywała istotnych
zmian, natomiast ochrzęstna w okolicy implantowanego polimeru wykazywała cechy zwłóknienia (Ryc. 6).
Implantacja PLG-Hyal wykazywała w dwunastym tygodniu obserwacji zbliżone cechy morfologiczne. Podobnie
jak w obserwacjach wcześniejszych, nieliczne komórki olbrzymie ujawniały cytoplazmatyczne dwójłomne
fragmenty, mogące odpowiadać fragmentom polimeru.
W odróżnieniu od PLG, tkanka łączna wykazywała
wzrost liczby fibroblastów, natomiast ilość włókien
łącznotkankowych nie wykazywała istotnych zmian.
Obrzeże chrząstki ogniskowo wykazywało zmiany
zwyrodnieniowe w postaci narastającej bazofilii istoty podstawowej, ogniskowej martwicy chondrocytów
z pozostawieniem wzmiankowanych bezjądrowych
resztek, przy braku jakiejkolwiek reakcji zapalnej.
W okolicy zmian martwiczych zauważalne były również
cechy regeneracji chrząstki pod postacią wyraźnej
warstwy chondroblastów, ułożonych pod mankietem
ochrzęstnej. Pozostałe odcinki chrząstki nie wykazywały zmian zwyrodnieniowych, chondrocyty zawierały
jądra komórkowe, a układ izogeniczny tych komórek
był prawidłowo zachowany (Ryc. 7).
2. Analiza statystyczna wybranych elementów
obrazu histologicznego implantów polimerowych
PLG i PLG-Hyal
Analiza statystyczna obejmowała ocenę półilościową, rangową obfitości nacieku zapalnego, obecności
komórek resorpcyjnych wielojądrowych, włóknienia
oraz waskularyzacji zmian. Z tego też powodu posłużono się statystyką nieparametryczną. Wyniki statystyki
opisowej, porównań oraz analizy korelacji zestawiono w poniższych tabelach. Zaobserwowano istotny
spadek intensywności nacieku zapalnego pomiędzy
analizowanymi grupami badanych polimerów w 4 tygodniu obserwacji. Grupa modyfikowanego polimeru,
PLG-Hyal wskazywała na wysoce istotną zależność
spadku obfitości nacieku zapalnego wraz z czasem,
aczkolwiek szybsze zmniejszanie się nacieku zapalnego
stwierdzano w grupie PLG przy zastosowaniu analizy
korelacji (tab. I). Zaobserwowano istotny spadek ilości
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
komórek resorpcyjnych wielojądrzastych pomiędzy
analizowanymi grupami badanymi. Analiza korelacji
wskazała na nieznamienność zależności obfitości tych
komórek od czasu, aczkolwiek proces nieco szybszy
zachodził w przypadku PLG-Hyal (tab. II). Jedynie
w pierwszym tygodniu obserwacji stwierdzono istotną
statystycznie zależność wskazującą na wyższe nasilenie
włóknienia w grupie PLG-Hyal. Oba z implantowanych
polimerów wykazują znamienną statystycznie korelację
pomiędzy czasem obserwacji a włóknieniem, przy czym
nieco szybszy proces włóknienia stwierdza się w grupie PLG (tab. III). Waskularyzacja blizny powstającej
w okolicy implantowanego polimeru nie wykazywała
istotnych statystycznie różnic. Oba z badanych polimerów wykazują znamienną i silną zależność pomiędzy
powstawaniem młodych naczyń dokoła ziarniniaków
resorpcyjnych a czasem obserwacji (tab. IV).
3. Ocena makroskopowa biomateriału
W całym okresie obserwacji zwierząt stwierdzono
makroskopowo prawidłowy proces wgajania obu biomateriałów polimerowych w tkankę chrzęstną małżowiny
usznej królików. Począwszy od pierwszego tygodnia od
zabiegu operacyjnego obserwowano dobre wrastanie
obu materiałów w miejsce ubytku tkanki chrzęstnej oraz zmianę barwy i struktury ich powierzchni.
W przypadku PLG obserwowano większą chropowatość i nierówność powierzchni materiału oraz zmianę
zabarwienia z białej na szarożółtą w odróżnieniu od
gładkiej i białej powierzchni PLG-Hyal, wykazującego
makroskopowo o wiele większe podobieństwo do tkanki
chrzęstnej. Stwierdzono całkowite wypełnienie ubytku
tkanki chrzęstnej przez oba biomateriały polimerowe,
brak cech stanu zapalnego i martwicy wokół rany pooperacyjnej przez cały okres obserwacji zwierząt.
Dyskusja
Od wielu lat prowadzone są prace nad możliwością
zastąpienia tkanki chrzęstnej materiałem syntetycznym. W przeprowadzonych badaniach własnych
wykorzystano dwa rodzaje biomateriałów resorbowalnych: kopolimer L-laktydu z glikolidem (PLG)
oraz PLG modyfikowany kwasem hialuronowym
(PLG-Hyal). Materiały te zostały zmodyfikowane
w zakresie mikrostruktury i chemicznej budowy
powierzchni w taki sposób, aby nadać im właściwości
chondrogenne, podtrzymujące adhezję chondrocytów
i dobrą integrację z tkankami otaczającymi. Właściwości biologiczne i cechy mechaniczne zastosowanych
w eksperymencie biomateriałów pozwalają przypuszczać, iż mogłyby one w skuteczny sposób zastąpić
rusztowanie chrzęstne przegrody nosa. W okresie obserwacji 12 tygodni od zabiegu u żadnego ze zwierząt
nie odnotowano cech nasilonego odczynu zapalnego.
Podobnie wskazywały doniesienia, w których badano
materiał akrylowy w połączeniu z kwasem poligliko-
69
70
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela I. Nasilenie nacieku zapalnego dokoła implantowanego polimeru.
GRUPA
Średnia
Liczba
przypadków
Mediana
Minimum
Maksimum
kwartyl
dolny
kwartyl
górny
Odchylenie
standardowe
Naciek zapalny
PLG
1 tydzień
5
5
5
5
5
5
5
0
PLG-Hyal
1 tydzień
4,6
5
5
4
5
4
5
0,55
Znamienność
p=0,133; p>0,05 NS
PLG
4 tydzień
5
5
5
5
5
5
5
0
PLG-Hyal
4 tydzień
4,4
5
4
4
5
4
5
0,55
Znamienność
p=0,049; p<0,05 S
PLG
12 tydzień
4,4
5
4
4
5
4
5
0,55
PLG-Hyal
12 tydzień
4
5
4
4
4
4
4
0
kwartyl
dolny
kwartyl
górny
Odchylenie
standardowe
Znamienność
p=0,133; p>0,05 NS
Tabela II. Obecność komórek resorpcyjnych wielojądrzastych dokoła implantowanego polimeru.
GRUPA
Średnia
Liczba
Przypadków
Mediana
Minimum
Maksimum
Komórki wielojądrzaste
PLG
1 tydzień
0
5
0
0
0
0
0
0
PLG-Hyal
1 tydzień
0
5
0
0
0
0
0
0
Znamienność
p=1,0; p>0,05 NS
PLG
4 tydzień
3,6
5
4
3
4
3
4
0,55
PLG-Hyal
4 tydzień
3,4
5
3
3
4
3
4
0,55
0,55
Znamienność
p=0,54; p>0,05 NS
PLG
12 tydzień
3,4
5
3
3
4
3
4
PLG-Hyal
12 tydzień
3
5
3
3
3
3
3
Znamienność
p=0,133; p>0,05 NS
lowym oraz poli-L-laktydem, stanowiącym stabilne
rusztowanie dla hodowli chondrocytów. Wykazano niewielki odczyn zapalny materiału akrylowego
w bezpośrednim kontakcie z otaczającą tkanką [6].
Analiza histologiczna preparatów wykazała, iż tkanki
otaczające implantowane polimery charakteryzowały
typowe sekwencje bliznowacenia, włącznie z odczynem zapalnym, zaś polimer modyfikowany kwasem
hialuronowym wyraźnie przyśpieszał proces resorpcji
i powstawanie blizny.
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela III. Nasilenie włóknienia dokoła implantowanego polimeru.
GRUPA
Średnia
Liczba
przypadków
Mediana
Minimum
Maksimum
kwartyl
dolny
kwartyl
górny
Odchylenie
standardowe
Włóknienie
PLG
1 tydzień
0
5
0
0
0
0
0
-
PLG-Hyal
1 tydzień
0,6
5
1
0
1
0
1
0,55
Znamienność
p=0,04; p<0,05 S
PLG
4 tydzień
0,4
5
0
0
1
0
1
0,55
PLG-Hyal
4 tydzień
0,6
5
1
0
1
0
1
0,55
Znamienność
p=0,54; p>0,05 NS
PLG
12 tydzień
0,6
5
1
0
1
0
1
0,55
PLG-Hyal
12 tydzień
1,2
5
1
1
2
1
1
0,45
Maksimum
kwartyl
dolny
kwartyl
górny
Odchylenie
standardowe
Znamienność
p=0,09; p>0,05 NS
Tabela IV. Tworzenie naczyń krwionośnych dokoła implantowanego polimeru.
GRUPA
Średnia
Liczba
przypadków
Mediana
Minimum
Unaczynienie
PLG
1 tydzień
0,4
5
0
0
1
0
1
0,55
PLG-Hyal
1 tydzień
0,6
5
1
0
1
0
1
0,55
Znamienność
p=0,54; p>0,05 NS
PLG
4 tydzień
0,4
5
0
0
1
0
1
0,55
PLG-Hyal
4 tydzień
0,8
5
1
0
1
1
1
0,45
Znamienność
p=0,22; p>0,05 NS
PLG
12 tydzień
1
5
1
1
1
1
1
PLG-Hyal
12 tydzień
1,4
5
1
1
2
1
2
Znamienność
0,55
p=0,13; p>0,05 NS
Podobne wyniki uzyskali Haisch i wsp., którzy
w badaniach in vivo i in vitro proponowali kombinację
autologicznych chondrocytów, bioresorbowalnych polimerów (PGLA-PLLA) oraz kleju fibrynowego. Wykazali,
iż klej fibrynowy w przeciwieństwie do struktury żelu
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
(np. agar) charakteryzuje się dużą biokompatybilnością
i opornością na infekcje, jednak nie gwarantuje morfologicznej stabilizacji podczas procesu hodowli in vitro.
Jednak w połączeniu z powierzchnią polimeru inicjuje
dystrybucję homogennych komórek chrzęstnych [7].
71
72
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
W badaniach własnych zaobserwowano szybsze
ustępowanie zmian zapalnych w pobliżu implantu
PLG-Hyal. Może to być związane z przyspieszeniem
procesu resorpcji oraz angiogenezy [8, 9]. Sam kwas
hialuronowy uznany jest także za regulator procesu
zapalnego. Jego forma wielkocząsteczkowa hamuje
odczyny zapalne, z kolei postać drobnocząsteczkowa
nasila proces zapalny [10].
Podsumowując, ocena własna obydwu materiałów polimerowych PLG i PLG-Hyal wykazała, iż
w jednakowym stopniu pozwalają one na odtworzenie
chrząstki, stanowiąc dobry materiał implantacyjny
w rekonstrukcji ubytków tkanki chrzęstnej w obrębie
twarzoczaszki.
4.
PIŚMIENNICTWO
8.
Puelacher WC, Mooney D, Langer R, Upton J, Vacanti JP,
Vacanti CA. Design of nasoseptal cartilage replacements
synthesized from biodegradable polymers and chondrocytes. Biomaterials 1994; 15(10): 774-778.
5.
Gugala Z, Gogolewski S. Differentiation, growth and activity of rat bone marrow stromal cells on resorbable poly
(L/DL-lactide) membranes. Biomaterials 2004; 25: 22992307.
6.
Kamil SH, Kojima K, Vacanti MP et al. In vitro tissue engineering to generate a human-sized auricle and nasal tip.
Laryngoscope 2003; 113: 90-94.
7.
Haisch A, Klaring S, Groger A, Gebert Ch, Sittinger M.
A tissue-engineering model for the manufacture of auricular-shaped cartilage implants. Eur Arch Otorhinolaryngol
2002; 259: 316-321.
1.
2.
ro S, Ribatti D. Accelerated wound healing of oral soft tis-
A tissue-engineering model for the manufacture of auricu-
sues and angiogenic effect induced by a pool of aminoa-
lar-shaped cartilage implants. Eur Arch Otorhinolaryngol
cids combined to sodium hyaluronate (AMINOGAMregister
2002; 259: 316-321.
mark or target). J Biol Regul Homeost Agents 2008; 22(2):
109-116.
Leiggener ChS, Curtis R, Muller AA, Pfluger D, Gogolewski S, Rahn BA. Influence of copolymer composition of
polyactide implants on cranial bone regeneration. Biomaterials 2006; 27: 202-207.
3.
Favia G, Mariggio MA, Maiorano F, Cassano A, Capodifer-
Haisch A, Klaring S, Groger A, Gebert Ch, Sittinger M.
9.
Ibrahim S, Ramamurthi A. Hyaluronic acid cues for functional endothelialization of vascular constructs. J Tissue
Eng Regen Med 2008; 2(1): 22-32.
Ma Z, Gao Ch, Gong Y, Shen J. Chondrocyte behaviors on
10. Krasiński R, Tchórzewski H. Hialuronian jako czynnik re-
poly-L-lactic acid (PLLA) membranes containing hydroxyl,
gulujący proces zapalenia. Post Hig Med Dośw 2007; 61:
amide or carboxyl groups. Biomaterials 2003; 24: 3725-
683-689.
3730.
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9