Zeszyt Koła Naukowego Studentów Biotechnologii

Transkrypt

Zeszyt Koła Naukowego Studentów Biotechnologii
numer 4
Kraków 2013
1
Zespół redakcyjny:
Jan M ajta
M aciej Bąk
Katarzyna Ciuba
M agdalena Szczygieł
M arta Tempes
Katarzyna Wajda-N ikiel
Okładka:
M onika Filipiak
Skład:
Jan M ajta
Korekta:
Zesp ół Redakcyjny
Wydawca: KN SB M ygen
N akład: 250
Kontakt:
jan. majta@gmail. com
ISSN : 1899-5535
Sfinansowane przez:
2
Od redakcji
D RODZY CZYTELNICY,
Wraz z czwartym numerem zeszytu Koła Nukowego Studentów Biotechnologii Mygen postanowiliśmy wypłynąć na szerokie wody. W
aktualnym numerze znajdują się pierwsze artykuły które powstały poza naszą Alma Mater.
Pragniemy w związku z tym ogłosić, że jesteśmy
prawdopodobnie pierwszym ogólnopolskim studenckim czasopismem naukowym z zakresu biotechnologii i nauk pokrewnych! Jak w każdym
naszym numerze treści artykułów są mocno
zróżnicowane, dzięki czemu każdy czytelnik
znajdzie interesujące treści.
Silnie reprezentowana w czwartym wydaniu naszego czasopisma jest grupa dr hab. Justyny
Drukały z Pracowni Inżynierii Tkankowej wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii. Temat komórek macierzystych naskórka przybliża
Łukasz Sabat, natomiast Katarzyna Dziedzic,
laureatka tegorocznego sympozjum "Symbioza",
opisuje przedmiot swoich badań czyli hodowlę
chondrocytów. Także grupa dr hab. Martyny
Elas z tego samego wydziału szeroko prezentuje
swoje zainteresowania - Katarzyna Jasińska waży zalety i wady terapii protonowej, natomiast
Joanna Massapust przybliża problem nowotworowych komórek macierzystych.
Dla osób chcących poszerzać swoje umiejętności
laboratoryjne polecamy metodyczne prace Marty
Seczyńskiej oraz Katarzyny Barańskiej dotyczące
kolejno elektroforezy 2D oraz cytometrii przepływowej. Jeśli natomiast pragniecie poszerzyć
swoją wiedzę w kwestiach związanych z nowotworzeniem polecamy artykuły Mateusza Kucharczyka oraz Mateusza Mendla. Koneserzy
biologii strukturalnej mogą natomiast zainteresować się publikacją Adama Górki na temat białek nieustrukturyzowanych. Osobom które nie
szukają konwencjonalnych metod polecamy artykuł Katarzyny Chamery o potencjale grzybów
w terapii wielu chorób.
Na koniec pozostawiliśmy sekcję Kół Naukowych, w której prezentujemy artykuł Studenckiego Koła Naukowego Biotechnologów z
Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu który opisuje sposób zagospodarowania odpadów
jako potencjalnego źródła energii, oraz artykuł
naszego Koła "Mygen" który prezentuje narzędzie, które umożliwia osobom bez znajomości
zagadnień bioinformatycznych korzystanie z
techniki dynamiki molekularnej.
Życzymy więc wszystkim owocnej lektury i zważając na porę roku dobrego wypoczynku!
JAN M AJTA
Z życia Koła
Walnym Zebraniem 13 czerwca 2013 Koło Naukowe Studentów Biotechnologii Mygen podsumowało swoją tegoroczną działalność i wybrało
nowy Zarząd na rok 2013/14 w składzie: prezes:
Maciej Bąk, wiceprezesi: Jan Majta i Dawid Żyła,
skarbnik: Róża Pietrzycka.
Głównym osiągnięciem Mygenu w minionym semestrze było wydanie trzeciego numeru zeszytu
naukowego Acta Mygenica. Jest to wydawnictwo
mające na celu
umożliwianie studentom biotechnologii i kierunków
pokrewnych prezentowanie swoich
zainteresowań badawczych - zarówno
wyników własnej
pracy, jak i artykułów przeglądowych na wybrany temat. Obecnie przygotowywany jest czwarty
numer, a jego wydanie planowane jest na lipiec
2013. Poprzednie zeszyty są dostępne w formie
elektronicznej na stronie internetowej Koła.
W dniach 19-21 kwietnia odbyła się Trzecia Studencka Konferencja Matematyczno-Informatyczno-Biologiczna „Liczby-Komputery-Życie”. Jest
to wspólny projekt KNSB Mygen, Koła Studen-
tów Biofizyki Nobel, Koła Matematyków Studentów UJ i Koła Studentów Informatyki UJ. Jego
celem jest zapoznanie studentów z dostępnymi
technikami i praktycznymi zastosowaniami matematyki i informatyki w naukach biologicznych.
Podczas konferencji wykłady przeprowadzili zaproszeni goście, odbyły się także prezentacje
studenckie i konkurs posterów.
Kolejnym dużym wydarzeniem w życiu Koła był
cosemestralny wyjazd naukowo-integracyjny.
Tym razem w dniach 24-26 maja mieliśmy okazję pojechać do Gródka nad Dunajcem, gdzie
swoje prezentacje wygłosili prof. Alicja Józkowicz oraz dr Dominik Czaplicki, który dodatkowo przeprowadził warsztaty pracy grupowej.
Wieczory natomiast spędzano przy tradycyjnym
ognisku z gitarą i śpiewem.
Podczas okresu wakacyjnego nowo wybrany Zarząd zajmie się opracowaniem planu pracy na
rok akademicki 2013/2014, by na następnym
Walnym Zebraniu, które odbędzie się 10 października, zaskoczyć bogatą ofertą kierowaną
zarówno do członków Koła, jak i pozostałych
studentów Wydziału.
Jesteśmy też na facebook.com/mygenuj
3
4
Spis treści:
Terapia Protonowa - przyjaciel czy wróg ?
Jasińska Katarzyna
7
Analiza obrazów żeli dwukierunkowej elektroforezy czyli słów kilka o wyzwaniach
proteomiki
Seczyńska Marta
12
Cytometria przepływowa jako narzędzie do oznaczania jądrowego DNA w komórce
roślinnej
Barańska Katarzyna
17
Hodowla chondrocytów in vitro i jej wykorzystanie w medycynie regeneracyjnej
Dziedzic Katarzyna
23
Charakterystyka komórek macierzystych naskórka
Sabat Łukasz
29
Rola Białka Oporności Raka Piersi w transporcie ksenobiotyków
Kucharczyk Mateusz
34
Rola nowotworowych komórek macierzystych w kancerogenezie, rozwoju i terapii
nowotworów
Massapust Joanna
38
Janusowe oblicze Nrf2: rola w procesach nowotworowych
Mendel Mateusz
43
Co nam dziś powie sekwencja? Przewidywania struktury drugorzędowej oraz rejonów
samoistnie nieuporządkowanych białek na podstawie sekwencji aminokwasowej
Górka Adam
50
Aktywność biologiczna glukanów pochodzenia grzybowego
Chamera Katarzyna
53
Produkcja bioetanolu jako potencjalny sposób zagospodarowania odpadów
ligninocelulozowych z wykorzystaniem grzybów strzępkowych
Bańcyr Edyta, Chałupka Kinga, Lisiecka Dorota, Piegza Michał
57
MYGENerator - narzędzie do zautomatyzowanego i uproszczonego korzystania
z pakietu GROMACS
Majta Jan, Bąk Maciej, Krutyhołowa Rościsław
64
5
6
TEREPIA PROTONOWA - PRZYJACIEL CZY WRÓG?
Katarzyna Jasińska
Zakład Biofizyki
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii
Uniwersytet Jagielloński
katarzyna. jasinska87@gmail. com
Praca napisana pod opieką: dr hab. M artyny Elas
Streszczenie: W ostatnich latach terapia protonowa staje się coraz bardziej popularnym
narzędziem w walce z nowotworami. Dzięki specyficznemu osadzaniu się energii, znanemu
jako pik Bragga, możliwe jest dokładne namierzenie tkanki nowotworowej na konkretnej
głębokości, oszczędzając przy tym tkankę zdrową. Wiązkę protonów zalicza się do
promieniowania o niskim LET, chociaż jej efekty biologiczne nieznacznie różnią się od
efektów spowodowanych przez inne rodzaje promieniowania o niskim LET, takim jak
promieniowanie γ. Pośród uszkodzeń DNA najbardziej powszechne są uszkodzenia zasad a
także uszkodzenia jednej nici (SSB) oraz obu nici (DSB). Generowane są reaktywne formy
tlenu, jednak jest to zjawisko o mniejszym nasileniu w porównaniu z promieniowaniem
fotonowym. Zaobserwowano też wysoką frakcję apoptotyczną po zastosowaniu różnych
dawek promieniowania wiązką protonów. Odpowiedź na terapię protonową na poziomie
tkankowym obejmuje efekt antyangiogenny oraz zmiany poziomów wielu czynników
zaangażowanych m.in. w proces zapalny czy migrację komórek. Obecnie na świecie
istnieje ponad 30 centrów terapii protonowej, w których przeprowadza się terapię różnych
typów nowotworów, np. czerniak oka, rak prostaty, płuc, wątroby, mózgu, przełyku oraz
chłoniak.
Wstęp
Początki terapii protonowej sięgają połowy XX
wieku, kiedy to fizyk R.R. Wilson zwrócił uwagę
na różnice pomiędzy właściwościami fizycznymi
protonów a fotonów o wysokiej energii (np. promieniowanie γ czy X). W 1956 roku zaproponował on wykorzystanie wiązki protonowej
w leczeniu pacjentów [1]. Zastosowanie radioterapii z modulacją intensywności wiązki (IMRT)
daje możliwość bardziej efektywnego dostarczania odpowiedniej dawki promieniowania fotonów
do chorej tkanki, jednak nadal istnieją czynniki
ograniczające jej dalszą poprawę. Podczas przemieszczania się wiązki fotonów przez ciało pacjenta następuje jej wykładnicza absorpcja,
przez co tkanki umiejscowione przed tkanką nowotworową otrzymują większą dawkę niż nowotwór. Dlatego w celu uniknięcia napromieniania
wrażliwych organów i dostarczenia skutecznej
dawki do nowotworu konieczne jest naświetlanie
po wieloma kątami. Innym problemem jest liniowy transfer energii fotonów (LET), który charakteryzuje się dużymi wartościami na początku
drogi fotonów, czyli przy wejściu cząstek do
tkanki [2].
Właściwości wiązki protonowej
W przypadku wiązki fotonów obserwujemy silny
efekt w pierwszych kilku centymetrach i nastę-
pujący po nim wykładniczy spadek w ilości dawki wraz z głębokością tkanki. Natomiast wiązka
protonowa charakteryzuje się odwrotnym przebiegiem, z niską absorpcją energii na początku i
maksymalną na końcu przebiegu cząstki, gdzie
dostarczona dawka jest wysoka [3]. Obszar ten
nazywany jest pikiem Bragga (rys.1). Dla danej
cząstki głębokość położenia oraz wielkość piku
zależą od jej początkowej energii [4]. Aby objąć
całą objętość guza nowotworowego niezbędne
jest rozszerzenie piku Bragga, co uzyskuje się
przez superpozycję wielu pików Bragga dla wiązek cechujących się różnymi energiami. Otrzymany z tego złożenia płaski obszar to
rozszerzony pik Bragga (Spread Out Bragg Peak
SOBP).
Liniowy transfer energii (LET) definiuje utratę
energii przez cząstkę na jej drodze [3]. Jednakże
średnica toru różnych cząstek nie jest proporcjonalna do LET, ale zależy od energii cząstki
(rys. 2), przez co gęstość jonizacji jest różna dla
różnych cząstek o tym samym LET.
LET wiązek protonowych zazwyczaj wykorzystywanych do terapii wynosi 65-260 MeV. Przy wejściu do skóry wartość ta wynosi ~0.4-1.0
keV/μm. Protony charakteryzują się niskim LET
do momentu, aż znajdą się blisko końca swojego
zasięgu. Na ostatnich kilku mikronach LET silnie wzrasta do ~100 keV/ μm, przez co uwolnio-
7
Jasińska K. „Terapia Protonowa - przyjaciel czy wróg ?” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
Rys. 1 . Dystrybucja dawki w zależności od głębokości tkanki
dla fotonów, jonów węgla oraz protonów [3].
na jest energia o większej gęstości [1, 5] i to
właśnie ta cecha jest wykorzystywana w terapii
przeciw nowotworom [6, 7].
Rys. 2. LET vs energia wiązki protonowej [1 ].
Istotnym czynnikiem, na jaki należy zwrócić
uwagę, jest względna skuteczność biologiczna
(RBE), która określa skuteczność oddziaływania
danego promieniowania względem promieniowania referencyjnego (np. X lub γ). RBE nie jest
wartością stałą, ale zależy od wielu parametrów
fizycznych, jak typ cząstek i energii, frakcjonowanie dawki, a także biologicznych obejmujących zdolności naprawcze organizmu, w tym typ
komórek czy utlenowanie [1, 3, 8]. Doniesiono,
że wiązki terapeutyczne protonów mają RBE
wynoszące około 1.1-1.2 [1, 9]. Pomimo jednak
dobrze znanych właściwości fizycznych protonów, wiele własności biologicznych pozostaje
niezbadanych.
Uszkodzenia DNA
Promieniowanie jonizujące może indukować
uszkodzenia DNA przez działanie bezpośrednie
(efekt tarczy) lub pośrednie, gdzie dochodzi do
wytwarzania rodników hydroksylowych atakujących DNA. Szacuje się, że dla promieniowania o
niskim LET ROS są odpowiedzialne za 60-70%
całkowitych uszkodzeń DNA, zaś pozostałe 3040% jest wynikiem bezpośredniego oddziaływa-
8
nia elektronu z DNA [10, 1]. Napromienianie
protonami (20 MeV) komórek raka wysiękowego
Ehrlicha prowadziło do dużej produkcji wolnych
rodników i zwiększonej peroksydacji lipidów [1].
Do najczęściej występujących uszkodzeń DNA
po terapii protonowej zalicza się uszkodzenia
zasad, uszkodzenia pojedynczej nici (SSB) i obu
nici DNA (DSB).
Uszkodzenia dwóch nici w cząsteczce DNA są
groźne, ponieważ mogą one prowadzić do fragmentacji chromosomu, utraty jego fragmentów i
translokacji [12]. W odpowiedzi na nie komórki
aktywują wyszukane mechanizmy naprawcze,
jak łączenie niehomologicznych zakończeń
(NHEJ) czy rekombinacja homologiczna, obejmujące różne ścieżki sygnałowe [12, 13]. Wrażliwość komórki na indukcję DSB może mieć
związek z lokalną strukturą chromatyny, co zostało pokazane dla promieniowania jonizującego
o niskim LET [14], oraz z mechanizmem, przez
który są one wywoływane [15, 16]. Stwierdzono,
że dla otrzymania efektu letalnego potrzebna
była produkcja 1000 SSB, wywołanych przez
promieniowanie jonizujące, ale w przypadku
działania nadtlenkiem wodoru potrzebne było
400,000 SSB [17]. Porównywano też ilość delecji
w genie gpt transgenicznych myszy, naświetlanych promieniami X, γ oraz ciężkimi jonami.
Traktowanie zwierząt ciężkimi jonami prowadziło do powstania delecji przekraczających 1000
par zasad, podczas gdy po pozostałych naświetlaniach wynik był poniżej 100 par zasad [18].
Protony są bardziej efektywne w produkcji DSB
niż promieniowanie fotonowe czy też promieniowanie X. Pomiar wielkości tych uszkodzeń mierzono za pomocą monitorowania rekrutacji
γ-H2AX do miejsca uszkodzenia. Zauważono
wzrost rekrutacji γ-H2AX już po 30 minutach po
traktowaniu protonami (wartość LET 2.2
keV/μm) [1].
Jednakże istnieje możliwość powstania regionów
z wieloma różnymi uszkodzeniami, jak pęknięcie
nici, miejsca pozbawione zasad azotowych czy
też zawierające utlenione zasady, znajdujących
się na jednej lub dwóch przeciwległych niciach
DNA. Te obszary, znane jako klastry (ang. clustered lesions, CL), uważa się za główne przyczyny zarówno letalnych, jak i mutagennych
efektów promieniowania jonizującego [1, 19,
20]. Możliwe jest istnienie klastrów, w których
blisko DSB znajduje się uszkodzenie oksydacyjne. Uważa się, że występują one w DNA komórek napromienianych, zwłaszcza w przypadkach
gdzie LET cząstek naświetlania wzrasta, ponieważ im wyższy LET, tym bardziej gęsta ścieżka
jonizacji, przez co większe jest prawdopodobieństwo produkcji kompleksowych rejonów uszkodzeń w DNA [17]. Podejrzewa się również, że do
powstawania DSB mogą przyczyniać się połączenia krzyżowe między niciami (ang. interstrand cross-links, ICL), gdzie dwie nici DNA są
połączone kowalencyjnie. Te połączenia uniemożliwiają separację nici DNA, przez co utrud-
nione są procesy replikacji i transkrypcji. Poza
tym donosi się, że naprawa ICL ma związek z
większą generacją DSB. Jednakże uszkodzenia
ICL wciąż pozostają w polu badań [16, 21-23].
Do najczęściej używanych metod identyfikacji
klasterów należą: barwienie immunologiczne,
metoda kometowa (Commet assay), hybrydyzacja, metoda FAR oraz metoda naciętego plazmidu (plazmid nicking assay) [10, 17].
Śmierć komórek
Komórki eukariotyczne pod wpływem promieniowania jonizującego aktywują wiele ścieżek w
celu opóźnienia progresji cyklu komórkowego.
Zaobserwowano przy tym występowanie przedłużonego zahamowania cyklu komórkowego i
opóźnienia w naprawie DSB, zjawisko katastrofy
mitotycznej prowadzącej do utraty zdolności reprodukcyjnych przez komórki, a także inicjację
ścieżki apoptozy [1, 23-25].
Po terapii protonowej powstałe uszkodzenia
DNA aktywują DNA-PK oraz ATM (kinazy serynowo treoninowe), które wzmacniają i przekazują sygnał poprzez aktywację kolejnych kinaz, a
te z kolei fosforylują docelowe białka, takie jak
p53, Cdc25, co prowadzi do opóźnienia cyklu
komórkowego [23, 26]. Analizowano inaktywacje
komórki przez promieniowanie jonizujące dla
różnych wartości LET. Wykazano, że promieniowanie jonizujące o wartości LET około 100
keV/μm bardziej efektywnie uśmierca komórki i
indukuje mutacje niż promieniowanie o niskim
LET. Odnotowano taki efekt w komórkach linii
V79 zarówno w przypadku apoptozy, jak i śmierci reprodukcyjnej. Natomiast promieniowanie
jonizujące o wysokim LET jest w stanie wywołać
większą apoptozę w komórkach raka płuc niezależnie od statusu p53 [27, 28]. Traktowaniu komórek LLC i HepG2 protonami (35 MeV) o
pojedynczej dawce 10 Gy wykazało ich większą
wrażliwość poprzez indukcję kaspazy 3 i 9, w
porównaniu do traktowania promieniowaniem γ
[29]. Okazało się również, że po promieniowaniu
γ następowało znaczne opóźnienie w indukcji
apoptozy, czego nie obserwowano po protonach
(12 Gy) [30]. Ponadto zauważono, że protony (10
Gy, 26.7 MeV) aktywowały mitochondrialną
ścieżkę apoptotyczną i powodowały zatrzymanie
cyklu komórkowego na granicy G2/M. Z kolei w
tej populacji naświetlanych komórek nie było
znaczących zmian we frakcji nekrotycznej, ale
zwiększenie dawki do 40 Gy było przyczyną pojawienia się dużych obszarów nekrotycznych
[31].
Zaobserwowano ponad dwukrotnie silniejszą indukcję apoptozy w nowotworowej linii MOLT4
po naświetlaniu wiązką protonów w obszarze
SOBP (średni LET 2.2 keV/μm), w odniesieniu do
traktowania promieniami X (10 MeV) w podobnych dawkach. Podobny efekt utrzymuje się przy
porównaniu działania fotonów z protonami (te
same dawki) [1, 31]. Ponadto badania na linii
ludzkiej melanomy HTB140 wykazały obecność
dużej, istotnej statystycznie, frakcji apoptotycznej komórek sięgającej 25%, po dawce 16 Gy
[32].
Poza badaniami frakcji apoptotycznej komórek
zwrócono też uwagę na mechanizmy i sygnały
wprowadzające komórki na szlak apoptozy. Di
Petro et al. [31] badał poziomy mRNA dla genów
proapoptotycznych, takich jak p21 i Bax, w liniach komórkowych PC-3, MCF-7 oraz Ca301D.
Po terapii protonowej (26.7 MeV) następował
często wielokrotny wzrost mRNA tych genów w
stosunku do komórek traktowanych takimi samymi dawkami promieniowani fotonowego. W
ostatnim czasie zainteresowano się białkiem
SAG, powodującym inhibicję apoptozy indukowanej przez ROS, co zaobserwowano w modelach komórkowych in vitro. Podczas badań roli
SAG na liniach PC3 i U937 stwierdzono ochronny wpływ białka na komórki w indukowanych
promieniowaniem jonizującym stresie oksydacyjnym i apoptozie [33]. Ścieżki sygnalizacyjne
p38, JNK i MAP okazały się krytyczne dla indukcji apoptozy pod wpływem promieniowania protonowego, podczas gdy nie obserwowano
aktywacji ścieżki ERK, której to aktywacja jest
typowa dla promieniowania gamma [1, 30].
Wpływ terapii protonowej na inne komponenty komórkowe
Efektywność terapii protonowej zależy nie tylko
od reakcji naświetlanych komórek, ale także od
interakcji pomiędzy komórkami nowotworowymi
a komórkami gospodarza i mikrośrodowiskiem.
Należy przy tym zauważyć, że radioterapia nie
wpływa jedynie na komórki nowotworu, ale oddziałuje również z innymi komórkami organizmu, takimi jak komórki śródbłonka, układu
immunologicznego oraz z macierzą zewnątrzkomórkową.
Pośród różnych typów radioterapii bardzo dobrze przebadano efekty in vivo działania fotonów, gdzie ustalono, że promują one
angiogenezę i wspomagają proces przerzutowania komórek nowotworowych [3, 34, 35]. Dzieje
się tak między innymi poprzez wzmożone uwalnianie czynników pro-angiogennych, jak VEGF,
IL-6, HIF-1α oraz bFGF [1, 36, 37]. Jednakże badania protonów na tym polu są ograniczone. Zaobserwowano, że promieniowanie protonowe o
niskim LET (dawka 0.5 – 2 Gy) znacząco obniża
poziomy VEGF, IL-6, IL-8 i HIF-1α w komórkach
nowotworowych ludzkich i mysich in vitro, zaś
analiza tkanek myszy C57BL/6 po napromienianiu całego ciała (1 GeV, 0.5 – 5 Gy) wykazała
mniejsze poziomy VEGF i MMP-9 w stosunku do
kontroli [1]. Z kolei naświetlanie transgenicznych embrionów Danio pręgowanego (35 MeV)
spowodowało zależne od dawki zahamowanie
tworzenia i rozwoju naczyń krwionośnych [38].
9
Badań przeprowadzone z udziałem pacjentów z
melanoma oka, pokazują zahamowanie tworzenia nowych naczyń w naświetlanej części tęczówki, podczas gdy w 8 z 11 przypadków
nastąpił proces neowaskularyzacji w nienaświetlanej części tęczówki [39].
Zmiany po terapii protonowej są również widoczne w przypadku migracji i adhezji komórek,
co obejmuje zmiany w glikoproteinach na powierzchni komórek, odpowiadających za przyleganie komórek do siebie oraz do macierzy
zewnątrzkomórkowej. Nie bez znaczenia pozostają także zmiany w poziomach metaloproteinaz zdolnych do degradacji macierzy.
Analizowano ludzką linię włókniakomięsaka
HT1080 po promieniowaniu protonowym (dawki: 0.5, 2 i 8 Gy). Komórki wykazywały mniejszą,
zależną od dawki, zdolność do migracji i inwazji
oraz silną inhibicję aktywności MMP-9. Ponadto
w badaniach in vivo zaobserwowano mniejszą
liczbę przerzutów w płucach, co wskazuje na
niższy potencjał metastatyczny nawet przy
mniejszych dawkach, w czasie gdy działanie fotonów promowało zdolność komórek do inwazji
[40]. Podobne efekty obserwowano także w innych typach komórek. Linie ECV304 i HUVEC
po naświetlaniu wiązką jonów węgla (290 MeV)
cechowały się zahamowaną adhezją i migracją
do witronektyny lub osteoponiny oraz zmniejszoną aktywnością MMP-2 i integryny αVβ3 [41].
Terapia protonowa ma wpływ na przejście nabłonkowo – mezenchymalne (EMT), które odpowiada za konwersję komórek nabłonkowych do
fenotypu komórek mezenchymalnych, przez co
odgrywa istotną rolę w migracji, a także w przerzutowaniu. EMT jest indukowane przez TGF-β1
w komórkach Mv1Lu i EPC. Chociaż sam TGF-β1
jest zdolny indukować EMT, to protony (5 MeV,
dawka 0.1 Gy) zwiększają efektywność tego procesu [42].
Badania odpowiedzi immunologicznej po protonach sugerują wystąpienie słabszej reakcji zapalnej u pacjentów traktowanych tylko
protonami w porównaniu z tymi, którzy byli leczeni zarówno protonami, jak i fotonami [1]. Natomiast dane na temat poziomu czynników pro- i
antyzapalnych są nieco zróżnicowane. Nie zauważono zmian poziomu TGF-β po terapii protonowej, ale w zależności od przeprowadzonego
eksperymentu mamy do czynienia albo z brakiem zmian albo ze zwiększonymi poziomami
czynników, jak TNF-α, IL-1β czy IL-6 [1].
Piśmiennictwo:
[1] Girdhani, S et al. “Biological Effects of Proton Radiation: What We
Know and Don’t Know.” Radiation Reserarch; 2013.
[2] Rong, Y et al. “Basics of Particle Therapy II Biological and Dosimetric
Aspects of Clinical Hadron Therapy.” American Journal of Clinical
Oncology; 2009.
[3] Fokas, E et al. “Ion Beam Radiobiology and Cancer: Time to Update
Ourselves.” Biochimica et biophysica acta; 2009.
[4] Kramer, M et al. “The increased biological effectiveness of heavy
charged particles:
from radiobiology to treatment planning.”
10
Próby kliniczne
Radioterapia protonowa prowadzona na całym
świecie od lat 60-tych dostarcza wielu obserwacji, które różnią się między sobą pod względem
całkowitej dostarczanej dawki i geometrycznej
dystrybucji dawki, przez co porównywanie jej
efektywności jest utrudnione. Jednakże należy
zwrócić uwagę na kilka prac, dzięki którym możemy mieć lepszy obraz wpływu terapii na pacjenta.
Radioterapię protonową wykorzystuje się przede
wszystkim do leczenia czerniaka oka. Przeżywalność pacjentów 5 lat po terapii waha się od
79% nawet do 90.6% [43-45], co pokazuje, że
stosowanie terapii zapewnia bardzo dobrą lokalną kontrolę nowotworu. Terapia protonowa w
leczeniu nowotworów gałki ocznej jest też stosowana w Krakowie, w Instytucie Fizyki Jądrowej
PAN, z wykorzystaniem izochronicznego cyklotronu AIC-144 [46]. Niedawna meta-analiza porównania
efektywności
konwencjonalnej
radioterapii i terapii protonowej niedrobnokomórkowego raka płuc (NSCLC) pokazała znacząco wyższą przeżywalność pacjentów w ciągu
5 lat po terapii (40%) w porównaniu do terapii
konwencjonalnej (20%) [47].
Wraz z rozwojem terapii protonowej zaczęto
zwracać większą uwagę na możliwość wystąpienia nowotworów drugorzędowych, będących wynikiem naświetlania. Nie ma na ten temat
jeszcze danych z randomizowanych badań, ale
istnieją przesłanki, że terapia protonowa zmniejsza ryzyko pojawienia się drugorzędowych nowotworów w porównaniu do konwencjonalnej
radioterapii [1, 48].
Wnioski
Terapia protonowa zawdzięcza swą wyższość
nad konwencjonalną radioterapią dzięki precyzji
dostarczania wyższej dawki do tkanki nowotworowej i zdecydowanie niższej do tkanek otaczających nowotwór. Jest to możliwe dzięki
fizycznym właściwościom protonów, a w szczególności SOBP, który niesie jednolitą dawkę do
miejsca docelowego. Radioterapia protonowa,
choć od dawna stosowana klinicznie i dobrze
przebadana na poziomie uszkodzeń komórkowych, nadal wymaga uzupełnienia danych eksperymentalnych, mówiących o skutkach
biologicznych w układach modelowych in vivo.
Stanowi obiecujące narzędzie otwierające nowy
etap radioterapii nowotworów.
Technology in Cancer Research and Treatment; 2002.
[5] Raju, MR “Proton Radiobiology, radiosurgery and radiotherapy.”
International Journal of Radiation Bioogy. 2005.
[6] Jones B. “The potential clinical advantages of charged particle
radiotherapy using protons or light ions.” Clinnical Oncology; 2007.
[7] Durante, M et al. “Charged particles in radiation oncology.” Nature
Reviews Clinical Oncology; 2008.
[8] Belli, M et al. “Inactivation of Human Normal and Tumour Cells
Irradiated with Low Energy Protons.” International journal of radiation
biology; 2008.
[9] Gridley, DS et al. “Comparison of Proton and Electron Radiation
Effects on Biological Responses in Liver, Spleen and Blood.” International
journal of radiation biology; 2010.
[10] Hada, M et al. “Formation of Clustered DNA Damage After High-LET
Irradiation: A Review.” Journal of Radiation Research; 2007.
[11] Feinendegen, LE et al. “Responses to Low Doses of Ionizing
Radiation in Biological Systems.” Nonlinearity in biology, toxicology,
medicine; 2004.
[12] Brugmans, L et al. “Analysis of DNA Double-strand Break Repair
Pathways in Mice.” Mutation research; 2006.
[13] Menegakis, A et al. “Prediction of Clonogenic Cell Survival Curves
Based on the Number of Residual DNA Double Strand Breaks Measured
by gammaH2AX Staining.” International journal of radiation biology;
2008.
[14] Falk, M et al. Chromatin structure influences the sensitivity of DNA
to gamma-radiation. Biochimica et Biophysica Acta; 2007.
[15] Ježková, L et al. “Function of Chromatin Structure and Dynamics in
DNA Damage, Repair and Misrepair: Γ-rays and Protons in Action.”
Applied radiation and isotopes  : including data, instrumentation and
methods for use in agriculture, industry and medicine; 2002.
[16] Dextraze, M et al. “DNA Interstrand Cross-links Induced by Ionizing
Radiation: An Unsung Lesion.” Mutation research; 2002.
[17] Sage, E et al. “Clustered DNA Lesion Repair in Eukaryotes:
Relevance to Mutagenesis and Cell Survival.” Mutation research; 2000.
[18] Allen, C et al. „Heavy charged particle radiobiology: using enhanced
biological effectiveness and improved beam focusing to advance cancer
therapy”. Mutation research; 2011.
[19] Belli, M et al. “DNA Double Strand Break Production and Rejoining in
V79 Cells Irradiated with Light Ions.” Advances in space research  : the
official journal of the Committee on Space Research (COSPAR); 1996.
[20] Terato, H et al. “Analysis for Complexity of Clustered DNA Damage
Generated by Heavy Ion Beams.” Nucleic acids symposium series (2012;
2008.
[21] Noll, DM et al. “Formation and repair of interstrand cross-links in
DNA.” Chemical Review; 2005.
[22] Rothfuss, A et al. “Repair kinetics of genomic interstrand DNA crosslinks: evidence for DNA double-strand break-dependent activation of the
fanconi anemia/BRCA pathway,” Molecular and Cellular Biology; 2003.
[23] Sczepanski, JT et al. “Double-strand break formation during
nucleotide excision repair of a DNA interstrand cross-link.” Biochemistry;
1998.
[23] Ghosh, S et al. “Low Energy Proton Beam Induces Efficient Cell
Killing in A549 Lung Adenocarcinoma Cells.” Cancer investigation; 2010.
[24] Goto, S et al. “Delayed cell cycle progression in human
lymphoblastoid cells after exposure to high-LET radiation correlates with
extremely localized DNA damage.” Radiation Research; 2002.
[25] Ianzini, R et al. “Mitotic Catastrophe Induced by Exposure of V79
Chinese Hamster Cells to Low-energy Protons.” International Journal of
Radiation Biology; 1999.
[26] Lakin, ND et al. “Regulation of p53 in response to DNA damage.”
Oncogene; 1999.
[27] Tsuboi, K et al. “Cell Cycle Checkpoint and Apoptosis Induction in
Glioblastoma Cells and Fibroblasts Irradiated with Carbon Beam.” Journal
of Radiation Research; 2007.
[28] Takahashi, A et al. “High-LET radiation enhanced apoptosis but not
necrosis regardless of p53 status.” International Journal of Radiatiation
Oncology, Biology and Physic; 2004.
[29] Lee KB et al. “Low energy proton beam induces tumor cell apoptosis
through reactive oxygen species and activation of caspases.”
Experimental & Molecular Medicine; 2008.
[30] Green LM et al. “Response of Thyroid Follicular Cells to Gamma
Irradiation Compared to Proton Irradiation. I. Initial Characterization of
DNA Damage, Micronucleus Formation, Apoptosis, Cell Survival, and Cell
Cycle Phase Redistribution.” Radiation Research; 2001.
[31] Pietro, C D et al. “Cellular and Molecular Effects of Protons  :
Apoptosis Induction and Potential Implications for Cancer Therapy.”
Apoptosis  : an international journal on programmed cell death; 2006.
[32] Ristic-Fira, AM et al. “Response of a Human Melanoma Cell Line to
Low and High Ionizing Radiation.” Annals of the New York Academy of
Sciences; 2007.
[33] Kim, Sung Youl et al. “Sensitive to Apoptosis Gene Protein Regulates
Ionizing Radiation-induced Apoptosis.” Biochimie; 2011.
[34] Moeller, BJ et al. “Radiation activates HIF-1 to regulate vascular
radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress
granules.” Cancer Cell; 2004.
[35] Park CM et al. “Ionizing radiation enhances matrix
metalloproteinase-2 secretion and invasion of glioma cells through
Src/epidermal growth factor receptor-mediated p38/Akt and
phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathways.” Cancer Research;
2006.
[36] Geng, L et al. “Inhibition of vascular endothelial growth factor
receptor signaling leads to reversal of tumor resistance to radiotherapy.”
Cancer research; 2001.
[37] Yoshimura, T et al. “Monocyte Chemoattractant Protein-1/CCL2
Produced by Stromal Cells Promotes Lung Metastasis of 4T1 Murine
Breast Cancer Cells.” PLoS ONE; 2013.
[38] Jang, GH et al. “Effect of proton beam on blood vessel formation in
early developing zebrafish (Danio rerio) embryos.” Archives of
pharmacal research; 2008.
[39] Boyd, SR et al. “Proton beam therapy and iris neovascularisation in
uveal melanoma.” Eye (London, England); 2006.
[40] Ogata, T et al. “Particle irradiation suppresses metastatic potential
of cancer cells.” Cancer research; 2005.
[41] Takahashi, Y et al. “Heavy Ion Irradiation Inhibits in Vitro
Angiogenesis Even at Sublethal Dose Heavy Ion Irradiation Inhibits in
Vitro Angiogenesis Even at Sublethal Dose 1.” In Vitro; 2003.
[42] Wang M et al. “Protons sensitize epithelial cells to mesenchymal
transition.” PloS one; 2012.
[43] Dendale, R et al. “Proton beam radiotherapy for uveal melanoma:
results of Curie Institut-Orsay proton therapy center (ICPO).”
International journal of radiation oncology, biology, physics; 2006.
[44] Egger, E et al. “Eye retention after proton beam radiotherapy for
uveal melanoma.” International Journal of Radiation Oncology; 2003.
[45] Egger, E et al. “Maximizing local tumor control and survival after
proton beam radiotherapy of uveal melanoma.” International journal of
radiation oncology, biology, physics; 2001.
[46] Michalec, B et al. “Proton radiotherapy facility for ocular tumors at
the IFJ PAN in Kraków Poland.” Applied radiation and isotopes : including
data, instrumentation and methods for use in agriculture, industry and
medicine; 2010.
[47] Grutters, JPC et al. “Comparison of the effectiveness of radiotherapy
with photons , protons and carbon-ions for non-small cell lung cancer : A
meta-analysis.” Radiotherapy and Oncology; 2010.
[48] Miralbell, R et al. “Potential reduction of the incidence of radiationinduced second cancers by using proton beams in the treatment of
pediatric tumors.” International journal of radiation oncology, biology,
physics; 2002.
11
ANALIZA OBRAZÓW ŻELI DWUKIERUNKOWEJ ELEKTROFOREZY
CZYLI SŁÓW KILKA O WYZWANIACH PROTEOMIKI
M arta Seczyńska
Zakład Biochemii Fizycznej,
Praca napisana pod opieką: dr Sylwii Kędrackiej-Krok
Streszczenie: Proteomika stanowi alternatywę do redukcjonistycznego podejścia, które
opiera się na rozkładzie złożonych procesów biochemicznych na części pierwsze. U jej
podstaw leżą wysokoprzepustowe techniki umożliwiające równoczesną analizę setek, a
nawet tysięcy białek. Dzięki możliwości porównania profili białkowych pacjentów, zwierząt
doświadczalnych, czy linii komórkowych jest ona dobrym narzędziem w badaniu
molekularnych mechanizmów chorób, poszukiwaniu markerów do celów diagnostycznych,
czy projektowaniu nowych leków. Klasyczną metodą stosowaną w tej dziedzinie jest
rozdział badanego materiału za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy, a następnie
identyfikacja wyciętych z żelu białek z wykorzystaniem spektrometrii masowej.
Nieodzownym elementem porównywania proteomów, czy subproteomów jest komputerowa
analiza obrazów po rozdziale 2DE (ang. two-dimentional electrophoresis), w celu
odnalezienia różnicowych plamek białkowych. Jest to kluczowy etap, od którego zależy
wynik całego doświadczenia. W związku z tym, coraz częściej dostrzega się potrzebę
udoskonalenia dostępnego oprogramowania oraz optymalizacji stosowanych w nim
algorytmów, jak również próbuje się opracować jednolity model statystyczny dla tego typu
badań. Podkreśla się również znaczącą rolę analizy manualnej, a także konieczność
wprowadzania poprawek przez eksperymentatora (może to jednak prowadzić do
zafałszowania wyników) [1]. Każdy z etapów takiej analizy (od digitalizacji obrazu żelu,
przez detekcję plam i ich dopasowanie, na opracowaniu statystycznym kończąc) jest więc
istotny dla końcowego wyniku. Z każdym etapem związane są również niedogodności (np.
problem brakujących danych, czy wpływ algorytmów usuwających tło na kwantyfikację
plamek białkowych). Ich rozwiązanie jest dużym wyzwaniem, wymagającym integracji
wiedzy z wielu dziedzin (np. cyfrowego przetwarzania obrazów, czy bioinformatyki).
Niemniej jednak, jest ono konieczne, gdyż tylko podejście proteomiczne zapewnia globalne
spojrzenie na przedstawiane tu problemy badawcze [2].
Holistyczne podejście proteomiki
W erze postgenomowej, proteomika jest dynamicznie rozwijającą się dziedziną nauki, zajmującą się globalną analizą białek oraz ich funkcji.
Łącząc szereg zaawansowanych technik, umożliwia równoczesne zbadanie wielu setek, a nawet
tysięcy cząsteczek. Przełamuje ona redukcjonistyczne podejście, które bardzo długo dominowało w naukach przyrodniczych i wydaje się być
jedyną rozsądną strategią w perspektywie najbliższych lat [1]. Wielu dostrzega jednak ograniczenia i wyzwania związane z badaniami
proteomicznymi, pytając o to czy lepiej zdobyć
bardziej ogólną wiedzę, ale patrzeć z szerszej
perspektywy, czy jednak uzyskać więcej szczegółowych informacji obserwując tylko niewielki
ułamek badanego procesu [2,3]. Pomimo tych
wątpliwości, w obliczu licznych problemów badawczych, konieczne jest korzystanie z wysokoprzepustowych metod, które są w stanie
12
wskazać kierunek dalszych działań, a tym samym znacznie przyspieszyć proces poszukiwania
odpowiedzi na nurtujące nas od dawna pytania.
Proteomika żelowa i poszukiwanie potencjalnych biomarkerów
Jedna ze strategii proteomiki oparta jest na rozdziale badanego materiału techniką elektroforezy dwuwymiarowej (rozdział ze względu na
punkt izoelektryczny, a następnie na masę cząsteczkową w kierunku prostopadłym) oraz późniejszej identyfikacji wybranych białek za
pomocą spektrometrii masowej. Porównawcza
analiza materiału z tkanki zmienionej chorobowo
i kontrolnej może wskazać białka charakterystyczne dla danego procesu chorobowego.
W tym celu, po rozdziale należy przeprowadzić
komputerową analizę uzyskanych obrazów żeli,
Seczyńska M. „Analiza obrazów żeli dwukierunkowej elektroforezy” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
by znaleźć różnice (np. pojawienie się lub zniknięcie plamki, albo zmiany w intensywności jej
zabarwienia, świadczące o zmianach ilościowych) pomiędzy badanymi profilami białkowymi.
Różnicowe białka wycina się z żelu manualnie
lub automatycznie (przy pomocy specjalnych robotów) na podstawie zadanych współrzędnych
położenia listy plamek wygenerowanych przez
oprogramowanie do analizy obrazów. Następnie
trawi się je enzymatycznie, a dzięki analizom
bioinformatycznym możliwa jest identyfikacja
powstałych przez cięcie peptydów, na podstawie
uzyskanych widm masowych. Otrzymane wyniki
potwierdzane są techniką Western blot z wykorzystaniem specyficznych przeciwciał.
Rys. 1 . Etapy eksperymentu proteomicznego opartego na
rozdziale 2DE (two-dimentional electrophoresis).
Bez profesjonalnego oprogramowania ani rusz
Wyobraźmy sobie przykładowy eksperyment
mający na celu porównanie zmian w proteomie
zachodzących w stanach patologicznych, takich
jak proces nowotworzenia, rozwój choroby neurodegeneracyjnej, czy pod wpływem jakiegoś
czynnika (np. podawanego leku). Można założyć,
iż badamy profile białkowe pacjentów w dwóch,
albo trzech odstępach czasowych, które biologicznie będą odzwierciedlać poszczególne stadia
chorobowe. Wraz z grupą kontrolną (pochodzącą
od osób zdrowych) daje to trzy lub cztery grupy.
Dzięki elektroforezie dwuwymiarowej rozdzielić
można nawet do 10 tys. białek na jednym żelu
[4]. Ponieważ jednak rzadko badamy cały proteom (często analizujemy tylko jego część, np. fosfoproteom, subproteom białek jądrowych),
liczba plamek na jednym żelu wynosi zwykle ok.
2 tys. Biorąc pod uwagę ilość powtórzeń, jakie
należy wykonać w każdej badanej grupie (np. 67), by możliwa była rzetelna analiza statystyczna
otrzymanych wyników, będziemy mieć do czynienia z ok. 36 – 56 tys. wartości intensywności
(czy objętości) plamek białkowych. Tak więc, pojedynczy eksperyment proteomiczny generuje
ogromną liczbę danych, których analizę przeprowadza się za pomocą komercyjnie dostępnych,
specjalistycznych
programów,
posługujących się algorytmami z dziedziny cyfrowego przetwarzania obrazów. Metody te są
wciąż udoskonalane, a sam proces analizy jest
ciągle optymalizowany, ponieważ naukowcy dostrzegają, że właśnie ten etap eksperymentu ma
decydujący wpływ na ilość i jakość uzyskanych
informacji [4,5,6].
Jaka strategia?
Obecnie do najbardziej popularnych programów
dedykowanych analizie obrazów żeli 2DE należą:
PDQuest (Biorad), ImageMaster 2D, DeCyder
(GE Healthcare), Delta2D (Decodon), czy Progenesis SameSpots (Nonlinear Dynamics). Oferują
one dwie różne strategie analizy. W klasycznym
podejściu (proponowanym przez pierwsze 2 programy), detekcja plamek białkowych przeprowadzana jest na samym początku analizy. Dla
każdego żelu, informacje na nim zawarte, przekładane są na zbiór plamek o określonych granicach i wartościach objętości. Dopasowanie
plamek na odpowiadających sobie żelach następuje po wskazaniu przez użytkownika kilku
wzorcowych dopasowań (ang. landmarks). Alternatywne rozwiązanie (oferowane np. przez program Delta2D) polega na przeprowadzeniu
w pierwszej kolejności korekcji różnic w położeniu plamek, poprzez dopasowanie do siebie
wszystkich obrazów (ang. image warping), a następnie ich fuzji w celu stworzenia mapy proteomowej, na której połączone zostaną informacje
ze wszystkich żeli. Dopiero na tak połączonym
obrazie (ang. fusion image) następuje wykrycie
i opisanie plamek białkowych. Strategia ta jest
lepsza, ponieważ eliminuje problem utraty danych podczas dopasowania plamek między poszczególnymi żelami [4,7].
Przed przystąpieniem do analizy
Z analizą 2DE ściśle związany jest sam ETAP PROJEKTOWANIA EKSPERYMENTU, tzn. ustalenie liczby
badanych grup, liczby powtórzeń w każdej grupie a także określenie rodzaju powtórzeń (powtórzenia techniczne czy biologiczne). Ze
statystycznego punktu widzenia, powtórzenia
biologiczne są bardziej pożądane, ale mając na
względzie złożoność i ograniczoną powtarzalność eksperymentu dwuwymiarowej elektroforezy, należy również wykonać powtórzenia
techniczne [8]. Ponieważ każde doświadczenie
wymaga innych warunków, w związku z tym,
warto przed przystąpieniem do niego wykonać
eksperyment pilotażowy, który pomoże zminimalizować zmienność wynikającą z przygotowania
materiału, rozdziału, czy innych czynności związanych z procedurą. Ważnym aspektem jest więc
ETAP BARWIENIA ŻELi, od którego zależy popraw-
13
ność uzyskanych wyników. Istnieje wiele technik
barwienia, z których najpopularniejsze to barwienie Coomasie Brilliant Blue, solami srebra,
czy z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych (np. powszechnie stosowany w proteomice
SYPRO Ruby). Proces wizualizacji powinien być
czuły, szybki, nietoksyczny, kompatybilny ze
spektrometrią masową, a także zapewniać niski
poziom tła oraz, co najważniejsze, intensywność
zabarwienia plamki powinna zależeć liniowo od
stężenia białka w jak najszerszym zakresie [1].
pularnym algorytmem stosowanym do detekcji
jest metoda działów wodnych (ang. watershed
segmentation), którą w uproszczeniu można sobie wyobrazić jako stopniowe zanurzanie w wodzie płaszczyzny reprezentującej żel. Woda
w pierwszej kolejności wpływa przez minima lokalne. W miejscach, gdzie łączy się woda, która
dostała się przez dwa różne minima stawiany
jest dział wodny (tama). Algorytm ten jest jednak wrażliwy na szum, który generuje fałszywe
minima [9, 12].
Etapy analizy obrazów 2DE
Niezależnie od zastosowanego podejścia, pierwszym etapem analizy żeli 2DE jest OTRZYMANIE
CYFROWEGO OBRAZU ŻELU ORAZ JEGO WSTĘPNA OBRÓB KA: przycięcie (czyli ograniczenie analizowanego
obszaru żelu), usuwanie tła i szumów. Cyfrowy
obraz otrzymuje się za pomocą skanerów lub kamer CCD (ang. charge-coupled device). Polega
to na odwzorowaniu intensywności zabarwienia
plamki na poziom szarości pikseli, tworzących
daną plamkę na otrzymanym skanie. Jednym
z problemów, jaki pojawia się na tym etapie jest
zbyt mała liczba poziomów szarości przypadająca na piksel, jaka może zostać zapisana w 16-bitowym formacie TIFF (65 536), w stosunku do
zakresu poziomów szarości mierzonych dostępnymi urządzeniami do skanowania żeli
(120 000). Stosuje się więc różnego rodzaju kalibracje lub specjalne formaty plików [1]. Eksportując obrazy (np. w celu ich przycięcia) do
innego programu, należy pamiętać, aby sprawdzić czy zostanie zachowana kalibracja.
Rys. 2 : Otrzymanie cyfrowego obrazu żelu [1 ].
Na obrazie, który chcemy poddać dalszej analizie, możemy wykonywać tylko takie przekształcenia, które nie wpłyną na intensywność pikseli.
Problemem staje się więc usuwanie tła i artefaktów, ponieważ stosowane do tego algorytmy modyfikują wartości intensywności wpływając na
poprawność otrzymanych wyników [10]. Z drugiej strony, artefakty obecne na obrazie w postaci drobinek precypitującego barwnika, zaburzają
proces kwantyfikacji plamek białkowych. Do ich
usunięcia stosuje się np. filtr medianowy.
Następnym etapem analizy (w zależności od
strategii, przeprowadzanym w różnej kolejności)
jest DETEKCJA PLAMEK BIAŁKOWYCH, oparta o ustalenie przez użytkownika zestawu parametrów, na
podstawie których wyodrębniane są one z obrazu (np. min area, saliency czy smooth) [11]. Po-
14
Rys 3: Schemat działania algorytmu działów wodnych [9].
Jednym z ważniejszych etapów w analizie obrazów 2DE jest DOPASOWANIE odpowiadających sobie PLAMEK BIAŁKOWYCH (ang. match) pomiędzy
żelami. Jeśli mamy do czynienia z oprogramowaniem, w którym detekcja przeprowadzana jest
na początku analizy, dopasowanie wymaga wyboru żelu referencyjnego (ang. master gel)
i wcześniej wspomnianych punktów orientacyjnych (ang. landmarks). Punkty te powinny być
rozmieszczone równomiernie na żelu, a użytkownik musi być pewien poprawności ich dopasowania.
Ponieważ dany eksperyment
proteomiczny składa się z kilku grup i kilku żeli
w obrębie każdej grupy, dopasowanie przeprowadza się w każdej grupie (do żelu referencyjnego grupowego), a następnie między nimi (do
żelu referencyjnego międzygrupowego) [11].
Istotne jest to, że program dopasowuje tylko te
plamki białkowe, które znajdują się na żelu referencyjnym. Oznacza to, że jeśli istnieją jakieś
plamki, które są na innych żelach, ale brak ich
na żelu referencyjnym, to nie będą one brane
pod uwagę w dalszej analizie. Dlatego też, żel
referencyjny to żel z największą ilością plamek.
Jednak, pomimo tego podejścia, znaczna ilość
danych ulega utracie, więc do analizy coraz częściej stosuje się te programy, które tworzą obraz
połączony i przeprowadzają dopasowanie na
podstawie wzoru rozmieszczenia plamek [4,9].
Mając listę dopasowani, można przystąpić do
analizy ilościowej. W tym celu należy przeprowadzić NORMALIZACJĘ DANYCH- w związku z występowaniem różnic systematycznych pomiędzy
żelami, co w głównej mierze wiąże się z faktem,
Rys 4: Fragmenty żeli wraz z odpowiadającymi im obrazami 3D, które służą do manualnej weryfikacji wyników. Można zauważyć
ilościowe różnice pomiędzy plamkami na żelach w pierwszym drugim rzędzie (reprezentacja w programie ImageMaster™ 2D Platinum 7.0) [1 1 ] .
że nie jest możliwe nałożenie identycznej ilości
próbki na wszystkie żele (błędy pipetowania,
straty przy nakładaniu) [1]. Najczęściej stosuje
się kwantyfikację opartą na wielkości „% volume”, co oznacza, że objętość plamki białkowej
odniesiona jest do zsumowanej objętości białek
na żelu i wyrażona w procentach [6,8,11,13].
W analizie ilościowej ważne są kryteria doboru,
ze względu na to, iż plamki białkowe obecne na
wszystkich żelach, uzyskanych w wyniku eksperymentu, często nie stanowią nawet 30%
wszystkich rozdzielanych białek. Przykładowo,
dobrym kryterium może być wybór takiego zbioru dopasowań plamek, w którym plamki znajdują się na n-1 żelach w każdej grupie (przy
założeniu, że n>2). Przeprowadzając ANALIZĘ ILOŚCIOWĄ, tj. sprawdzając różnice w ilości białka
w danych próbkach, w stosunku do próbki kontrolnej, definiuje się zbiory dopasowań w obrębie każdej grupy, a następnie tworzy ILOCZYN
TYCH ZBIORÓW. Oznacza to, że sprawdzane są te
dopasowania, w których plamki białkowe znajdują się w obrębie KAŻDEJ grupy na przynajmniej
n-1 żelach. W przypadku analizy jakościowej ,
w celu wykrycia takich plamek, które obecne są
na żelach jednej lub kilku grup, a nie ma ich na
żelach w pozostałych grupach, tworzona jest SUMA ZBIORÓW dopasowań wewnątrzgrupowych.
Wystarczający jest więc warunek, by plamki
z danego dopasowania znajdowały się na n-1 żelach w obrębie JAKIEJKOLWIEK grupy. Te plamki,
które nie spełniają wyżej wymienionych założeń
(w przypadku przyjęcia kryterium n-1) nie są
brane pod uwagę w dalszej analizie.
O ile analiza jakościowa przeprowadzana jest poprzez manualne sprawdzenie listy dopasowań, o tyle
analiza ilościowa wymaga przyjęcia uzasadnionego
modelu statystycznego. Mimo iż istnieje wiele prac
poświęconych temu zagadnieniu, nie udało się wypracować jednolitych standardów [6,8,15]. Stosuje
się zarówno metody jednoczynnikowe (np. ANOVA,
test Studenta, testy nieparametryczne), jak i wieloczynnikowe (np. analiza głównych składowych, ang.
Pricipal Component Analysis, PCA) [8]. Metody te
służą określeniu, czy średnie objętości danej plamki
różnią się pomiędzy grupami. Hipoteza zerowa zakłada ich równość, natomiast jej odrzucenie jest
równoznaczne z przyjęciem hipotezy alternatywnej,
która mówi o braku tej równości na danym poziomie
istotności (najczęściej p<0,05). Test Studenta można stosować tylko dla dwóch grup, natomiast
ANOVA służy do badania średniej w wielu grupach. Oba testy wymagają jednak spełnienia założeń, np. o jednorodności wariancji. W innym
przypadku należy przeprowadzić nieparametryczny odpowiednik testu (np. ANOVA Kruksalla-Wallisa). Istotnym utrudnieniem analizy
obrazów 2DE są brakujące dane, czyli taka sytuacja, kiedy plamka na żelu referencyjnym nie ma
swojego odpowiednika na jednym lub kilku żelach. Może być to spowodowane brakiem detekcji występującym, gdy parametry opisujące
plamkę znajdują się poniżej przyjętego progu,
czy też niewydajny transfer niektórych białek
z paska do żelu. Istnieje wiele strategii rozwiązywania tego problemu (np. zastąpienie brakującej zmiennej wartością minimalną lub
wartością średnią z danej grupy), ale i tutaj brak
jasno określonych standardów [14,16].
Problemy związane z analizą 2DE
Mimo istnienia różnych programów umożliwiających porównanie skanów żeli po dwukierunkowej elektroforezie, decydującą rolę w tym
15
procesie odgrywa manualna analiza i żmudna
weryfikacja otrzymanych wyników. Szacuje się,
że nie więcej niż 3% czasu analizy odbywa się
w sposób automatyczny. Przykładowo, dla programu ImageMaster i Progenesis całkowity czas
analizy (wyłączając analizę statystyczną) dla
eksperymentu złożonego z 18 żeli wynosi odpowiednio około 33 i 84 godziny, podczas gdy komputerowa obróbka danych trwa zaledwie jedną
godzinę [17]. Do najbardziej czasochłonnych etapów można zaliczyć optymalizację parametrów detekcji, poprawę dopasowań plamek, a także
określenie ich granic. Otrzymując po analizie statystycznej listę różnicowych plamek, konieczne jest
również manualne zweryfikowanie każdej z nich (np.
w celu wykluczenia tych, których intensywność jest
powyżej lub poniżej progu czułości skanera fluorescencyjnego). Innym problemem jest wstępna obróbka obrazu, która jak dowiedziono wpływa na
otrzymane wyniki. Na przykładzie dwóch testowanych programów, wykazano brak powtarzalnej
kwantyfikacji plamek białkowych, na tym samym żelu po przycięciu ich obrazów [10].
Podsumowanie
Analiza obrazów elektroforetycznych jest procesem złożonym, skomplikowanym i wciąż wymaga
usprawnienia. Dąży się więc do udoskonalenia
dostępnego oprogramowania, optymalizacji algorytmów, w nim stosowanych, a także opracowania jednolitego modelu statystycznego dla
tego typu badań. Wymaga to integracji wiedzy
specjalistów z wielu dziedzin, np. statystyki, cyfrowego przetwarzania obrazów, czy bioinformatyki. Należy podkreślić, iż ilość informacji, jakie
możemy uzyskać z pojedynczego eksperymentu
proteomicznego jest ogromna, dlatego warto dołożyć wszelkich starań, by rozwiązać problemy,
z którymi stykamy się na każdym etapie analizy
2DE. Nie można oczywiście zapominać, że proteomika to nie tylko eksperymenty oparte na
2DE czy DIGE (ang. difference gel electrophoresis), ale też metody bezżelowe: bezznacznikowe
typu shot gun lub z wykorzystaniem znaczników
iTRAQ. Proteomika ma więc wiele do zaoferowania i tylko ona może zapewnić globalne spojrzenie na stawiane przez nas problemy badawcze.
Atrakcyjność tej gałęzi biochemii tkwi w jej uniwersalności. Jest ona narzędziem, które można
zastosować w wielu dziedzinach, m.in.: neurobiologii, farmakologii, biologii komórek macierzystych, czy biochemii nowowtworów.
Dodatkowo, strategia „od ogółu do szczegółu”,
wydaje się być dużo szybsza i efektywniejsza niż
strategia odwrotna, którą do tej pory zdecydowanie częściej stosowano w naukach biologicznych.
Piśmiennictwo:
[1] Sillberring J, et al. Proteomika i metabolomika, Wydawnictwo
Uniwersytetu Warszawskiego 2010
[2] Latterich M. Molecular systems biology at the crossroads: to know
less about more, or to know more about less? Proteome Sci. 2005
[3] Huber LA. Is proteomics heading in the wrong direction? Nat Rev Mol
Cell Biol. 2003
[4] Berth M, et al. The state of the art in the analysis of two-dimensional
gel electrophoresis images. Appl Microbiol Biotechnol. 2007
[5] Stessl M, et al. Influence of image-analysis software on quantitation
of two-dimensional gel electrophoresis data. Electrophoresis. 2009
[6] Meunier B, et al. Data analysis methods for detection of differential
protein expression in two-dimensional gel electrophoresis. Analytical
Biochemistry. 2005
[7] Natale M, et al. Image Analysis Workflow for 2-D Electrophoresis Gels
Based on ImageJ. Proteomics Insights. 2011
[8] Chich J.-F, et al. Statistics for proteomics: Experimental design and 2DE differential analysis. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.
2007
[9] Suchwałko A, et al. Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa: od
eksperymentu po profile ekspresji. Część druga – analiza obrazu, Acta
Bio-Optica et Informatica Medica 2010
16
[10] Wheelock Å.M, et al. Software-induced variance in two-dimensional
gel electrophoresis image analysis. Electrophoresis. 2005
[11] GE Healthcare, ImageMaster™ 2D Platinum 7.0, User Manual 2009
[12] Dowsey A.W, et al. The role of bioinformatics in two-dimensional gel
electrophoresis. Proteomics. 2003
[13] DECODON GmbH, Delta 2D, Analyzing 2D gels as easy as point and
click, manual 2011
[14] Pedreschi R et al. Treatment of missing values for
multivariatestatistical analysis of gel-based proteomics data. Proteomics.
2008
[15] Maurer M.H, et al. Comparison of Statistical Approaches for the
Analysis of Proteome Expression Data of Differentiating Neural Stem
Cells. Journal of Proteome Research. 2005
[16] Albrecht D, et al. Missing values in gel-based proteomics.
Proteomics. 2010
[17] Clark B.N, et al. The myth of automated, high-throughput twodimensional gel analysis. Proteomics. 2008
CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA JAKO NARZĘDZIE DO OZNACZANIA
JĄDROWEGO DNA W KOMÓRCE ROŚLINNEJ
Katarzyna Barańska
Koło N aukowe Biotechnologii ‘BioX’
Katedra Genetyki, Fizjologii i Biotechnologii Roślin
Wydział Rolnictwa i Biotechnologii
Uniwersytet Technologiczno – Przyrodniczy w Bydgoszczy
Praca napisana pod opieką: dr inż. Iwony Jędrzejczyk
Streszczenie: Cytometria przepływowa (FCM) jest metodą cytogenetyki molekularnej,
której ogromny potencjał wynika z łatwości oraz szybkości przeprowadzenia pomiaru dużej
populacji cząsteczek. Stanowi ona ważne, a czasami niezbędne narzędzie dla zrozumienia
podstawowych mechanizmów i procesów leżących u podstaw funkcjonowania komórki
oraz wzrostu i rozwoju roślin. Metoda ta jest wykorzystywana m.in. do oznaczania
ploidalności, analizy cyklu komórkowego, endoreduplikacji oraz jądrowej zawartości DNA.
Powszechna aplikacja FCM, oprócz właściwości poznawczych, posiada swój charakter
użytkowy. Pomiar cytometryczny dostarcza istotnych informacji m.in. o stanie
fizjologicznym nasion, które mogą pozwolić na wskazanie optymalnego czasu zbiorów oraz
zabiegów ich kondycjonowania. Ponadto, umożliwia zwiększenie efektywności
i ukierunkowanie programów hodowlanych ważnych gatunków roślin uprawnych. W pracy
przedstawiono wykorzystanie metody FCM w kontekście badań i hodowli roślin.
Wstęp
Cytometria przepływowa (FCM) to precyzyjna
i szybka metoda stosowana w analizie jądrowej
zawartości DNA oraz innych badaniach jakościowych i ilościowych mikroorganizmów, komórek,
organelli i chromosomów. Początkowo stosowana była jedynie w badaniach medycznych i diagnostyce klinicznej [38], a obecnie rutynowo
wykorzystywana w biotechnologii i hodowli roślin, w badaniach immunologicznych, genetycznych, farmakologicznych, zoologicznych, biologii
molekularnej i morskiej [2].
Opracowanie odpowiedniej metodyki przygotowania zawiesiny nienaruszonych jąder komórkowych
dokonało
istotnego
przełomu
w cytometrycznej analizie roślin [1,2]. Metodę
te opracował Galbraith wraz z zespołem w 1983
roku. Polega ona na mechanicznej izolacji jąder
komórkowych, przez rozdrabnianie tkanki roślinnej ostrą żyletką na szalce Petriego w obecności buforu lizującego, zawierającego w swym
składzie między innymi barwnik fluorochromowy
(Tabela 1). Tak uzyskaną zawiesinę przesącza się
przez nylonowy filtr do probówki [3,8], a następ-
Tabela 1 . Bufory izolujące jądra komórkowe wykorzystywane
w cytometrii przepływowej roślin.
nie analizuje za pomocą cytometru przepływowego. Obecnie FCM stosowana jest m.in. przez
biotechnologów, hodowców roślin i producentów
nasion do oznaczania wielkości genomu, ploidalności czy analizy cyklu komórkowego [3,4,5].
Zasada działania cytometru przepływowego
opiera się na pomiarze intensywności fluorescencji emitowanej przez wybarwione fluorochromem jądra komórkowe przepływające
w strumieniu cieczy okrywowej [29, 30, 31].
Strumień przepływa przez ogniskową obiektywu
mikroskopu, wyposażonego w źródło światła,
którym jest laser, lampa ksenonowa lub rtęciowa. Zogniskowany na strumieniu promień źródła
światła jest rozpraszany we wszystkich kierunkach, jednak rejestrowane jest tylko natężenie
światła rozproszonego w kierunku biegu promienia (FSC, ang. forward scatter) i w kierunku
prostopadłym do kierunku biegu promienia
(SSC, ang. side scatter). Wartość parametru FSC
zależy od stopnia ugięcia światła na brzegach
komórki i informuje o jej względnej wielkości.
Natomiast parametr SSC, który pochodzi z rozproszenia światła na strukturach wewnątrzkomórkowych i błonie komórkowej, wyznacza
względną ziarnistość komórki. Barwnik fluorochromowy związany z komórkowym DNA absorbuje światło i reemituje je w postaci
fluorescencji, która dzięki obecności wzmacniacza i detektora jest zamieniana na sygnał cyfrowy. Sygnał przesyłany jest do komputera,
w którym informacje przedstawiane są liczbowo
i graficznie – najczęściej w postaci histogramu
(Rys. 1) [1, 2, 5, 32, 33]. Wiarygodność analiz
jest uzależniona od jakości histogramów, któ-
17
Barańska K. „Cytometria przepływowa jako narzędzie do oznaczania jądrowego DNA w komórce roślinnej” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
ra określana jest na podstawie współczynnika
wariancji [34].
Do wybarwiania kwasów nukleinowych stosuje
się różne barwniki fluorescencyjne, do których
zaliczamy: (i) ilościowo interkalujące w spiralę
DNA, np. bromek etydyny (EB) i jodek propidyny
(PI), które wiążą się z kwasem deoksyrybonukleinowym niezależnie od jego sekwencji; (ii) barwniki przyłączające się do regionów bogatych
w pary adenina-tymina (AT), np.: 4,6-diamidyno2-fenyloindol (DAPI), Hoechst 33258, Hoechst
33342; oraz (iii) barwniki przyłączające się do
par guanina-cytozyna (GC), np.: chromomycyna
A3, mitramycyna, oliwomycyna [8]. Stwierdzono,
że stosunek ilości par AT do GC w organizmach
jest zmienny [27, 34, 35], dlatego też do oznaczania jądrowej zawartości DNA rekomendowane są barwniki interkalujące [3, 36, 37].
wybarwianie DNA, powodując błędy w poprawnym oznaczaniu jego zawartości w jądrze [25,
41, 42, 43, 44]. Dlatego też w tym przypadku,
nasiona mogą być bardziej odpowiednie do
oznaczenia zawartości jądrowego DNA [6, 7].
Analiza zawartości DNA u roślin wymaga zastosowania wzorca odniesienia tzw. standardu.
W badaniach używane są zarówno standardy zewnętrzne jak i wewnętrzne. Standardami zewnętrznymi są rośliny o znanej ploidalności,
których jądra komórkowe izoluje się niezależnie
od jąder roślin gatunków badanych, a intensywność ich fluorescencji oznaczana jest w oddzielnych próbach. Ten rodzaj standaryzacji
stosowany jest głównie w badaniach niewymagających pomiarów o wysokiej dokładności, np.
w ocenie poziomu ploidalności. Standardy wewnętrzne to rośliny o znanej zawartości DNA.
W standaryzacji wewnętrznej jądra komórkowe
próby i standardu są izolowane, barwione i analizowane równocześnie, a intensywność fluorescencji obu gatunków przedstawiana jest na
jednym histogramie. Ten typ standaryzacji jest
kluczowy w oszacowaniu wielkości genomu
z dużą dokładnością, ponieważ pozwala na wykrycie interferencji inhibitorów wybarwiania [3,
5, 19]. Wskutek tego zawartość DNA standardu
wewnętrznego powinna być zbliżona do ilości
DNA w jądrach rośliny badanej, a zarazem piki
2C i 4C obu gatunków nie pokrywały się ze sobą.
Zawartość jądrowego DNA szacowana jest przez
porównanie średniej pozycji pików G 0/G 1 analizowanej próby oraz standardu wewnętrznego [1, 8].
Analiza ploidalności, aktywności cyklu komórkowego i endoploidalności
Rys. 1 . Histogram zawartości DNA w jądrach komórek liścia
rośliny diploidalnej Pisum sativum (zaznaczono części histogramu odpowiadające określonym fazom cyklu komórkowego,
z zawartością DNA: 2C – faza G 0/G 1 , pomiędzy 2C a 4C – faza
S i 4C – faza G 2).
Materiałem wykorzystywanym do pomiaru cytometrycznego mogą być dowolne części roślin zawierające jądra komórkowe, np.: liść, liścień,
hipokotyl, łodyga, płatek korony, pyłek, korzeń,
zarodek oraz bielmo [5]. Najczęściej do pomiaru
cytometrycznego wykorzystuje się młode, świeże
liście [38, 39, 40]. Zwykle materiał taki zawiera
większość komórek w fazie G 0/G 1 cyklu komórkowego, co uwidacznia się na histogramie w postaci wyraźnego piku korespondującego
z jądrami komórkowymi zawierającymi 2C DNA,
a także pewną liczbę komórek w fazie G 2 (drugi
pik z jądrami 4C). Podczas izolacji jąder komórkowych z liści, do roztworu zostaje uwolniona
także pozostała zawartość komórki. Stwierdzono, że polifenole, flawonoidy, olejki eteryczne,
alkaloidy i śluzy, będące metabolitami wtórnymi
wytwarzanymi w licznych gatunkach drzew,
krzewów, roślin przyprawowych oraz ziół, znajdujące się w cytoplazmie ich komórek, hamują
18
Najpowszechniejszym zastosowaniem cytometrii
przepływowej w badaniach roślin jest analiza
poziomu ploidalności (Rys. 2). Oznaczenie ploidalności obejmuje kolekcje nasion zdeponowanych w banku nasion, ocenę stabilności
genetycznej i jednorodności materiału roślinnego (roślin, kalusa, zawiesin komórek, embroidów) otrzymywanych w kolejnych etapach
programów hodowlanych, zwłaszcza kultur in
vitro, w tym także (di-) haploidów oraz screening pożądanych cytotypów uzyskanych w wyniku hybrydyzacji, wraz z detekcją miksoploidów
[9, 10, 11, 12]. W przeciwieństwie do tradycyjnej
metody liczenia chromosomów, gdzie analizowana jest jedna warstwa histologiczna, narzędzie
to umożliwia ocenę wszystkich trzech (L1, L2
i L3) [22, 23]. Cytometria przepływowa odgrywa
ważną rolę w uprawie gatunków poliploidalnych,
np.: bananów (Musa spp., Musaceae), Dioscorea
(Dioscoreaceace) czy bazylii pospolitej (Ocimum
basilicum, Ocimum), a w przypadku buraka cukrowego (Beta vulgaris ssp. vulgaris, Amaranthaceae) poziom ploidalności jest bardzo
ważnym parametrem jakościowym nasion tego
gatunku [4, 13, 14, 15].
W celu określenia poziomu ploidalności badane-
go materiału roślinnego wyznacza się średnią
pozycję piku G 0/G 1 rośliny badanej oraz standardu zewnętrznego (z reguły jest to diploidalna roślina analizowanego gatunku) i oblicza według
wzoru [5]:
zwiększenie zawartości jądrowego DNA w postępie geometrycznym 4C-8C-16C-32C itd. (Rys. 3).
Endopoliploidalność może posiadać charakter
gatunkowo- i organo-specyficzny. Stopień endopoliploidalności jest wyższy w rozwijających się
tkankach i organach zapasowych (liścienie, bielmo, tapetum, elajosomy) niż w ogonkach liściowych, łodygach czy korzeniach [18, 19, 47].
Ponadto wykazano, że różnice w poziomie endopoliploidalności mogą dotyczyć pojedynczego organu [17].
Pomimo że endoreduplikacja jest rozpowszechniona wśród organizmów eukariotycznych, to
wiedza na temat roli i kontroli tego procesu w
komórce roślinnej jest nadal uboga. Obecność
jąder endopoliploidalnych została stwierdzona
m.in. u gatunków posiadających małe genomy,
np. Arabidopsis thaliana, Beta vulgaris, Brassica
oleracea, Cucumis sativus, Lycopersicon esculentum, Lupinus cosentinii oraz u gatunków
storczykowatych i sukulentów [16]. Jedna z hipotez brzmi, że endoreduplikacja DNA to strategia ewolucyjna tych genotypów, substytut
zwiększania się zawartości jądrowej DNA
w trakcie ich filogenezy [5, 47, 49].
Z uwagi na korelację między poziomem endoreplikacji i objętością jądra komórkowego, a tym
samym całych komórek i organów, występowanie tego procesu może być pożądane przy tworzeniu odmian wysokoplonujących [5]. Ponadto
sugeruje się, że cytometryczna analiza intensywności endopoliploidalności w nasionach typu polisomatycznego, wyrażona jako odsetek jąder
endopoliploidalnych w zarodku i bielmie, może
stać się przydatnym narzędziem dla oceny optymalnego czasu zbioru oraz prześledzenia zdolności ich kiełkowania podczas procesu
kondycjonowania [49].
Przy badaniu poziomu endopoliploidyzacji należy określić liczbę jąder z daną zawartością DNA.
Następnie obliczenie udziału procentowego jąder komórkowych o różnej ploidalności pozwoli
na określenie stopnia polisomatyczności. Do
określenia średniej ploidalności (µ, średniej wartości C) wykorzystuje się wzór [5, 21]:
gdzie:
Rys. 2. Analiza ploidalności roślin uzyskanych w kulturach in
vitro pylników Capsicum annum: A – roślina haploidalna, B –
roślina diploidalna (piki G 0/G 1 odpowiednio w kanałach 50 i
1 00).
Obecność komórek o różnym stopniu ploidalności w tym samym organie nazywa się polisomatycznością. Zjawisko to jest rezultatem
przebiegającej w niektórych komórkach somatycznych endopoliploidyzacji, która jest rezultatem endoreduplikacji - powtarzających się cykli
syntezy DNA bez występowania podziałów komórkowych. W wyniku tego procesu następuje
N - liczba pików z daną zawartością DNA w próbie,
Ci - wartość C dla kolejnych (n) pików próby,
Ni - liczba jąder komórkowych w piku ni,
N - liczba jąder komórkowych we wszystkich pikach próby.
Aktywność cyklu podziału komórki w przypadku
nasion koresponduje z ich stanem fizjologicznym, a więc jej obserwacja może być stosowana
w celu określenia zasadniczych cech fizjologicznych kształtowania się nasion, ich dojrzewania
19
oraz kiełkowania wraz z kontrolą zabiegów
przedsiewnych. W aktywnie rosnących organach
komórki po podziale mitotycznym (M) przechodzą w fazę wzrostu (G 1 ; ang. gap, przerwa),
po której następuje replikacja DNA (faza syntezy, S). Następnie komórki przechodzą drugi
okres wzrostu (G 2 ), po czym znów się dzielą. Komórki niedzielące się, wyspecjalizowane, znajdują się w stadium określanym symbolem G 0.
Poszczególne fazy różnią się między sobą jądrową zawartością DNA, dlatego istnieje możliwość
określenia proporcji komórek znajdujących się w
danej fazie cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej. Diploidalne komórki w fazie G 0/G 1 zawierają 2C jądrowego DNA, w fazie
G 2 dwukrotnie więcej (4C DNA) a w fazie S wartość ta jest pośrednia pomiędzy 2C i 4C [34].
Rys. 3. Polisomatyczność w jądrach komórkowych nasion
Lens culinaris (jądra z zawartością powyżej 4C przeszły proces endoreduplikacji).
FCM umożliwia ocenę stopnia synchronizacji cyklu komórkowego, analizy wpływu wielu związków na cykl komórkowy oraz na jego regulację
[20]. Badanie kinetyki cyklu komórkowego za
pomocą FCM wykorzystywane jest przez m.in.
producentów nasion. Pomiar cytometryczny dostarcza informacji o stanie fizjologicznym nasion, stosunku ilości bielma do zarodka oraz
poziomu endoreplikacji. W produkcji wysokiej
jakości materiału siewnego znajomość udziału
jąder fazy G 2 w stosunku do ilości jąder fazy G 1
może być uważana za wczesny objaw kiełkowania nasion [48]. Współczynnik G 2 /G 1 stosowany
jest do śledzenia zmian aktywności cyklu komórkowego, a tym samym przebiegu procesów kondycjonowania nasion [5]. Podczas badania
kinetyki cyklu komórkowego należy określić
liczbę jąder komórkowych z określoną zawartością jądrowego DNA. W celu określenia zmian
aktywności cyklu podziału komórki należy określić stosunek (współczynnik) jąder komórkowych
w fazie G 2 do jąder w fazie G 1 [5].
20
Analiza wielkości genomu
Jądrową zawartość DNA w badanej próbie oblicza się poprzez porównanie średniej pozycji pików G 0/G 1 próby badanej i standardu
wewnętrznego, pomnożonej przez zawartość
DNA standardu:
Zarówno rozmiar holoploidalnego, jak i monoploidalnego genomu mogą być wyrażone w jednostkach wagowych tj. pikogramach (pg) lub
przeliczone na ilość par zasad (bp) według wzoru [3]:
Dane na temat zawartości DNA mają dla nauk
biologicznych ogromne znaczenie.
Od 1997
roku istnieje elektroniczna, międzynarodowa baza danych The Plant DNA C-values Database
(http://data.kew.org/cvalues/homepage.html),
która sukcesywnie gromadzi i udostępnia informacje na temat zawartości jądrowego DNA roślin okrytozalążkowych, nagozalążkowych,
paprotników, mszaków oraz glonów. Obecnie dostępna jest wersja 6.0 zawierająca ponad osiem
tysięcy gatunków roślin, u których została oznaczona jądrowa zawartość DNA [22].
Wykorzystanie wiedzy o wielkości genomu odgrywa kluczową rolę przy wyborze organizmu
modelowego do sekwencjonowania DNA, a także
wpływa na podjęcie decyzji dotyczących czasu
pracy oraz kosztów, jakie badacz musi ponieść
podczas takiego projektu. Przyczynia się do rozwoju metod „genetycznego odcisku palca” (z
ang. DNA fingerprinting), które powszechnie
stosowane są do analizy struktury populacji, migracji genów i bioróżnorodności (genetycznej).
Zasugerowano, że znajomość ploidalności gatunku, a tym bardziej jego wielkości genomu, są
użyteczniejszymi wskaźnikami niż wartość 1C
DNA przy podejmowaniu decyzji, jaki protokół
do analizy polimorfizmu długości amplifikowanych fragmentów (AFLP, z ang. amplified fragment length polymorphism) należy zastosować.
Dla małych genomów, liczba interpretowalnych
pasm może zostać zwiększona poprzez redukcję
liczby selektywnych zasad [23, 24].
Oznaczając jądrową zawartość 2C DNA należy
wziąć pod uwagę fakt, że metabolity wtórne zawarte w cytoplazmie komórek wielu gatunków
drzew, krzewów, roślin przyprawowych oraz ziół,
mogą modyfikować stopień dostępności fluorochromów do kwasu nukleinowego, prowadząc do
pogorszenia jakości uzyskiwanych histogramów
i zafałszowania wyniku pomiaru cytometrycznego. W celu zminimalizowania negatywnego
wpływu inhibitorów zaleca się dodanie do buforu izolacyjnego substancji antyoksydacyjnych tj.:
poliwinylopirolidonu (PVP-10), β-merkaptoeta-
przypadku zastosowania PI); płyn okrywowy (dla
cytometrów Partec stosuje się wodę destylowaną
z kroplą Tween 20 na 10 litrów [5]); program
komputerowy do ewaluacji histogramów (np.
FloMax, Partec, Niemcy).
Ryc. 5. Histogramy względnej zawartości DNA w jądrach komórkowych O. basilicum
i standardu wewnętrznego P.
hybrida (2C=2,85 pg, [26]) wybarwionych za pomocą PI przy
użyciu buforu izolacyjnego Galbraith bez dodatku antyoksydantu (A) oraz z dodatkiem 2% PVP-1 0 (B). Wykresy dot-plot
przedstawiają zależność SSC od fluorescencji PI (a,c) oraz
FSC od SSC (b,d). Strzałki wskazują dodatkowe agregaty
cząsteczek bezjąder.
nolu lub ditiotreitolu (DTT), które w znacznym
stopniu hamują aktywność związków polifenolowych [6, 7, 25]. Poszczególne substancje mogą
być dodawane pojedynczo bądź w kombinacjach,
jednak najlepszy skład i stężenie zawsze należy
ustalić doświadczalnie dla każdego gatunku
(Rys. 4).
Protokół. Analiza wielkości genomu.
M ATERIAŁ I SPRZĘT:
badany materiał roślinny; standard wewnętrzny
(gatunek roślin o ustalonej zawartości jądrowego DNA np. Petunia hybrida; P × Pc6; 2,85
pg/2C [26, 38]); bufor izolujący jądra komórkowe (patrz Tabela 1.); barwnik fluorescencyjny
(najczęściej jodek propidyny); rybonukleaza A;
plastikowe płytki Petriego; żyletki; probówki; filtry nylonowe o średnicy oczek 50 μm; pipeta
zmiennopojemnościowa oraz końcówki; cytometr przepływowy wyposażony w laser emitujący promienie o długości fal 532 nm (w
PRZYGOTOWANIE PRÓBY:
Materiał roślinny stosowany do pomiaru cytometrycznego powinien być młody, świeży oraz w
dobrym stanie fitosanitarnym, nieporażony
przez choroby i patogeny. W przypadku zastosowania nasion należy inkubować próbę w lodzie
przez około 20-30 minut (czas ustalony eksperymentalnie). Dla każdego badanego gatunku należy przeprowadzić test na obecność inhibitorów
wybarwiania PI według protokołu Price i in.
[25]. Test polega na porównaniu intensywności
fluorescencji próby zawierającej jądra komórkowe standardu wewnętrznego (A) z próbą zawierającą jądra komórkowe standardu oraz gatunku
badanego (B) (Rycina 4). Redukcja intensywności fluorescencji standardu wewnętrznego w
próbie B w porównaniu do intensywności fluorescencji w próbie A świadczy o obecności
w cytoplazmie komórek związków hamujących
wybarwienie DNA przez barwnik. W celu zminimalizowania negatywnego wpływu metabolitów
wtórnych na pomiar cytometryczny, należy uzupełnić bufor izolujący o odpowiednie stężenie
przeciwutleniacza (np. PVP-10). Przygotowaną
zawiesinę jąder komórkowych należy inkubować
w lodzie przez ok. 10 minut.
1. Tkankę rośliny badanej oraz standardu wewnętrznego (ok. 10 mg lub 0,5 cm3) rozdrobnić
na płytce Petriego za pomocą ostrej żyletki w
obecności 1 ml buforu izolującego jądra komórkowe (np. Galbraith) z dodatkiem jodku propidyny (50 μl·ml-1) i rybonukleazy A (50 μl·ml-1).
2. Uzyskaną zawiesinę nienaruszonych jąder komórkowych przefiltrować przez filtr nylonowy o
średnicy oczek 50 μm i inkubować próbę przez
czas wyznaczony doświadczalnie, w celu efektywniejszego wniknięcia barwnika fluorochromowego do jąder.
PRZEPROWADZENIE POMIARU:
3. Umieścić próbę w cytometrze i prowadzić pomiar z szybkością od 20-50 jąder/s dla nie mniej
niż 5000-7000 jąder komórkowych oraz nie
mniej niż 1000 jąder w jednym piku [5].
4. Pomiar zawartości jądrowego DNA należy powtórzyć minimum trzykrotnie w trzech kolejnych
dniach.
5. Określić zawartość 2C DNA za pomocą wzoru:
Piśmiennictwo:
[1] Arumuganathan, K, et. al. Nuclear DNA content of some important
plant species. Plant
Molecular Biology Reporter. 1991.
[2] Suda, J. An employment of flow cytometry into plant biosystematics.
PhD. Thesis.Charles University in Prague, Faculty of Science, Department
of Botany. 2004.
[3] Doležel, J, et. al. Plant DNA flow cytometry and estimation of nuclear
genome size. Annals of Botany. 2005.
[4] Małuszyńska, J, et. al. Wybrane metody w badaniach cytogentycznych,
W: Podstawy cytogenetyki roślin. Red. Rogalska, S., Małuszyńska, J.,
Olszewska, M.J., Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa. ISBN 83-0114434-3. 2005.
[5] Śliwińska, E. Zastosowanie cytometrii przepływowej do oznaczania
zawartości DNA u roślin. Postępy Biologii Komórki. 2008.
[6] Śliwińska, E, et. al. Are seeds suitable for flow cytometric estimation of
plant genome? Cytometry. 2005.
21
[7] Jędrzejczyk, I, et. al. Leaves and seeds as materials for flow cytometric
estimation of the genome size of 11 Rosaceae woody species containing
DNA-staining inhibitors. Journal of Botany. 2010.
[8] Galbraith, DW, et. al. Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in
intact plant tissues. Science. 1983.
[9] Lema-Rumińska, J. Flow cytometric analysis of somatic embryos,
shoots, and calli of the cactus Copiapoa tenuissima Ritt. forma
monstruosa. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2011.
[10] Pinto, G, et. al. Analysis of the genetic stability of Eucalyptus globulus
Labill. somatic embryos by flow cytometry. Theoretical and Applied
Genetics. 2004.
[11] Dehghan, E, et. al. Production of tropane alkaloids in diploid and
tetraploid plants and in vitro hairy root cultures of Egyptian henbane
(Hyoscyamus muticus L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2012.
[12] García-Fernádez, A, et. al. Ploidy level and genome size of locally
adapted populations of Silene ciliata across an altitudinal gradient. Plant
Systematic and Evolution. 2012.
[13] Nsabimana, A, et. al. Ploidy investigation of bananas (Musa spp.) from
the National Banana Germplasm Collection at Rubona–Rwanda by flow
cytometry. South African Journal of Botany. 2006.
[14] Obidiegwu, J, et. al. Ploidy levels of Dioscorea alata L. germplasm
determined by flow cytometry. Genetic Resources and Plant Evolution.
2010.
[15] Omidbaigi, R, et. al. Induction and identi-fication of polyploidy in basil
(Ocimum basilicum L.) medicinal plant by colchicine treatment.
International Journal of Plant Production. 2010.
[16] Lourerio, J. Flow cytometric approaches to study plant genomes. PhD
Thesis. Universidade de Aveiro, Departamento de Biologia. 2007.
[17] Łukaszewska, E, et. al. Most organs of sugar-beet (Beta vulgaris L.)
plants at the vegetative and reproductive stages of development are
polysomatic. Sexual Plant Reproduction. 2007.
[18] Olszewska, MJ, et. al. Budowa genomu jądrowego, W: Podstawy
cytogenetyki roślin. Red. Rogalska, S., Małuszyńska, J., Olszewska, M.J.,
Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa. ISBN 83-01-14434-3. 2005.
[19] Rewers, M, et. al. Endoreduplication intensity as a marker of seed
develop-mental stage in the Fabaceae. Cytometry. 2012.
[20] Roudier, F, et. al. Cell cycle function of a Medicago sativa A2-type
cyclin interacting with a PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase and a
retinoblastoma protein. The Plant Journal. 2000.
[21] Lemontey, C, et. al. Maternal genotype influences pea seed size by
controlling both mitotic activity during early embryogenesis and final
endoreduplication level/cotyledon cell size in mature seed. Journal of
Experimental Botany. 2000.
[22] Bennett, MD, et. al. http://data.kew.org/cvalues/. 2012.
[23] Leitch, IJ, et. al. Genome size and its uses: the impact of flow
cytometry, In: Flow Cytometry with Plant Cells: Analysis of Genes,
Chromosomes and Genomes. Doležel, J.,Greilhuber,J., Suda, J., Wiley-VCH
Verlah GmbH &Co.KGaA. 2007.
[24] Fay, MF, et. al. The effects of DNA amount on the quality and utility of
AFLP fingerprints. Annals of Botany. 2005.
[25] Price, HJ, et. al. Sunflower (Helianthus annuus) leaves con-tain
compounds that reduce nuclear propidium iodide fluorescence. Annals of
Botany. 2000.
[26] Marie, D, et. al. A cytometric exercise in plant DNA histograms, with
2C values for 70 species. Biology of the Cell. 1993.
[27] Barow, M, et. al.Lack of correlation between AT frequency and
genome size in higher plants and the effect of nonrandomness of base
sequences on dye binding. Cytometry. 2002.
22
[28] Bennett, MD, et. al. Genome size evolution in plants. (w): The
Evolution of the Genome (red.) Gregory T.R. CA Elsevier, San Diego. 2005c.
[29] Śliwińska, E. Cytometria przepływowa – nowa metoda analizy cyklu
komórkowego i genomu roślin wyższych. Hodowla Roślin i Nasiennictwo.
1993.
[30] Rieseberg, M, et. al. Flow cytometry in biotechnology. Applied of
Microbiology and Biotechnology. 2001.
[31] Shapiro, HM. Cytometry and cytometers: development and growth.
(w): Flow Cytometry with Plant Cells (red.) Doležel J., Greilhuber J., Suda J.
Wiley-VCH, Weinheim, ss: 1–17. 2007.
[32] Kawiak, J., et. al. Cytometria przepływowa w badaniach komórek
i niektóre jej zastosowania lekarskie. Postępy Biologii Komórki. 1992.
[33] Baran, J. Cytometria przepływowa – istota metody i jej wykorzystanie.
Mikrobiologia Medycyna. 1996.
[34] Doležel, J. Flow cytometric analysis of nuclear DNA content in higher
plants. Phytochemical Analysis. 1991.
[35] Godelle, B, et. al. Heterochromatin study demonstrating the nonlinearity of fluorometry useful for calculating genomic base composition.
Cytometry. 1993.
[36] Doležel, J., et. al. Plant genome size estimation by flow cytometry:
Inter-laboratory comparison. Annals of Botany. 1998.
[37] Yokoya, K., et. al. Nuclear DNA amounts in roses. Annals of Botany.
2000
[38] Johnston, J.S., et. al. Reference standards for determination of DNA
content of plant nuclei. American Journal of Botany. 1999
[39] Contim, L.A.S., et. al. Nuclear DNA content and karyotype of
Rosewood (Aniba rosaeodora). Genetics and Molecular Biology. 2005.
[40] Hanson, L., et. al. First nuclear DNA C-values for 18 eudicot families
Annals of Botany. 2005.
[41] Noirot, M., et. al. Nucleus-cytosol interactions – a source of
stoichiometric error in flow cytometric estimation of nuclear DNA content
in plants. Annals of Botany. 2000.
[42] Noirot, M., et. al. Consequences of stoichiometric error on nuclear
DNA content evaluation in Coffea liberica var. dewevrei using DAPI and
propidium iodide. Annals of Botany. 2002.
[43] Noirot, M., et. al. Effects of caffeine and chlorogenic acid on propidium
iodide accessibility to DNA: consequences on genome size evaluation in
coffee tree. Annals of Botany. 2003.
[44] Noirot, M., et. al. Investigation on the causes of steichiometric error in
genome size estimation using heat experiments: consequence on data
interpretation. Annals of Botany. 2005.
[45] Doležel, J., et.al. Sex determination in dioecious plants Melandrium
album and M. rubrumusing high-resolution flow cytometry. Cytometry.
1995.
[46] Costish, DE, et. al. A rapid means of sex identification in Silene
latifolia by use of flow cytometry. Plant Molecular Biology Reporter. 1991.
[47] Małuszyńska, J. et. al. Endopolyploidy in plants. W: Plant Genome
Diveristy. Vol. 2. Red. Leitch IJ, Greilhuber, J., Doležel, J, Wendel, JF.
Springer- Verlag. Wien. 2013.
[48] Śliwinska E. Nuclear DNA content analysis of plant seeds by flow
cytometry. W: In Current Protocols in Cytometry. Red. Robinson, JP,
Darzynkiewicz, Z, Dean PN, Orfao A, Rabinovitch, PS, Stewart, CC, Tanke,
HJ, Wheeless, LL. Wiley. New York. 2006.
[49] Rewers, M, et.al. Endoreduplication in cucumber (Cucumis sativus)
seeds during development, after processing and storage, and during
germination. Annals of Applied Biology. 2009.
HODOWLA CHONDROCYTÓW IN VITRO I JEJ WYKORZYSTANIE
W MEDYCYNIE REGENERACYJNEJ
Katarzyna Dziedzic
Pracownia Inżynierii Komórkowej i Tkankowej
Zakład Biologii Komórki
Praca napisana pod opieką: dr hab. Justyny Drukały
Streszczenie: Rekonstrukcja tkanki chrzęstnej jest ważnym przedsięwzięciem medycyny
regeneracyjnej, podejmowanym ze względu na wysoką częstotliwość jej uszkodzeń
związanych m.in. z wiekiem oraz znikomymi zdolnościami regeneracyjnymi. Obecnie
stosuje się kilka sposobów leczenia urazów chrząstki, jak również podejmowane są próby
jej regeneracji. Jedną z najstarszych, najczęściej stosowanych technik (również w Polsce)
jest abrazja i mikrozłamania mające na celu pobudzenie regeneracji tkanki. Nowoczesne
i stosowane już metody to implantacja autologicznych chondrocytów - ACI (ang.
Autologous Chondrocyte Implantation) oraz bardziej zaawansowana implantacja
autologicznych chondrocytów powiązanych z macierzą - MACI (ang. Matrix Associated
Chondrocytes Implantation). Ponieważ inżynieria tkankowa prężnie rozwija się na tym
polu, w artykule zostaną omówione techniki wykorzystywane do izolacji i hodowli
ludzkich pierwotnych chondrocytów prowadzonej w układzie dwu- i trójwymiarowym.
Proces ten jest skomplikowany ze względu na zjawisko utraty fenotypu przez komórki
chrzęstne spowodowane niską aktywnością proliferacyjną i wysokim stopniem
odróżnicowywania się komórek.
Innym podejściem inżynierii tkankowej jest pozyskiwanie mezenchymalnych komórek
macierzystych (MSC – ang. Mesenchymal Stem Cell) z różnych źródeł (m.in. ze szpiku
kostnego, okostnej i błony maziowej) oraz ich różnicowanie w chondrocyty o różnym
stopniu dojrzałości. Przedstawione zostaną podstawy procesu chondrogenezy, warunki
różnicowania MSC oraz ich potencjał terapeutyczny.
Charakterystyka tkanki chrzęstnej.
Chrząstka to rodzaj tkanki łącznej wyjątkowo
narażonej na uszkodzenia mechaniczne. Składa
się z komórek chrzęstnych (chondrocytów) i macierzy zewnątrzkomórkowej bogatej w proteoglikany
warunkujące
jej
własności
mechanofizyczne [1]. Ze względu na wysoką
częstość urazów, szczególnie chrząstki stawowej, jak również chorób degeneracyjnych postępujących wraz z wiekiem (chondromalacja) bądź
związanych z reakcjami autoimmunologicznymi,
jest jednym z głównych celów inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej. Bardzo ograniczona zdolność tej tkanki do regeneracji stanowi
od wielu lat wyzwanie dla badaczy [2]. Długotrwała hodowla, której poddawane są komórki
pobrane i wyizolowane z tkanki pacjenta ma
wpływ przede wszystkim na ich fenotyp - chondrocyty zmieniają profil swego różnicowania
w kierunku hipertrofii bądź komórek fibroblastopodobnych [3]. Spowodowane jest to m.in.
stopniową utratą możliwości syntezy składników
macierzy zewnątrzkomórkowej przez komórki,
które są umieszczone w nienaturalnym dla siebie otoczeniu [4]. Podawanie pacjentom komó-
rek o niewłaściwym fenotypie powoduje brak
adaptacji autotransplantu, złą integrację z tkanką, zwłóknienia w obrębie ubytku prowadzące
do zwiększonej częstotliwości złamań i szybszego powstawania urazów [5].
Komórki chrzęstne, podobnie jak mezenchymalne komórki macierzyste, wywodzą się z mezodermalnego listka zarodkowego. Organizacja
budowy chrząstki zależy od jej rodzaju. Wyróżniamy tkankę chrzęstną szklistą, włóknistą
i sprężystą. Różnią się one między sobą proporcją macierzy zewnątrzkomórkowej (ang. ECM Extra Cellular Matrix) do liczby komórek, jak
również ich wzajemnym rozmieszczeniem [4].
W organizmie człowieka dominującą tkanką
chrzęstną jest chrząstka szklista pokrywająca
nasady kości długich i powierzchnie stawowe.
Chrząstka stawowa ma budowę warstwową, wyróżnioną na podstawie kształtu komórek i ich
wzajemnego położenia [6]. Zewnętrzna warstwa
powierzchniowa jest bogata w komórki przypominające fibroblasty, poniżej znajduje się warstwa pośrednia z chondrocytami właściwymi
(z niej izoluje się komórki do hodowli) oraz naj-
23
Dziedzic K. „Hodowla chondrocytów in vitro i_jej wykorzystanie w_medycynie regeneracyjnej” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
głębsza warstwa w miejscu przechodzenia
chrząstki w kość, zawierająca zwapniałe komórki chrzęstne. Główną funkcją chondrocytów jest
produkcja składników ECM – białek i proteoglikanów. Skład i budowa macierzy mają istotny
wpływ na właściwości tej tkanki. Wśród białek
macierzy wyróżniamy kolageny, a wśród nich na
szczególną uwagę zasługuje kolagen typu II,
obecny tylko w tkance chrzęstnej. Proteoglikany
stanowią nawet 40% jej suchej masy, składają
się z glikozaminoglikanów (siarczan chondroityny A i C oraz siarczan keratanu), kowalencyjnie
związanych z rdzeniem białkowym [7]. Większość z nich ma zdolność do tworzenia kompleksów, a także do niekowalencyjnego łączenia się
z kwasem hialuronowym dzięki globularnej domenie obecnej w rdzeniu białkowym. Głównym
ich przedstawicielem jest agrekan. Odporność
chrząstki na odkształcenia mechaniczne jest
uzależniona od obecności proteoglikanów posiadających usiarczanowane glikozaminoglikany,
które mają zdolność do wiązania wody. Cecha ta
decyduje o silnym uwodnieniu tkanki warunkując jej prawidłowe funkcjonowanie [1]. Wykorzystuje się ją również do oznaczania składników
macierzy podczas barwienia błękitem alcjanu.
Ze względu na gęste usieciowanie macierzy
przez kolagen i proteoglikany, chrząstka jest
tkanką nieunaczynioną i nieunerwioną, co znacząco ogranicza jej zdolności regeneracyjne [8,
9].
Ubytki chrząstki i sposoby ich leczenia.
Badania epidemiologiczne wskazują, że uszkodzenia tkanki chrzęstnej stanowią bardzo poważny problem i jedną z najczęściej
występujących dolegliwości związanych z układem narządu ruchu. Według ankiety dotyczącej
terapii komórkowych prowadzonych w krajach
europejskich (European Practice of Cellular and
Engineered Tissue Therapies) regeneracja
chrząstki pozostaje niezmiennie od kilku lat najbardziej popularnym celem inżynierii komórkowej i tkankowej. Wyróżniamy 3 stopnie urazów
chrząstki stawowej:
1) uszkodzenie powierzchni stawowej niewpływające na mechanikę stawu,
2) mechaniczne uszkodzenie ograniczające się
do części chrzęstnej,
3) mechaniczne uszkodzenie obejmujące zarówno część chrzęstną jak i kostną stawu.
Urazy chrząstki następują w wyniku kontuzji i
odłamania fragmentu chrząstki bądź określonej
jednostki chorobowej (chondromalacja lub reumatoidalne zapalenie stawów, zespół przedwczesnego zużywania się chrząstki stawowej) –
przyczyny wtórne, lub podeszłego wieku i
wzmożonej aktywności procesów degeneracyjnych prowadzących do mikrozłamań – przyczyny
pierwotne [10].
Ubytki chrząstki próbowano leczyć na wiele
sposobów. Jednym z pierwszych było usunięcie
24
wszelkich elementów drażniących, bardziej w
celu zahamowania rozwoju choroby niż jej wyleczenia (ang. debridement), opracowane w 1941
przez Magnussona [2]. Krótką charakterystykę
najważniejszych metod zebrano w Tabeli 1.
Tabela 1 . Trzy generacje terapii ubytków chrząstki
Chondrogeneza.
Proces formowania się tkanki chrzęstnej, zwany
chondrogenezą, zachodzi stosunkowo wcześnie
podczas embriogenezy, gdyż chrząstka jest
pierwotną tkanką szkieletową. W rozwoju postnatalnym proces ten zachodzi w trakcie wzrostu
kości na długość i rozrostu chrząstki [11]. Do tej
pory więcej wiadomo o cząsteczkach sygnałowych odpowiedzialnych za chondrogenezę niż
o czynnikach transkrypcyjnych leżących u jej
podłoża. Z pewnością można stwierdzić, że jednym z czynników inicjujących jest SOX9 (ang.
SRY (sex determining region Y) - box 9). Dowiedziono, że wiąże się on do sekwencji regulatorowych w genie kolagenu II (Col2a1) aktywując
jego ekspresję. W badaniach prowadzonych na
chimerycznych mysich embrionach SOX9+/i SOX9-/- wykazano, iż czynnik ten bezpośrednio
warunkuje pochodzenie chondrocytów. W pierwszym przypadku rozwój myszy SOX9+/- przebiegał całkowicie normalnie, natomiast w drugim
badania histologiczne potwierdziły obecność
tkanki chrzęstnej w obrębie komórek dzikich,
zaś prechondrocytarne komórki macierzyste pozbawione SOX9 nie były w stanie różnicować się
w chondrocyty [12]. Autorzy sugerują, że stwierdzone przez nich oddzielenie przestrzenne komórek zmutowanych od dzikich może być
związane z brakiem ekspresji pewnych molekuł
adhezyjnych w przypadku komórek SOX9-/-. Ma
to ogromne znaczenie w procesie chondrogenezy, która rozpoczyna się od agregacji MSC, a na-
Rys. 2 Proces chondrogenezy.
stępnie polega na ich różnicowaniu się odpowiednio w progenitory i prekursory chondrocytów, głównie pod wpływem białek z nadrodziny
transformujących czynników wzrostu (TGF-β,
BMP4, BMP7). Dzieje się to poprzez sygnalizację
za pośrednictwem kaskady kinaz MAP bądź białek Smad [13].
Kolejna grupa badawcza wykazała, że inaktywacja SOX9 przed agregacją MSC daje wymienione
wyżej efekty, zaś dokonana po niej skutkuje
achondroplazją bądź zatrzymaniem komórek w
fazie mezenchymalnej grudki. Niebagatelny skutek równoczesnego obniżenia poziomu ekspresji
Indian hedgehog (Ihh) i receptora Pth wskazał
na ich związek z rozwojem i homeostazą tkanki
chrzęstnej [14]. Ihh i peptyd PTH-podobny
(PTHrP ang. parathyroid hormone related peptide) to czynniki wzrostu działające zarówno w
sposób zależny jak i niezależny od siebie regulując proces rozwoju szkieletu [15]. Komórki
ochrzęstnej wydzielają PTHrP, co wskutek transdukcji sygnału poprzez receptor PTHrP związany z małymi białkami G, obecny na powierzchni
chondrocytów prehipertroficznych, powoduje
spowolnienie ich dalszego różnicowania się.
W konsekwencji wydzielają one Ihh, które powoduje wzrost poziomu ekspresji PTHrP. Wypadkowym skutkiem tej wzajemnej interakcji jest
zahamowanie powstawania hipertroficznych
chondrocytów, co opóźnia proces kościotworzenia o podłożu chrzęstnym [11]. Fibroblastopodobne czynniki wzrostu (FGF) działają
antagonistycznie do Ihh i są uważane za negatywne regulatory proliferacji komórek chrząstki.
Kontrolę nad przejściem pomiędzy chondrocytem prehipertroficznym a hipertroficznym sprawuje szlak Wnt, w tym głównie Wnt14 [16]. Jest
to marker molekularny pełniący kluczową rolę w
procesie powstawania i formowania stawów, którego ekspresja i funkcja może być zależna bądź
niezależna od pętli PTHrP-Ihh [6].
Potencjalne źródła komórek wykorzystywanych do regeneracji chrząstki.
Biorąc pod uwagę dobrze poznany i scharakteryzowany szlak chondrogenezy, naturalnym kierunkiem poszukiwania źródła komórek
wykorzystywanych w celu regeneracji tkanki są,
oprócz chondrocytów, mezenchymalne komórki
macierzyste. Można je pozyskiwać z wielu nisz
tkankowych. Najbardziej popularnie stosowane
są MSC pochodzące ze szpiku kostnego [17, 18].
Wykazano ich wysoki potencjał różnicowania w
kierunku chondrocytów, a ze względu na stosunkową łatwość izolacji są najczęściej wykorzystywane do badań nad chondrogenezą [19]. MSC
mogą być izolowane także z okostnej, ochrzęstnej oraz błony maziowej. W badaniach porównujących zdolność do odtwarzania tkanki
chrzęstnej prowadzonych na MSC różnego pochodzenia dowiedziono najlepszych właściwości
MSC izolowanych z błony maziowej [21]. Badacze sięgnęli po różne tkanki, m.in. tkankę kostną
próbując wykorzystać ją jako stymulator chondrogenezy, jednak efekt był niezadowalający
[20]. Wykorzystywano również inne rodzaje
tkanki chrzęstnej, np. tkankę chrzęstną sprężystą z przegrody nosowej. Badania przeprowadzone w 2002 r. zgodnie z ówczesnym stanem
wiedzy dały przełomowy wynik, wskazując na
niesamowicie wysoką zdolność komórek z przegrody nosowej do produkcji składników ECM
[9]. Biorąc pod uwagę aktualne wyniki badań,
można stwierdzić, że porównywane hodowle
chondrocytów stawowych i z przegrody nosowej
prowadzone były w nieodpowiednich warunkach, co miało niekorzystny wpływ na wynik.
Uważa się, że wykorzystywanie komórek wywodzących się z chrząstki sprężystej na powierzchniach stawowych jest niebezpieczne ze względu
na możliwość ich powrotu do pierwotnego fenotypu. Przeprowadzono również szereg badań
z wykorzystaniem multipotencjalnych komórek
25
macierzystych wyizolowanych z tkanki tłuszczowej. Mogą one różnicować się w komórki prekursorowe wspólne dla osteocytów i
chondrocytów, które pod wpływem SOX9 dają
początek chondrocytom, a pod wpływem m.in.
RunX2 osteocytom [22]. Komórki uzyskiwane z
tkanki tłuszczowej mają kilka podstawowych zalet: są łatwo dostępne w dużej ilości, ich pozyskiwanie nie stwarza dodatkowego ryzyka (nie
narusza się uszkodzonej już tkanki), a ich właściwości nie odbiegają od MSC pozyskiwanych
ze szpiku kostnego [23]. Stwierdzono, że kokultura ASC (ang. Adipose derived Stem Cells) z
chondrocytami powoduje przyspieszenie tempa
proliferacji komórek chrzęstnych oraz stymuluje
formowanie ECM. Ponadto dowiedziono, że ASC
izolowane z podrzepkowego fałdu tłuszczowego
mają zdolność do dłuższego utrzymywania fenotypu w hodowli in vitro niż chondrocyty [24].
Hodowle w układzie trójwymiarowym. Podłoża hodowlane.
Zjawisko odróżnicowywania się komórek
chrzęstnych prowadzące do utraty ich pierwotnego fenotypu jest jednym z największych problemów hodowli in vitro chondrocytów. W
tkance rezydują one po kilka w jamkach zagłębionych w bogatej macierzy zewnątrzkomórkowej. Liczba komórek przypadająca na cm2
chrząstki jest niewielka, zatem również wydajna
izolacja jest czynnikiem limitującym. Opracowanie i optymalizacja protokołu pozyskania komórek z tkanki chrzęstnej różnych gatunków
zwierząt przebiegła w o wiele prostszy sposób
niż próba ustalenia optymalnych warunków hodowli [25]. Kluczowe okazało się zwrócenie
uwagi na typ podłoża i układ przestrzenny hodowli. Założono, że komórki z natury słabo adherentne zmuszone do wzrostu na
polistyrenowych naczyniach hodowlanych będą
tracić swój prawidłowy fenotyp. Najprostszym
sposobem stworzenia komórkom trójwymiarowych sieci było zatapianie w agarozie, tworzenie
kultur peletowych i tzw. „mikromas” [26]. W tym
celu wysiewano komórki na bloczki agarozowe,
bądź poprzez wirowanie przy prędkości 120–500
g tworzono pelety komórkowe, które następnie
inkubowano w polistyrenowych probówkach w
37oC (5% CO2, 95% wilgotności) przez 48 godziny, a potem umieszczano na szalkach Petriego i hodowano w odpowiedniej pożywce [27]. Te
pierwotne systemy trójwymiarowe sprawdziły
się w wielu laboratoriach ze względu na ich prostotę, niski koszt uzyskania (bez użycia specjalistycznego sprzętu) i stosunkowo dobre
odzwierciedlenie warunków in vivo. Najważniejszymi czynnikami różniącymi je od zwykłych hodowli w monowarstwie jest zapewnienie
warunków hipoksji komórkom znajdującym się w
centrum peletu, odzwierciedlenie gradientowej
dystrybucji substancji odżywczych oraz uniemożliwienie przylegania komórek do ściany na-
26
czynia [3]. Ten ostatni czynnik ma duże znaczenie dla ekspresji niektórych receptorów powierzchniowych, a przez to wpływa na
transdukcję sygnału, migrację komórek i ekspresję proteaz. Kolejną generacją produktów do
hodowli chondrocytów w 3D są różnego rodzaju
kapsuły m.in. z alginianu; PLGA, czy też κ-karagen. Wielkie nadzieje pokłada się w strukturach
utworzonych z karagenu. Ten izolowany z krasnorostów polisacharyd jest bogaty w grupy
siarczanowe, co po pierwsze upodabnia charakter jego struktury do macierzy chrzęstnej, a po
drugie zwiększa jego hydrofilowy charakter.
Tworzy się z niego hydrożele w formie płatów
lub kapsuł, w których hodowane są komórki. Popa et al. badali jego biokompatybilność z chondrocytami
różnego
pochodzenia
(linii
komórkowej, z przegrody nosowej i powstałych z
ASC). Testy wykazały, że związek ten ma dużą
zdolność do gromadzenia wody i pozwala na zachowanie przez komórki zdolności do podziałów,
produkcji składników macierzy zewnątrzkomórkowej oraz ekspresji markerów chondrocytarnych. Właściwości te utrzymywane są niestety
w ograniczonym czasie – do 14 dni w hodowli in
vitro. Rozwiązanie to ma jednak duży potencjał
aplikacyjny, gdyż nałożenie płatka bądź kapsuł
z komórkami ułatwia ich adhezję do miejsca
ubytku [28]. Badania przeprowadzone przez Caron i wsp. porównują hodowlę dwuwymiarową w
postaci warstwy komórek na dnie naczynia z
najprostszymi układamy trójwymiarowymi: kulturą peletową i hodowlą w kulkach alginianowych [3]. Analiza tempa wzrostu, zdolności
syntezy składników macierzy (kolagen II, GAG)
oraz ekspresji markerów chondrocytów prawidłowych (m.in. SOX9) i hipertroficznych
(COL10A1 i RUNX2) prowadzi do stwierdzenia,
że układ 3D ogranicza tempo proliferacji komórek przy równoczesnym zachowaniu ich prawidłowego fenotypu unikając hipertrofii.
Najnowsze badania opierają się na technologii
„cell-sheet”, która polega na nieenzymatycznym
odrywaniu płatów komórek (dzięki naczyniom
stopniowo obniżającym temperaturę) i ich późniejszym składaniu w 3–5 warstwowe układy 3D
wszczepiane w miejsce ubytku. Technologia ta
powiązana ze stymulacją komórek związkiem
TD-198946 dała bardzo obiecujące rezultaty na
modelach mysich i psich [29]. Ze względu na
wysokie koszty procedur dwuelementowych
(z wykorzystaniem komórek i nośników), długi
czas potrzebny do wyhodowania odpowiedniej
liczby komórek oraz komplikacje związane z pobraniem materiału do hodowli, uwagę badaczy
zwróciła metoda niewykorzystująca komórek,
a jedynie arkusze żelu kolagenu I. Procedura ta
zakłada wykorzystanie zdolności migracyjnej komórek chrzęstnych i kompatybilność żeli kolagenowych
z
ECM
chrząstki.
Próba
przeprowadzona na 15 pacjentach wskazuje na
całkowitą integrację wprowadzonego nośnika z
otaczającą tkanką oraz zasiedlenie go przez
chondrocyty, co monitorowano nieinwazyjną metodą MRI (ang. Magnetic Resonance Imaging)
[30]. Brakuje długotrwałych analiz związanych z
tworzeniem przez implant chrząstki włóknistej,
a co za tym idzie wzrostu ryzyka dalszych urazów mechanicznych; jednak sam kierunek badań
wydaje się być interesujący.
fenotyp komórek właściwych w hodowli bądź w
celu ich powrotnego różnicowania [25]. Zarówno TGF-β1 jak i BMP-2 indukują produkcję kolagenu II in vitro. Ponadto BMP-2 wykazuje
zdolność do wspomagania procesu różnicowania
komórek chrzęstnych odróżnicowanych w wyniku ekspansji [31].
Udział czynników wzrostu. Triada inżynierii
tkankowej.
Podsumowanie
Następnym celem optymalizacji warunków hodowli chondrocytów stały się różne czynniki
wzrostu [31, 32]. Omawiana wcześniej technika
ACI zgodnie z definicją Europejskiej Komisji Inżynierii Tkankowej nie może być uznana jako zastosowanie bądź produkt inżynierii tkankowej,
gdyż nie spełnia wymogu obecności trzech czynników (tzw. triady): komórek, nośnika i czynników wzrostu. Podstawowymi czynnikami
wzrostu wykorzystywanymi do hodowli chondrocytów są te cząstki sygnałowe, które biorą znaczący udział w procesie chondrogenezy, m.in.
TGF-β1,3; BMP-2,4,7; IGF oraz bFGF. Stosuje się
je nie tylko w celu indukcji różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych w kierunku
chondrocytów, ale również po to, by utrzymać
Mimo wielkiego postępu medycyny regeneracyjnej i ogromnego rozwoju inżynierii tkankowej,
leczenie ubytków chrząstki stawowej nadal pozostaje problematyczne. Z roku na rok wzrasta
zainteresowanie tą tematyką badawczą, czego
przejawem jest ciągły wzrost liczby publikacji
naukowych dostępnych w bazie PubMed z nieco
ponad 100 w 1997 roku do 354 w roku 2012.
Macierze hialuronowe i kolagenowe z zasocjowanymi komórkami bądź kapsuły zawierające
chondrocyty to z pewnością jedne z ciekawszych
i bardzo obiecujących kierunków badań. Ponadto pozostało wciąż wiele pytań dotyczących molekularnych mechanizmów warunkujących
homeostazę tkanki chrzęstnej, które wymagają
odpowiedzi.
Piśmiennictwo:
[1] U. Meyer, H.P. Wiesmann, Bone and cartilage engineering. Springer,
2006.
[2] E. B. Hunziker, “Articular cartilage repair: basic science and clinical
progress. A review of the current status and prospects.,” Osteoarthritis
and Cartilage, vol. 10, no. 6, pp. 432–463, Jun. 2002.
[3] M. M. J. Caron, P. J. Emans, M. M. E. Coolsen, L. Voss, D. a M. Surtel, a
Cremers, L. W. van Rhijn, and T. J. M. Welting, “Redifferentiation of
dedifferentiated human articular chondrocytes: comparison of 2D and 3D
cultures.,” Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research
Society, vol. 20, no. 10, pp. 1170–8, Oct. 2012.
[4] K. E. Kuettner, B. U. Pauli, G. Gall, V. a Memoli, and R. K. Schenk,
“Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I.
Isolation, culture characteristics, and morphology.,” The Journal of cell
biology, vol. 93, no. 3, pp. 743–50, Jun. 1982.
[5] J. S. Temenoff and a G. Mikos, “Review: tissue engineering for
regeneration of articular cartilage.,” Biomaterials, vol. 21, no. 5, pp.
431–40, Mar. 2000.
[6] G. Karsenty and E. F. Wagner, “Reaching a genetic and molecular
understanding of skeletal development.,” Developmental cell, vol. 2, no. 4,
pp. 389–406, Apr. 2002.
[7] D. J. Behonick and Z. Werb, “A bit of give and take: the relationship
between the extracellular matrix and the developing chondrocyte,”
Mechanisms of Development, vol. 120, no. 11, pp. 1327–1336, Nov. 2003.
[8] N. Ortega, D. J. Behonick, and Z. Werb, “Matrix remodeling during
endochondral ossification.,” Trends in cell biology, vol. 14, no. 2, pp.
86–93, Feb. 2004.
[9] W. Kafienah, M. Jakob, O. Démarteau, A. Frazer, M. D. Barker, I. Martin,
and A. P. Hollander, “Three-dimensional tissue engineering of hyaline
cartilage: comparison of adult nasal and articular chondrocytes.,” Tissue
engineering, vol. 8, no. 5, pp. 817–26, Oct. 2002.
[10] T. Aigner, S. Söder, P. M. Gebhard, A. McAlinden, and J. Haag,
“Mechanisms of disease: role of chondrocytes in the pathogenesis of
osteoarthritis--structure, chaos and senescence.,” Nature clinical practice.
Rheumatology, vol. 3, no. 7, pp. 391–9, Jul. 2007.
[11] E. F. Wagner and G. Karsenty, “Genetic control of skeletal
development.,” Current opinion in genetics & development, vol. 11, no. 5,
pp. 527–32, Oct. 2001.
[12] W. Bi, J. M. Deng, Z. Zhang, R. R. Behringer, and B. de Crombrugghe,
“Sox9 is required for cartilage formation.,” Nature genetics, vol. 22, no. 1,
pp. 85–9, May 1999.
[13] M. F. Pittenger, a M. Mackay, S. C. Beck, R. K. Jaiswal, R. Douglas, J. D.
Mosca, M. a Moorman, D. W. Simonetti, S. Craig, and D. R. Marshak,
“Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.,” Science
(New York, N.Y.), vol. 284, no. 5411, pp. 143–7, Apr. 1999.
[14] H. Akiyama, M.-C. Chaboissier, J. F. Martin, A. Schedl, and B. de
Crombrugghe, “The transcription factor Sox9 has essential roles in
successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is
required for expression of Sox5 and Sox6.,” Genes & development, vol.
16, no. 21, pp. 2813–28, Nov. 2002.
[15] B. St-Jacques, M. Hammerschmidt, and a P. McMahon, “Indian
hedgehog signaling regulates proliferation and differentiation of
chondrocytes and is essential for bone formation.,” Genes &
development, vol. 13, no. 16, pp. 2072–86, Aug. 1999.
[16] C. Hartmann and C. J. Tabin, “Wnt-14 plays a pivotal role in inducing
synovial joint formation in the developing appendicular skeleton.,” Cell,
vol. 104, no. 3, pp. 341–51, Feb. 2001.
[17] a M. Mackay, S. C. Beck, J. M. Murphy, F. P. Barry, C. O. Chichester,
and M. F. Pittenger, “Chondrogenic differentiation of cultured human
mesenchymal stem cells from marrow.,” Tissue engineering, vol. 4, no. 4,
pp. 415–28, Jan. 1998.
[18] J. U. Yoo, T. S. Barthel, K. Nishimura, L. Solchaga, a I. Caplan, V. M.
Goldberg, and B. Johnstone, “The chondrogenic potential of human bonemarrow-derived mesenchymal progenitor cells.,” The Journal of bone and
joint surgery. American volume, vol. 80, no. 12, pp. 1745–57, Dec. 1998.
[19] I. Pountos, D. Corscadden, P. Emery, and P. V Giannoudis,
“Mesenchymal stem cell tissue engineering: techniques for isolation,
expansion and application.,” Injury, vol. 38 Suppl 4, pp. S23–33, Sep.
2007.
[20] J. Dai, J. Wang, J. Lu, D. Zou, H. Sun, Y. Dong, H. Yu, L. Zhang, T. Yang,
X. Zhang, X. Wang, and G. Shen, “The effect of co-culturing costal
chondrocytes and dental pulp stem cells combined with exogenous FGF9
protein on chondrogenesis and ossification in engineered cartilage.,”
Biomaterials, vol. 33, no. 31, pp. 7699–711, Nov. 2012.
[21] Y. Sakaguchi, I. Sekiya, K. Yagishita, and T. Muneta, “Comparison of
human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority
of synovium as a cell source.,” Arthritis and rheumatism, vol. 52, no. 8,
pp. 2521–9, Aug. 2005.
[22] P. Central, “Molecular and cellular characterization during
chondrogenic ...,” 2005.
[23] L. Wu, X. Cai, S. Zhang, M. Karperien, and Y. Lin, “Regeneration of
articular cartilage by adipose tissue derived mesenchymal stem cells:
Perspectives from stem cell biology and molecular medicine.,” Journal of
cellular physiology, vol. 228, no. 5, pp. 938–44, May 2013.
[24] a. English, E. a. Jones, D. Corscadden, K. Henshaw, T. Chapman, P.
Emery, and D. McGonagle, “A comparative assessment of cartilage and
joint fat pad as a potential source of cells for autologous therapy
development in knee osteoarthritis,” Rheumatology, vol. 46, no. 11, pp.
1676–1683, Nov. 2007.
[25] A. Barbero and I. Martin, “Human articular chondrocytes culture.,”
Methods in molecular medicine, vol. 140, pp. 237–47, Jan. 2007.
[26] B. K. Babur, P. Ghanavi, P. Levett, W. B. Lott, T. Klein, J. J. CooperWhite, R. Crawford, and M. R. Doran, “The Interplay between Chondrocyte
Redifferentiation Pellet Size and Oxygen Concentration,” PLoS ONE, vol. 8,
no. 3, p. e58865, Mar. 2013.
[27] F. H. Chen, K. T. Rousche, and R. S. Tuan, “Technology Insight: adult
stem cells in cartilage regeneration and tissue engineering.,” Nature
clinical practice. Rheumatology, vol. 2, no. 7, pp. 373–82, Jul. 2006.
[28] E. Popa, R. Reis, and M. Gomes, “Chondrogenic phenotype of different
cells encapsulated in κ-carrageenan hydrogels for cartilage regeneration
strategies.,” Biotechnology and applied biochemistry, vol. 59, no. 2, pp.
132–41, Mar. 2012.
[29] F. Yano, H. Hojo, S. Ohba, T. Saito, M. Honnami, M. Mochizuki, T.
Takato, H. Kawaguchi, and U.-I. Chung, “Cell-sheet technology combined
with a thienoindazole derivative small compound TD-198946 for cartilage
regeneration.,” Biomaterials, pp. 1–7, Apr. 2013.
[30] T. Efe, C. Theisen, S. Fuchs-Winkelmann, T. Stein, A. Getgood, M. B.
Rominger, J. R. J. Paletta, and M. D. Schofer, “Cell-free collagen type I
matrix for repair of cartilage defects-clinical and magnetic resonance
imaging results.,” Knee surgery, sports traumatology, arthroscopy  : official
journal of the ESSKA, vol. 20, no. 10, pp. 1915–22, Oct. 2012.
[31] A.-M. Freyria and F. Mallein-Gerin, “Chondrocytes or adult stem cells
for cartilage repair: the indisputable role of growth factors.,” Injury, vol.
43, no. 3, pp. 259–65, Mar. 2012.
[32] N. D. Miljkovic, G. M. Cooper, and K. G. Marra, “Chondrogenesis, bone
morphogenetic protein-4 and mesenchymal stem cells.,” Osteoarthritis
and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society, vol. 16, no. 10, pp.
1121–30, Oct. 2008.
[33] J. R. Steadman, K. K. Briggs, J. J. Rodrigo, M. S. Kocher, T. J. Gill, and W.
G. Rodkey, “Outcomes of microfracture for traumatic chondral defects of
the knee: average 11-year follow-up.,” Arthroscopy  : the journal of
arthroscopic & related surgery  : official publication of the Arthroscopy
Association of North America and the International Arthroscopy
Association, vol. 19, no. 5, pp. 477–84, 2003.
[34] M. Brittberg, “Autologous chondrocyte transplantation,” Clinical
orthopaedics and related research, vol. 26, no. 4, pp. 123–129, 1999.
[35] E. Rodríguez-Merchán, “The Treatment of Cartilage Defects in the
Knee Joint: Microfracture, Mosaicplasty, and Autologous Chondrocyte
Implantation,” American journal of orthopedics ( …, vol. 41, no. 5, pp.
236–239, 2012.
[36] G. Filardo, E. Kon, A. Di Martino, S. Patella, G. Altadonna, F. Balboni, L.
Bragonzoni, A. Visani, and M. Marcacci, “Second-generation arthroscopic
autologous chondrocyte implantation for the treatment of degenerative
cartilage lesions.,” Knee surgery sports traumatology arthroscopy official
journal of the ESSKA, vol. 20, no. 9, pp. 1704–13, Sep. 2011.
[37] G. Filardo, E. Kon, M. Berruto, A. Di Martino, S. Patella, G. M.
Marcheggiani Muccioli, S. Zaffagnini, and M. Marcacci, “Arthroscopic
second generation autologous chondrocytes implantation associated with
bone grafting for the treatment of knee osteochondritis dissecans: Results
at 6years.,” The Knee, vol. 19, no. 5, pp. 6–11, Oct. 2011.
[38] G. Zhou, W. Liu, L. Cui, X. Wang, T. Liu, and Y. Cao, “Repair of porcine
articular osteochondral defects in non-weightbearing areas with
autologous bone marrow stromal cells.,” Tissue Engineering, vol. 12, no.
11, pp. 3209–3221, 2006.
[39] M. Marcacci, M. Berruto, D. Brocchetta, A. Delcogliano, D. Ghinelli, A.
Gobbi, E. Kon, L. Pederzini, D. Rosa, G. L. Sacchetti, G. Stefani, and S.
Zanasi, “Articular Cartilage Engineering with Hyalograft C,” Clinical
Orthopaedics and Related Research, vol. &NA;, no. 435, pp. 96–105, Jun.
2005.
CHARAKTERYSTYKA KOMÓREK MACIERZYSTYCH NASKÓRKA
Łukasz Sabat
Pracownia Inżynierii Komórkowej i Tkankowej
Zakład Biologii Komórki
Praca napisana pod opieką: dr hab. Justyny Drukały
Streszczenie: Praca przedstawia charakterystykę nisz komórek macierzystych naskórka
znajdujących się w skórze: ich położenie, cechy fenotypowe oraz zdolności proliferacyjne.
Przeprowadzone badania na modelu komórek mysich jak i ludzkich stwierdziły obecność
kilku miejsc będących rezerwuarem tych właśnie komórek. Rejony te zawierają
heterogenną populację komórek wzbogaconą w KM mające charakter unipotencjalny, jak i
multipotencjalny. Te drugie są bardzo ważne dla prężnie rozwijającej się w ostatnim czasie
inżynierii tkankowej, gdzie mogłyby być wykorzystane do przeprowadzania rekonstrukcji
różnych tkanek in vitro. Zawarty jest także opis markerów powierzchniowych dla
potencjalnych KM naskórka zarówno ludzkiego jak i mysiego, które pozwoliły na ich
efektywną izolację. Badania mające na celu wykrycie nisz epitelialnych komórek
macierzystych pokazały, że konkretne regiony zawierające te właśnie komórki cechują się
różną ekspresją markerów powierzchniowych tych komórek u gryzoni i u ludzi. Sprawiło to
badaczom trudność, głównie w wyizolowaniu czystych, ludzkich KM naskórka. Znacznym
problemem jest brak dostatecznej wiedzy na temat kontroli w utrzymaniu przez nie
pierwotnego fenotypu w trakcie przenoszenia do hodowli in vitro.
Wstęp
Skóra stanowi największy narząd naszego ciała,
zajmując u dorosłego człowieka powierzchnię
ok. 2 m2. Składa się z 3 podstawowych warstw:
tkanki podskórnej, skóry właściwej oraz naskórka, który tworzą komórki pochodzenia ektodermalnego [7]. W skład powierzchownej,
0,5-milimetrowej warstwy naskórka wchodzą
głównie keratynocyty, melanocyty oraz komórki
Langerhansa. Zwarty układ tych komórek epitelialnych oraz produkcja substancji antybakteryjnych chroni tkanki leżące poniżej, a tym samym
cały organizm przed urazami mechanicznymi,
szkodliwym promieniowaniem UV oraz patogenami mogącymi zaburzyć homeostazę organizmu.
Naskórek składa się z kilku warstw różniących
się grubością w zależności od miejsca jego występowania. W momencie przerwania ciągłości
tkanki, np. na wskutek urazu mechanicznego,
komórki wykazują zwiększoną intensywność podziałów komórkowych, mających na celu zregenerowanie uszkodzonego obszaru.
Ludzki naskórek ulega wymianie na nowy co 46 tygodni [18]. W przypadku komórek epitelialnych, proces ten polega na „wypychaniu” komórek z niższych obszarów do coraz wyższych
warstw. Ta wędrówka indukuje w komórce zmiany fenotypowe. Ulega ona odwodnieniu, zmienia
się profil ekspresji genów, ostatecznie prowa-
dzący do zatrzymania jej funkcji życiowych, co
obserwujemy właśnie jako łuszczenie i odpadanie warstwy zrogowaciałej. Ta ciągła przebudowa związana jest z obecnością komórek
charakteryzujących się nieograniczoną zdolnością proliferacyjną, jakimi są komórki macierzyste. Przeprowadzone próby wykrycia oraz
wyodrębnienia populacji komórek macierzystych
naskórka przyniosły pozytywne rezultaty. Dla ich
zidentyfikowania obecnie stosuje się znakowanie
z wykorzystaniem markerów, tj: β1-integryna
oraz α6- integryna [9], cytokeratyna 15 [14],
CD34 [21], CD200 [16] itp.
Miejsca występowania komórek macierzystych naskórka.
Komórki macierzyste cechują się nieograniczoną
zdolnością proliferacyjną oraz możliwością różnicowania w różne typy komórek. W warunkach
in vivo komórki te charakteryzują się bardzo
wolnym cyklem komórkowym, co zabezpiecza je
przed nagromadzeniem szkodliwych mutacji
[20]. Jest to ważna cecha zapobiegająca niekorzystnym zmianom materiału genetycznego, które i tak mają miejsce w wierzchnich warstwach
skóry, przykładowo na wskutek szkodliwego
działania promieniowania UV. W warunkach in
vitro komórki radykalnie zmieniają częstotliwość
podziałów mitotycznych. Szybko ulegają podzia-
29
Sabat Ł. ”Charakterystyka komórek macierzystych naskórka” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
stawnej, rejon wybrzuszenia, leżący w pobliżu
gruczołu łojowego oraz macierz germinalna
mieszka włosowego [8].
Sabat_rys.2.jpg
łom i różnicują tracąc swoje cenne, pierwotne
właściwości.
Komórka macierzysta może ulegać dwóm różnym podziałom komórkowym: symetrycznemu
oraz asymetrycznemu. W wyniku podziału symetrycznego powstają dwie komórki macierzyste
bądź dwie komórki ulegające dalszemu różnicowaniu w konkretny typ komórki. Podział asymetryczny prowadzi do powstania jednej komórki
macierzystej, odtwarzającej pulę KM, oraz jednej komórki progenitorowej, zdolnej do wyróżnicowania, dając początek linii komórek dla typu
danej tkanki.
Jak dotąd stwierdzono wiele potencjalnym
miejsc będących niszami dla różnych rodzajów
komórek macierzystych. Najważniejszymi ich
źródłami są: szpik kostny, krew pępowinowa,
węzeł zarodkowy oraz dojrzałe tkanki. Pierwsze
dwa znacząco ograniczają swobodny dostęp do
KM, a izolacja z węzła zarodkowego wzbudza
wiele kontrowersji. Z tych też powodów poszukuje się innych miejsc łatwo dostępnych dla badaczy i nie naruszających kwestii etycznych w
sposobie ich izolacji. Miejscem takim jest z pewnością skóra. Badacze stwierdzili obecność kilku
miejsc, w których rezydują komórki macierzyste
naskórka. Należą do nich: obszar warstwy pod-
30
Jednym z pierwszych doniesień, na podstawie
których stwierdzono obecność w naskórku (a dokładnie w obszarze warstwy podstawnej) puli
KM, było doświadczenie przeprowadzone przez
Pottena [19], w którym komórki znakowano BrdU - analogiem tymidyny. Doświadczenie przeprowadzono na modelu mysim, a
jego założeniem było zwizualizowanie komórek
cechujących się wydłużonym cyklem komórkowym. Związek ten podawano do komórek i
oczekiwano jego wbudowania się do nowo powstałej nici DNA, dającej początek nowej komórce. Przypuszczenia były słuszne, BrdU został
wbudowany, a poprzez zastosowanie specyficznych przeciwciał sprzęgniętych z barwikiem
fluorescencyjnym możliwa była jego wizualizacja. Te, które charakteryzowały się intensywnymi zdolnościami proliferacyjnymi, na początku
wykazywały intensywny sygnał fluorescencyjny,
jednak po pewnym czasie szybko traciły znacznik, na wskutek jego stopniowego rozcieńczenia
do komórek potomnych. Oprócz tych komórek
wykryto obecność też takich, które zachowywały znacznik przez bardzo długi czas,
gdyż rzadko przechodziły podziały komórkowe. Te właśnie komórki uznano za potencjalne
komórki macierzyste naskórka i
określono jako label retaining cells (LRC),
czyli długo zatrzymujące znacznik. U myszy
detekcja komórek macierzystych poprzez takie
znakowanie w obszarze warstwy podstawnej
sięgała nawet 20 tygodni [4].
Jak już wcześniej wspomniano, w skórze zarówno ludzkiej jak i mysiej występują trzy główne
typy komórek macierzystych, które charakteryzują się odmiennymi zdolnościami proliferacyjnymi. W warstwie podstawnej znajdują się KM o
zdolnościach unipotentnych, czyli mogących odtworzyć jedynie warstwę naskórka. Region wybrzuszenia, tzw. bulge, zawiera heterogeniczną
pulę komórek o właściwościach zarówno multijak i pluripotentnych [12]. Komórki z tego obszaru są wstanie odtworzyć naskórek, gruczoł
łojowy, mieszek włosowy, ale także mięśnie gładkie, naczynia krwionośne oraz włókna nerwowe.
Macierz germinalna mieszka włosowego zaangażowana jest w wytworzenie samego mieszka
włosowego oraz jego prawidłową pigmentację.
W warunkach in vitro, KM warstwy podstawnej
oraz regionu wybrzuszenia w wyniku podziałów
komórkowych są w stanie wytworzyć trzy rodzaje kolonii tj.: holo- mero- oraz paraklony [17].
Komórki tworzące holoklony uznawane są za
najważniejsze, potencjalne komórki macierzyste
warstwy podstawnej. Tworzą one regularne,
okrągłe kolonie zbudowane z małych komórek.
W warunkach in vitro mogą one przejść nawet
140 podziałów komórkowych. Meroklony wykazują cechy pośrednie między holoklonami a paraklonami. Paraklony są formowane przez
komórki już bardziej zróżnicowane, mniej żywotne w hodowli in vitro (rys3).
Sabat_rys.3.jpg
wanych BrdU pozwoliło zaobserwować ich migrację w rejony uszkodzenia naskórka. W przypadkach powierzchniowego zranienia za
odbudowę naskórka odpowiedzialne są jedynie
KM warstwy podstawnej. W głębszych ranach w
naprawie ubytku biorą udział zarówno komórki
macierzyste warstwy podstawnej, jak
i regionu wybrzuszenia.
Komórki macierzyste w regionie wybrzuszenia
wykazują zdolności nie tylko do odtworzenia
zranionego naskórka. Doświadczenia przeprowadzone przez Amoh Y et al. [2,3]. wykazały, że
uczestniczą one również w odbudowie naczyń
krwionośnych oraz w odtworzeniu ciągłości
uszkodzonych włókien nerwowych. Wcześniej
odkryto, że niektóre komórki rezydujące
w wybrzuszeniu posiadają marker charakterystyczny dla komórek nerwowych, jakim jest nestyna. To dało podstawy, aby sądzić że niektóre
subpopulacje komórek w tej niszy mogą mieć
zdolność do różnicowania w komórki nerwowe.
W eksperymencie zastosowano transgeniczne
myszy posiadające gen kodujący białko zielonej
fluorescencji GFP pod kontrolą promotora nestyny. U takich gryzoni w obszarze wybrzuszenia zaobserwowano zieloną fluorescencję. Takie
wyznakowane komórki przeniesiono do myszy z
uszkodzonym nerwem kulszowym i kręgowym.
Po pewnym czasie od przeprowadzenia próby
myszy odzyskiwały władzę w kończynach, co
świadczyło, że znakowane komórki potrafiły odtworzyć osłonki mielinowe oraz przywrócić ciągłość tych włókien [15].
Wykorzystanie takich transgenicznych osobników z genem GFP pod kontrolą promotora nestyny pozwoliło także na zbadanie innych
zdolności komórek z obszaru wybrzuszenia. Mysi wibrys wraz ze znakowanym obszarem wybrzuszenia przeszczepiono do drugiego
osobnika, nietransgenicznego. Wynikiem eksperymentu były utworzone naczynia krwionośne w
obszarze przeczepionego wibrysa, z widoczną
fluorescencją wzdłuż ścian tych naczyń. Badania
te wskazują, że naskórek jest źródłem heterogennej puli KM o zróżnicowanych zdolnościach
do różnicowania [1].
Metody izolacji potencjalnych komórek macierzystych.
W doświadczeniach przeprowadzonych ma modelu mysim stwierdzono, że region wybrzuszenia
ma ściśle zdefiniowaną niszę, a komórki go tworzące w porównaniu z KM warstwy podstawnej
wykazują in vitro wyższy potencjał proliferacyjny. Komórki te charakteryzują się znacznie wolniejszym cyklem komórkowym od komórek
macierzystych obszaru międzymieszkowego.
Dzięki tej zdolności, użycie komórek wyznako-
Do izolacji komórek z ich naturalnej niszy najczęściej stosuje się metodę enzymatyczną lub
mikrodysekcję laserową. Ta druga polega na wyodrębnieniu pojedynczej komórki z obrębu tkanki za pomocą wiązki lasera. Jest ona rzadziej
stosowana ze względu na czasochłonność, wymaganą precyzję osoby dokonującej izolacji oraz
niewystarczającą czystość komórek po przeprowadzonym procesie. Z tego też powodu obecnie
najlepszą metodą izolacji jest metoda enzymatyczna z późniejszym znakowaniem markerów
powierzchniowych, charakterystycznych dla ko-
31
mórek macierzystych. Do rozdziału wykorzystuje
się cytometrię przepływową, a także metody immunomagnetyczne. Jak wiadomo użycie przeciwciała,
najlepiej
monoklonalnego,
rozpoznającego specyficznie tylko konkretny
epitop, doskonale nadaje się do wyznakowania i
dalszego wyizolowania wybranych populacji komórek. Nie jest to tania oraz prosta metoda, jednak jak dotąd najbardziej efektywna. Nadal
największy problem stanowi utrzymanie komórek macierzystych w swojej unikatowej, niezróżnicowanej postaci.
Markery powierzchniowe KM warstwy podstawnej oraz rejonu wybrzuszenia, u myszy
oraz u ludzi.
Najwięcej badań na temat KM naskórka przeprowadzonych było głównie na gryzoniach. Z ich
skóry udało się wyizolować czyste komórki macierzyste z obszaru warstwy podstawnej oraz rejonu bulge. Mysi region bulge stanowi niszę
komórek tworzących wyraźne wybrzuszenie w
obszarze mieszka włosowego. Leży on poniżej
ujścia gruczołu łojowego, a komórki w nim obecne charakteryzują się taką ekspresją markerów
CD34 oraz K15, która ułatwia ich efektywną izolację. Wiele trudności nadal sprawia izolacja
ludzkich KM z obszaru wybrzuszenia mieszka
włosowego. Poziom ekspresji konkretnych markerów może być różny w organizmie mysim oraz
ludzkim. Ponadto rejon ten tworzy bardzo małe
wybrzuszenie, składające się z mieszaniny komórek posiadających niejednorodne rozmieszczenie markerów powierzchniowych, przez co u
człowieka pozytywne wyniki w izolacji czystych
KM osiągnięto jedynie z obszaru warstwy podstawnej.
Komórki macierzyste warstwy podstawnej charakteryzują się podwyższoną ekspresją _β1- oraz
α6- integryny [9], odpowiedzialnych za adhezję
komórkową. Wykazano, że poziom ekspresji β1integryny na powierzchni komórek różni się w
poszczególnych warstwach naskórka. Posiadają
one także podwyższoną ekspresję cytokeratyny
15 i 19, β- kateniny cytoplazmatycznej oraz
czynnika transkrypcyjnego p63 [10] oraz δ1.
Dwa ostatnie charakterystyczne są dla komórek
proliferujących i zapobiegają ich różnicowaniu.
Badania wykazały, że frakcja komórek z wysoką
ekspresją _β1-integryny nie ulega wybarwieniu
rodaminą 123 [6] oraz cechują się zdolnością do
najszybszego przylegania do podłoża pokrytego
kolagenem IV lub lamininą [11]. Takie komórki,
szczególnie holoklony, adherują do owego podłoża już po 20 minutach od wysiania, co może być
kolejnym sposobem do efektywnej selekcji tych
komórek.
Komórki obecne w uchyłku charakteryzują się u
myszy podwyższoną ekspresją cytokeratyny 15
[14] oraz CD34 [21]. W komórkach człowieka
ekspresja K15 tworzy nieregularny gradient stę-
32
żenia wzdłuż mieszka włosowego, a ekspresja
CD34 jest obniżona. Taka ekspresja jedynie tych
dwóch markerów w komórkach uchyłka pozwoliła badaczom dokonać izolacji mysich komórek
KM z tego obszaru.
Jedną z metod było zastosowanie transgenicznych myszy zawierających gen lacZ pod kontrolą
promotora K15 [13]. W podobny sposób wykryto
te komórki stosując zamiast genu lacZ gen kodujący białko zielonej fluorescencji - GFP. Następnie używając metody FACS wyizolowano żywe
komórki. Kolejną prostą metodą izolacji było zastosowanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko CD34 sprzęgniętych ze znacznikami
fluorescencyjnymi, a następnie rozdział w sorterze.
U ludzi niestety nie da się wykorzystać powyższych markerów do izolacji komórek z obszaru
uchyłka. Stosując mikrodysekcję laserową, testy
analizujące ekspresję genową oraz znakowane
BrdU LRC wykazano, że opierając izolację na
kilku markerach jednocześnie można wyizolować ludzkie, żywe komórki z rejonu wybrzuszenia [16]. Takie komórki charakteryzują się
podwyższona ekspresją CD200, natomiast obniżoną ekspresją CD24, CD34, CD71 oraz CD146,
a warunkach in vitro wykazują wysoką aktywność proliferacyjną, co sugeruje, że populacja ta
jest wzbogacona w KM.
Problemy związane z izolacją ludzkich komórek macierzystych naskórka. Zastosowanie komórek macierzystych naskórka w
inżynierii tkankowej.
Ze względu na swoje unikatowe właściwości,
komórki macierzyste są cennym materiałem dla
prężnie rozwijającej się od niespełna 30 lat inżynierii tkankowej. Komórki macierzyste naskórka
obecne w przedziałach międzymieszkowych posiadają jedynie zdolności unipotentne, natomiast
z punktu widzenia inżynierii tkankowej bardziej
wartościowe byłoby pozyskanie komórek o większych możliwościach do różnicowania. Idealnym
do pozyskania takich komórek miejscem jest rejon wybrzuszenia w mieszku włosowym.
Mimo udanej próby separacji potencjalnych
KM, nadal największym problemem jest brak dostatecznej wiedzy na temat szlaków sygnalizacyjnych regulujących zmiany w ekspresji genów
związanych z różnicowaniem komórek. Wyizolowanie komórki z jej naturalnej środowiska, czyli
przeniesienie jej z warunków in vivo do hodowli
in vitro, powoduje zmianę w zachowaniu się takiej komórki już w hodowli pierwotnej. Izolacja
indukuje stres komórkowy, którego skutkiem
jest uruchomienie szeregu procesów wpływających na różnicowanie wyjściowych komórek macierzystych. Znajomość i umiejętność ich
kontroli w warunkach in vitro pozwoliłaby na
efektywniejsze namnożenie komórek dla celów
klinicznych. Obecnie w inżynierii tkankowej komórki naskórka wykorzystywane są głównie do
rekonstrukcji skóry, a także przeszczepiane są
w celu regeneracji uszkodzonego naskórka.
Jedną z metod izolacji i aplikacji klinicznej keratynocytów opracowała Drukała [5], gdzie komórki
te
wykorzystywane
są
do
przeprowadzania przeszczepów autologicznych
naskórka w przypadkach poparzeń oraz trudno
gojących się owrzodzeń skórnych. Proces przygotowana materiału do przeszczepu polega na
pobraniu wycinka skóry pacjenta, izolacji enzymatycznej oraz namnożenia komórek w warunkach in vitro. Odpowiednia ich liczba następnie
mieszana jest wraz z klejem fibrynowym i podawana w formie zawiesiny na odpowiednio przygotowaną ranę pacjenta. Stosowanie tej
procedury przynosi pozytywne wyniki i stawowi
efektywną metodę do wspomagania organizmu
w szybką regenerację uszkodzonej powłoki skórnej.
Podsumowanie
Naskórek stanowi zewnętrzną warstwę skóry i
jest bardzo ważnym rezerwuarem komórek maPiśmiennictwo:
[1] Amoh Y, et al. Nascent blood vessels in the skin arise from nestine
expressing hair follicle cells. Proc Natl Acad
Sci. 2004
[2] Amoh Y, et al. Implanted hair follicle stem cells form Schwann cells that
support repair of severed peripheral
nerves. Proc Natl Acad Sci. 2005
[3] Amoh Y, et al. Multipotent hair follicle stem cells promote repair of
spinal cord injury and recovery of walking
function. Cell Cycle. 2008
[4] Braun KM, et al.. Manipulation of stem cell proliferation and lineage
commitment: visualisation of label-retaining
cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 2003
[5] Drukała J,et al. Application of research results of tissue engineering in
wound healing. Przegląd Lek. 2002
[6] Drukała J, et al. Postępy w izolacji i namnażania komórek
macierzystych naskórka ludzkiego. Post. Biol. Kom. 2003
[7] Eckert RL. Structure, function, and differentiation of the keratinocyte.
Physiol Rev. 1989.
[8] Fuchs E, et al. Socializing with the neighbors: stem cells and their
niche. Cell. 2004
[9] Jones PH et al. Separation of human epidermal stem cells from transit
amplifying cells on the basis of differences in
integrin function and expression. Cell 1993
[10] Kai- Hong, et al. P63 expression pattern during rat epidermis
morphogenesis and role od p63 as marker for
epidermal stem cells. J. Cutan. Pathol. 2007
cierzystych. Większość wiedzy, którą posiadamy
na temat KM naskórka jest wynikiem długoletnich badań przeprowadzonych na modelu mysim. Jeżeli chodzi o organizm ludzki to
największą trudność stanowi ich efektywna izolacja i kontrola w zachowaniu ich pierwotnego
fenotypu in vitro. W stosowanych obecnie procedurach klinicznych wykorzystuje się heterogenną populację keratynocytów wzbogaconą w
komórki o wysokim potencjale proliferacyjnym.
Umiejętność izolacji czystych KM i kontrola ich
fenotypu poza organizmem zdecydowanie skróciłaby czas oczekiwania pacjenta na przeszczep.
Dodatkowo, izolacja komórek o większych zdolnościach do różnicowania pozwoliłaby nie tylko
na szybkie ich namnożenie in vitro, ale także na
zastosowanie ich do wytworzenia innych tkanek
bądź narządów poza organizmem pacjenta i późniejszego ich przeszczepienia. Dalsze badania
tym razem na modelu ludzkim są nadzieją na
rozwikłanie wielu problematycznych aspektów
dotyczących KM naskórka, będących ważną gałęzią w inżynierii tkankowej.
[11] Kim D.S, et al. Isolation of human epidermal stem cells by adherence
and the reconstruction of skin equivalents.
Cell Mol. Life Sci. 2004
[12] Li L, et al. Stem cell niche: structure and function. Annu. Rev. Cell
Dev. Biol. 2005.
[13] Liu Y, et al. Keratin 15 promoter targets putative epithelial stem cells
in the hair follicle bulge. J Invest Dermatol.
2003
[14] Lyle S, et al. The C8/144B monoclonal antibody recognizes
cytokeratin 15 and defines the location of human hair
follicle stem cells. J Cell Sci. 1998
[15] McKenzie IA, et al. Skin-derived precursors generate myelinating
Schwann cells for the injured and dysmyelinated
nervous system. J. Neurosci. 2006
[16] Ohyama M, et al. Characterization and isolation of stem cell-enriched
human hair follicle bulge cells. J Clin Invest.
2006
[17] Pollegrini G, et al. Cultivation of human keratinocyte stem cells:
current and future clinical applications. Med Biol
Eng Comput. 1998
[18] Potten C.S. Epidermal cell production rates. J Invest Dermatol. 1975
[19] Potten C. S, et al. Intestinal stem cells protect their genome by
selective segregation of template DNA strands. J
Cell Sci 2002
[20] Potten C.S. Keratinocyte stem cells, label-retaining cells and possible
genome protection mechanisms. J. Investig.
Dermatol. Symp. Proc. 2004
[21] Trempus CS, et al. Enrichment for living murine keratinocytes from
the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34. J Invest Dermatol
2003
33
ROLA BIAŁKA OPORNOŚCI RAKA PIERSI W TRANSPORCIE
KSENOBIOTYKÓW
M ateusz Kucharczyk
Zakład Fizjologii i Biochemii Roślin
Koło N aukowe Studentów Biotechnologii „ M ygen“
mateusz. kucharczyk@uj. edu. pl
Praca napisana pod opieką: dr Anny Susz
Streszczenie: Oporność wielolekowa uwarunkowana obecnością specyficznych białek
transportowych stanowi aktualny i poważny problem we współczesnej farmakologii.
Podwyższona ekspresja białek oporności wielolekowej (MDR) w niektórych nowotworach
znacząco obniża jakość chemioterapii. W ciągu ostatnich lat zbadano wiele białek
odpowiedzialnych za ten proces. Na szczególną uwagę zasługuje białko oporności guza
piersi (BCRP), którego obecność jest istotna nie tylko w przebiegu procesów
patologicznych, ale również jego procesach fizjologicznych.
W tej pracy przedstawiono charakterystykę strukturalną i funkcjonalną BCRP. Największy
nacisk położono na omówienie substratów i inhibitorów tego białka oraz opisano rolę
BCRP w zjawisku MDR. Zaprezentowano również możliwe strategie modulacji aktywności
BCRP pod kątem terapeutycznym.
Wstęp
Uwalnianie, wchłanianie, rozmieszczenie, metabolizm, wydalanie (ang. LADME: Liberation,
Administration, Distribution, Metabolism,
Excretion) to pięć podstawowych procesów odpowiedzialnych za losy substancji terapeutycznych po ich podaniu do ustroju. Mechanizmy
oporności wielolekowej (ang. MDR, Multidrug
Resistance) w istotny sposób modyfikują LADME, doprowadzając najczęściej do obniżenia
efektywności zastosowanej terapii [1].
Na szczególną uwagę zasługują białka transportowe warunkujące oporność wielolekową często
indukowaną zastosowanymi w leczeniu terapeutykami. Przyczyniają się one do aktywnego eksportu ksenobiotyków z komórek ustroju,
w efekcie zmniejszając stężenie leku w organizmie [2]. Główne znaczenie odgrywa tu nadrodzina białek z motywem wiążącym
adenozyno-5’-trifosforan – ATP (ang. ABC, ATP
Binding Cassette). Białka te są szeroko rozpowszechnione zarówno u Prokaryota jak i u Eukaryota. Wspólną ich cechą jest posiadanie,
wspomnianego już, wysoce konserwatywnego,
motywu wiążącego ATP. Podstawową funkcją
biologiczną tych protein jest usuwanie obcych
dla organizmu związków – ksenobiotyków. Większość leków stosowanych w terapiach to molekuły obce dla organizmu, a wydajność
mechanizmów ich usuwania z ustroju ma wpływ
na dobór efektywnej dawki terapeutycznej [3].
Wiele badań białek odpowiedzialnych za oporność wielolekową dotyczy odkrytej w 1976 roku
P-glikoproteiny (MDR1, ABCB1, CD243) [4]. Od
tego czasu poznano szereg innych białek mających wpływ na oporność wielolekową komórek
34
[1, 2]. W 1998 roku A. Doyle i wsp. opisali po raz
pierwszy białko oporności raka piersi (BCRP,
Breast Cancer Resistant Protein), które zidentyfikowali w opornych na doksorubicynę komórkach linii MCF-7, wyprowadzonej w 1970 roku
z gruczolakoraka piersi 69-letniej kobiety rasy
kaukaskiej [5]. W ciągu ostatnich 15 lat pojawiło
się ponad 1300 publikacji opisujących białko
BCRP, jego funkcje i znaczenie w terapii. Do dziś
jednak nie poznano wszystkich cech tego białka.
Białko i gen BCRP – struktura i funkcje
BCRP zaklasyfikowano na podstawie struktury
2-rzędowej do tak zwanej „białej” rodziny białek
ABC (ang. ABC white) określanej również jako
rodzina ABCG nadając mu numer 2. W literaturze białko to można spotkać pod wieloma innymi
oznaczeniami na przykład: ABCG2, BCRP1,
MXR1 (ang. mitoxantrone resistance), CDw338,
ABCP etc. [5, 6].
Gen kodujący BCRP u człowieka zlokalizowany
jest w obrębie 4 chromosomu (4q22) i składa się
z 16 egzonów oraz 15 intronów zajmujących
łącznie około 66 kb. Cechą charakterystyczną
promotora tego genu jest obecność wielu miejsc
wiązania czynnika transkrypcyjnego Sp1 (Specificity protein 1) przy jednoczesnym braku kasety
TATA. Dodatkowe miejsca wiązania obecne
w promotorze ABCG2 to miejsca dla czynników
transkrypcyjnych AP1 (Activator Protein 1) oraz
AP2 (Activator Protein 2). Wszystkie miejsca
wiązania czynników transkrypcyjnych położone
są w obszarze ok. -400 do +150 par zasad od
miejsca startu transkrypcji [7].
Białko to występuje w organizmie ludzkim w 2
izoformach: długiej - 655 aminokwasów, MW:
Kucharczyk M. ”Rola Białka Oporności Raka Piersi w transporcie ksenobiotyków” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
Rys. 1 . Struktura BCRP, TM - Transmembrane Domain
72,3 kDa (izoforma 1) oraz krótkiej - 611 aminokwasów, MW: 67,5 kDa (izoforma 2); przy
czym izoforma 1 występuje w zdecydowanej
przewadze. Izoformę 1 koduje cDNA o długości
1968 nukleotydów [6].
Monomeryczna forma BCRP zawiera w swojej
strukturze region 3 pętli zewnątrzkomórkowych
i 2 pętli wewnątrzkomórkowych oraz układ 6 αhelikalnych transbłonowych domen (TMD,
Transmembrane Domains). Obszar cytoplazmatyczny składa się z 2 wolnych końców białka,
przy czym w obrębie N-końca znajduje się pojedyncza domena wiążąca nukleotydy (NBD –
Nucleotide Binding Domain). W obrębie NBD
wyróżnia się 2 motywy strukturalne tzw. Walker
A i B, odpowiedzialne za wiązanie i hydrolizę
ATP, co w efekcie umożliwia uwolnienie energii
koniecznej do aktywnego transportu substratów
BCRP (rysunek 1) [8]. BCRP jest białkiem błonowym funkcjonalnym w formie co najmniej homodimerycznej [8, 9, 10, 11]. Monomery tej
makromolekuły asocjują ze sobą i łączą się
prawdopodobnie za pośrednictwem wiązań disiarczkowych pomiędzy resztami cystein obecnych w obrębie pętli zewnątrzkomórkowych
[12]. Struktura trójwymiarowa BCRP nie została
do dziś określona, dostępne są natomiast modele
ABCG2 uzyskane in silico w oparciu o porównawcze modelowanie homologiczne [8].
Nazwa BCRP bywa myląca, ponieważ białko to
funkcjonuje jako eksporter w wielu tkankach, a
jego działanie nie ogranicza się do warunkowania oporności na chemioterapię [6]. Nadrzędnym zadaniem BCRP jest usuwanie obcych dla
organizmu związków. Niemniej jednak szereg
metabolitów substancji endogennych (np. produktów rozkładu porfiryn) również jest usuwanych z udziałem tego transportera [13]. Białko
to ma za zadanie chronić struktury szczególnie
wrażliwe na toksyny i ksenobiotyki jak płód,
mózg, czy komórki macierzyste. Największą ekspresję tego białka wykazują więc komórki łożyska, mózgowia (zwłaszcza skorupy, substancji
czarnej, ciała migdałowatego), komórki macierzyste (zwłaszcza tzw. prymitywnej/bocznej sub-
populacji tych komórek obecnych w szpiku kostnym i niektórych organach), ale też przewodów
żółciowych, jelita cienkiego, wątroby, jak również śródbłonka naczyń włosowatych, w szczególności tych tworzących barierę krew-mózg
oraz krew-jądra [6, 14-18].
Bardzo ciekawym przykładem funkcji BCRP w
transporcie ksenobiotyków jest usuwanie pochodzących z diety chloryn. Jonker i wsp. opublikowali w 2002 roku pracę, w której badali myszy z
brakiem białka BCRP, karmione standardową
paszą zawierającą zielone części roślin. Myszy
te, z powodu upośledzonego transportu pochodnych chlorofili (znacząco obniżony eksport tych
związków do światła jelita), po tygodniu ekspozycji na standardowe oświetlenie w zwierzętarni
doznały ciężkich fotouczuleń, które doprowadziły do obfitych owrzodzeń miejsc szczególnie
wrażliwych na światło (uszy, pysk). Dodatkowo
nagromadzone w organizmie metabolity chlorofili i endogennych porfiryn doprowadziły do rozwoju nowej, dotąd nieopisanej postaci
protoporfirii. Ta wysoko cytowana praca (500
cytowań w ciągu 10 lat) pokazuje explicite znaczenie BCRP w podstawowych procesach fizjologicznych [13].
Substraty i inhibitory BCRP
BCRP transportuje różnorodne związki, często o
bardzo odmiennym strukturalnym i chemicznym
charakterze. Część z nich jest jednocześnie zarówno substratami jak i inhibitorami tego białka. Przykładowe substraty oraz inhibitory
zestawiono w tabeli 1.
Tabela 1 . Wybrane substraty i inhibitory BCRP
Do związków transportowanych przez BCRP zaliczają się nie tylko chemioterapeutyki, takie jak
metotreksat, inhibitory kinaz tyrozynowych
(imatinib, gefitinib), pochodne kamptotecyny
(topotekan, irinotekan), antracykliny (mitoksantron, doksorubicyna i in.), ale także szereg leków niestosowanych w chemioterapii, na
35
przykład: prazosin (lek obniżający ciśnienie krwi
stosowany w leczeniu m.in. stresowych zaburzeń
pourazowych), dipirydamol (środek rozszerzający naczynia krwionośne serca, stosowany w
przebiegu stwierdzonej choroby wieńcowej), czy
statyny. BCRP transportuje także związki niebędące terapeutykami: np. flawonoidy, porfiryny,
chloryny pochodzące z diety oraz endogenne
hormony (estrogeny), hem i jego pochodne. Wiele substratów BCRP jest również transportowanych przez inne białka z klasy MDR
(P-glikoproteinę, MRP1 – Multidrug Resistance
Protein 1).
Inhibitorami BCRP są między innymi fumitemorgina C (FTC) i jej analog Ko-143, inhibitory proteaz stosowane podczas terapii HAART w
przebiegu leczenia AIDS (nelfinavir, ritonavir),
czy też niektóre flawonoidy pochodzenia naturalnego (np. chryzyna). Gefitinib, imatinib –
wspomniane już inhibitory kinaz tyrozynowych
są zarówno substratami jak i inhibitorami BCRP.
Większość inhibitorów BCRP jest mało selektywna i hamuje również aktywność transportową innych białek MDR. Za najbardziej selektywny
inhibitor ABCG2 uważa się pochodną FTC –
Ko143. Związek ten w dużo mniejszym stopniu
hamuje aktywność np. P-glikoproteiny, czy też
MRP1.
Zwiększony poziom ekspresji BCRP warunkuje oporność wielolekową
Istotnym problemem chemioterapii jest zwiększony poziom ekspresji białek oporności wielolekowej w komórkach nowotworowych. Ten rodzaj
oporności komórki nowotworowe najczęściej
„wypracowywują” w terapiach wymagających
długiego stosowania cytostatyków. Nowotwór
niejako broni się w ten sposób przed toksycznym
działaniem chemioterapeutyków oraz wspomaga
usuwanie produktów zazwyczaj szybkiego metabolizmu guza [1, 2, 6, 14].
Najlepiej poznana jest rola P-glikoproteiny. Badania z ostatnich lat zwracają jednak uwagę na
znaczenie innych białek MDR, takich jak MRP-1,
LRP (ang. Lung Cancer Resistance-Related Protein), czy będące przedmiotem tej pracy białko
oporności raka piersi.
Rola BCRP w warunkowaniu lekooporności nowotworów jest ciągle słabo poznana. To stosunkowo niedawno odkryte białko wykazuje istotnie
zwiększoną ekspresję w przypadku niektórych
białaczek (np. w ostrej białaczce szpikowej –
AML), szpiczaku mnogim, rakach jelita grubego,
przełyku, endometrium, płuc, czy też czerniakach. Co ciekawe nie stwierdzono istotnie podwyższonej ekspresji w raku piersi, od których
białko to wzięło swoją nazwę. Nawet u kobiet z
nowotworem piersi leczonych długoterminowo
doksorubicyną, poziom tego białka nie zwiększył
się względem normy [1, 13, 14, 19].
36
Inhibicja BCRP w kombinowanej terapii
Zahamowanie funkcji BCRP jest obiecującym podejściem w kombinowanych terapiach. Zablokowanie funkcji tego białka jest często wiązane ze
zwiększeniem efektu toksycznego cytostatyków
względem nowotworów wykazujących zwiększony poziom ekspresji tego białka, czy też w zatrzymaniu leków, które efektywnie są usuwane z
ustroju w trakcie innych terapii. Przykładowo
zastosowanie selektywnego inhibitora BCRP
wraz z właściwym lekiem może ułatwić osiągnięcie odpowiedniego terapeutycznego stężenia
wybranych preparatów w tkankach, które wydajnie usuwają te substancje ze swojego obszaru
(np. mózg, czy łożysko) [1, 3, 14]. Co więcej samo określenie profilu ekspresji różnych białek
warunkujących MDR w nowotworze, pozawala
dobrać każdemu pacjentowi indywidualny schemat chemioterapii. Takie podejście zastosowała
grupa Matsumoto i wsp., uzyskując zahamowanie wzrostu guzów u 7 z 9 pacjentów [21]!
Strategie inhibicji BCRP
Skuteczną strategią zahamowania funkcji BCRP
jest zastosowanie inhibitorów specyficznych
względem tego białka. Należy do nich wspomniana już FTC oraz jej pochodna Ko-143. Wadą
użycia tych związków jest nie tylko ich duża toksyczność, ale przede wszystkim ciężkie do przewidzenia skutki długotrwałego zablokowania
BCRP. Jak już wspomniano, całkowite i długotrwałe zablokowanie funkcji BCRP może wiązać
się z wystąpieniem takich objawów niepożądanych jak fototoksyczność ze strony metabolitów
chlorofili obecnych w diecie, czy też zatrucia
metabolitami porfiryn, które w efekcie mogą
prowadzić do rozwoju nowych typów protoporfirii [3, 13]. Dodatkowo tego typu inhibitory nie
wykazują pełnej specyficzności względem BCRP,
często wpływając na inne białka, nie tylko z grupy białek oporności wielolekowej.
Inną możliwością przejściowej inaktywacji
ABCG2 jest zastosowanie oligopeptydów lub małych cząsteczek, które uniemożliwią asocjację
monomerów BCRP. Wspomniano już, że białko to
jest funkcjonalne w formie co najmniej dimerycznej. Efektem takiego postępowania powinno
być selektywne zablokowane funkcji tego białka
[8]. Dobrym podejściem wydaje się być zastosowanie w tym przypadku przeciwciał monoklonalnych lub fragmentów scFv.
Innym nowatorskim podejściem może być zahamowanie aktywności BCRP przez zastosowanie
rybozymów. Użyte przez Kowalskiego i wsp. rybozymy anty-BCRP spełniały swoją funkcję doskonale w badaniach na liniach komórkowych
(EPG85-257RNOV – linia komórek ludzkiego raka żołądka). W wyniku użycia tych aktywnych
enzymatycznie cząsteczek RNA poziom mRNA
dla BCRP jak i samego białka drastycznie spadł,
natomiast stężenie substratów ABCG2 w bada-
nych komórkach zdecydowanie wzrosło [22, 23].
Podsumowanie
Uwarunkowana obecnością specyficznych białek
transportowych oporność wielolekowa wymaga
opracowywania nowych schematów leczenia.
Białko oporności guza piersi ma znaczenie nie
tylko w przebiegu choroby nowotworowej, ale
również odgrywa podstawową rolę w transporcie szeregu leków, odtruwaniu organizmu, zabezpieczaniu struktur wrażliwych przed
toksynami czy ksenobiotykami, utrzymywaniu
homeostazy metabolicznej organizmu. BCRP nie
Piśmiennictwo:
[1] Lenart K., Szyda A., Kiełbasiński M., Duś D., Podolak-Dawidziak M.
Kliniczne skutki opornośc i wielolekowej w nowotworach. Onkologia w
Praktyce Klinicznej 2005; Tom 1, nr 1, 18–26. [ISSN 1734–3542]
[2] Bamburowicz-Klimkowska M., Szutowski M. M. Strategie walki ze
zjawiskiem oporności wielolekowej nowotworów. Biul. Wydz. Farm. WUM,
2011, 3, 34-40
[3] Bamburowicz-Klimkowska M., Bogucka U., Szutowski M. M. Funkcje
transporterów ABC. Biul. Wydz. Farm. WUM, 2012, 1, 1 – 8
[4] Juliano RL, Ling V. A surface glycoprotein modulating drug permeability
in Chinese hamster ovary cell mutants. Biochim Biophys Acta. 1976 Nov
11;455[1]:152-62.
[5] Doyle A., Yang W., Abruzzo L. V., Krogmann T., Gao Y., Rishi A. K., Ross
D. D. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer
cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998;Vol. 95, pp. 15665–15670.
[6] Staud F., Pavek P. Breast cancer resistance protein [BCRP/ABCG2] The
Int. J of Biochem. & Cell Biology 2005;37, 720–725.
[7] Bailey-Dell K. J., Hassel B., Doyle L. A., Ross D. D. Promoter
characterization and genomic organization of the human breast cancer
resistance protein [ATP-binding cassette transporter G2] gene. Biochimica
et Biophysica Acta 2001;1520, 234-241.
[8] Ni Z., Bikadi Z., Rosenberg M. F., Mao Q. Structure and Function of the
Human Breast Cancer Resistance Protein [BCRP/ABCG2]. Curr Drug Metab.
2010 September 1; 11[7]: 603–617.
[9] Kage K, Tsukahara S, Sugiyama T, Asada S, Ishikawa E, Tsuruo T,
Sugimoto Y. Dominant-negative inhibition of breast cancer resistance
protein as drug efflux pump through the inhibition of S-S dependent
homodimerization. Int J Cancer 2002;97[5]:626–630. [PubMed: 11807788]
[10] Litman T, Jensen U, Hansen A, Covitz KM, Zhan Z, Fetsch P, Abati A,
Hansen PR, Horn T, Skovsgaard T, Bates SE. Use of peptide antibodies to
probe for the mitoxantrone resistance- associated protein
MXR/BCRP/ABCP/ABCG2. Biochim Biophys Acta 2002;1565[1]:6–16.
[PubMed: 12225847]
[11] Bhatia A, Schafer HJ, Hrycyna CA. Oligomerization of the human ABC
transporter ABCG2: evaluation of the native protein and chimeric dimers.
Biochemistry 2005;44[32]:10893–10904. [PubMed: 16086592]
[12] Xu, J., Liu, Y., Yang, Y., Bates, S., & Zhang, J. T. [2004]. Characterization
of oligomeric human half-ABC transporter ATP-binding cassette G2. Journal
of Biological Chemistry, 279, 19781–19789.
wykazuje specyficzności względem określonej
strukturalnie lub chemicznie grupy substratów.
Część substratów tego białka ma również właściwości hamujące jego aktywność. Długotrwałe
pozbawienie funkcji ABCG2 wiąże się z wieloma
następczymi reakcjami organizmu, jak zatrucie
metabolitami porfiryn czy fototoksyczność zależna od pochodzących z diety chloryn. Strategie
inhibicji BCRP są obiecującymi narzędziami we
współczesnej farmakologii, zarówno podczas
wystąpienia zjawiska MDR, jak również w przypadku dystrybucji leków dla nieosiągalnych dotąd obszarów. Tego typu podejścia
terapeutyczne wymagają jednak dalszych badań.
[13] Jonker, J. W., Buitelaar, M., Wagenaar, E., Van Der Valk, M. A., Scheffer,
G. L., Scheper, R. J., et al. [2002]. The breast cancer resistance protein
protects against a major chlorophyll-derived dietary phototoxin and
protoporphyria. Proceedings of the Na- tional Academy of Sciences of the
USA, 99, 15649–15654.
[14] Doyle, L. A., & Ross, D. D. [2003]. Multidrug resistance mediated by
the breast cancer resistance protein BCRP [ABCG2]. Oncogene, 22,
7340–7358.
[15] Sarkadi B, Orban TI, Szakacs G, Varady G, Schamberger A, Erdei Z,
Szebenyi K, Homolya L, Apati A. Evaluation of ABCG2 expression in human
embryonic stem cells: crossing the same river twice? Stem Cells
2010;28[1]:174–176. [PubMed: 19924769]
[16] Scharenberg CW, Harkey MA, Torok-Storb B. The ABCG2 transporter is
an efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by
immature human hematopoietic progenitors. Blood 2002;99[2]:507–512.
[PubMed: 11781231]
[17] Zhou S, Morris JJ, Barnes Y, Lan L, Schuetz JD, Sorrentino BP. Bcrp1
gene expression is required for normal numbers of side population stem
cells in mice, and confers relative protection to mitoxantrone in
hematopoietic cells in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A
2002;99[19]:12339–12344. [PubMed: 12218177]
[18] Huls M, Russel FG, Masereeuw R. The role of ATP binding cassette
transporters in tissue defense and organ regeneration. J Pharmacol Exp
Ther 2009;328[1]:3–9. [PubMed: 18791064]
[19] Diestra JE, Scheffer GL, Catala II, Maliepaard M, Schellens JH, Scheper
RJ, Germa-Lluch JR and Izquierdo MA. Frequent expression of the multidrug resistance-associated protein BCRP/MXR/ABCP/ABCG2 in human
tumours detected by the BXP-21 monoclonal antibody in paraffinembedded material. J. Pathol. 2002;198, 213–219.
[20] Faneyte IF, Kristel PM, Maliepaard M, Scheffer GL, Scheper RJ,
Schellens JH and van de Vijver MJ. Expression of the Breast Cancer
Resistance Protein in Breast Cancer. Clin. Cancer Res. 2002;8, 1068–1074.
[21] Matsumoto Y., Morisaki K., Miyake K. i wsp. Chemotherapy for gliomas
based on the expression levels of drug resistant genes. No Shinkei Geka.
2001; 29: 625–630.
[22] Kowalski P, Stein U, Scheffer GL and Lage H. [2002]. Cancer Gene
Ther., 9, 579–586.
[23] Kowalski P, Wichert A, Holm PS, Dietel M and Lage H. [2001]. Cancer
Gene Ther., 8, 185–192.
37
ROLA NOWOTWOROWYCH KOMÓREK MACIERZYSTYCH W
KANCEROGENEZIE, ROZWOJU I TERAPII NOWOTWORÓW
Joanna M asapust
Zakład Biofizyki
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii,
Praca napisana pod opieką dr hab. M artyny Elas
Streszczenie: Kancerogeneza jest procesem niezwykle złożonym, kontrolowanym przez
wiele czynników. Mimo licznych teorii starających się wyjaśnić jego poszczególne stadia,
nadal pozostaje on daleki od pełnego zrozumienia. Co więcej, podejrzewa się, że proces
kancerogenezy może mieć inny przebieg w zależności od typu nowotworu. Ostatnio duże
zainteresowanie budzi teoria uwzględniająca udział komórek macierzystych w
kancerogenezie i rozwoju nowotworu.
Komórki macierzyste znane są ze swej nieograniczonej zdolności do proliferacji, co może
sugerować ich bezpośredni związek z komórkami nowotworowymi. W testach
klonogenności
in vitro zaobserwowano, że tylko niewielka populacja komórek guza jest w stanie
utworzyć kolonię [1]. Udało się także scharakteryzować populację zdolną do indukcji
guzów u myszy SCID pod względem markerów powierzchniowych [2]. Okazało się, że
markery te znane są także jako specyficzne dla prawidłowych komórek macierzystych.
Dlatego też wydaje się prawdopodobne, że nowotworowe komórki macierzyste powstają w
wyniku zmian zachodzących w prawidłowych komórkach macierzystych [3].
Od dawna wiadomo, że komórki tworzące nowotwór stanowią populację heterogenną. W
świetle nowej teorii składałyby się na nią nieliczne nowotworowe komórki macierzyste
dzielące się w sposób asymetryczny i różnicujące do pozostałych komórek guza
posiadających tylko ograniczoną zdolność do proliferacji.
Wszystkie dotychczas stosowane terapie przeciwnowotworowe zakładają, że cała
populacja komórek guza ma jednakową zdolność do odtwarzania populacji guza podczas
procesu przerzutowania, czy odrostu guza po terapii. Obecnie wiadomo, że tylko niewielka
populacja, składająca się z nowotworowych komórek macierzystych, ma taką zdolność.
Dodatkowo posiadają one wiele cech utrudniających ich wyeliminowanie w wyniku
działania konwencjonalnych terapii [4]. Lepsze poznanie specyfiki nowotworowych
komórek macierzystych pozwoliłoby stworzyć skuteczniejsze terapie przeciwnowotworowe
skierowane przeciwko tej właśnie subpopulacji nwotworu.
Wstęp
Kancerogeneza jest niezwykle skomplikowanym
i dotąd niewyjaśnionym procesem. Przebieg
kancerogenezy dzieli się zwykle na trzy etapy:
inicjację, promocję oraz progresję. Inicjacja kancerogenezy wiąże się mutacjami genetyczną w
genach kluczowych dla regulacji proliferacji komórki, tak zwanym onkogenie. Może to być jednak proces odwracalny. Aby doszło do promocji,
czyli właściwego rozwoju nowotworu muszą zostać spełnione dodatkowe warunki. Progresja
wiąże się z nabywaniem nowych własności przez
komórki nowotworowe, często prowadzących do
wzrostu złośliwości.
Mutacje mogą być wywołane przez czynniki fizyczne, takie jak wysokoenergetyczne promieniowanie lub chemiczne, na przykład
węglowodory aromatyczne znajdujące się w dy-
38
mie tytoniowym, czy azbest. Do grupy czynników biologicznych należą zakażenia wirusami
HPV, herpes czy HBV [12]. Zmiany w materiale
genetycznym mogą powstawać także na skutek
błędów polimerazy DNA.
Jeżeli do zmiany w materiale genetycznym, wywołanej którymś w powyższych czynników, dochodzi w którymś z onkogenów i nie zostaje ona
naprawiona, istnieje prawdopodobieństwo, że
zostanie zaburzony prawidłowy przebieg cyklu
komórkowego i rozwinie się nowotwór. Do najczęściej wymienianych onkogenów, w których
mutacje wykrywa się w ponad 50% przypadków
nowotworów, należą: p53 i K-ras. Gen kodujący
białko p53 jest najczęściej uszkadzanym genem
w procesie kancerogenezy u człowieka. Szlak
sygnałowy związany z tym białkiem jest odpo-
Massapust J. „Rola nowotworowych komórek macierzystych w kancerogenezie, rozwoju i terapii nowotworów” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
wiedzialny za zatrzymanie komórki, w której doszło do uszkodzenia materiału genetycznego, w
fazie G1 w celu naprawy uszkodzenia przed replikacją (faza S). Jeżeli natomiast jest ono na tyle poważne, że nie podlega naprawie, komórka
kierowana jest na szlak apoptozy. W sytuacji,
gdy w wyniku mutacji następuje dezaktywacja
białka p53, uszkodzony materiał genetyczny jest
bez przeszkód powielany i przekazywany komórkom potomnym, co prowadzi do nagromadzenia
mutacji.
Natomiast mutacja w genie K-ras kodującym
małe białko Ras, które pośredniczy w przenoszeniu sygnałów promujących dojrzewanie i podział komórki. W wyniku mutacji gen K-ras
pozostaje permanentnie aktywny, w wyniku czego komórka zaczyna dzielić się w sposób niekontrolowany.
Większość teorii kancerogenezy zakłada, że powyższe zmiany zachodzą w komórkach somatycznych, które w wyniku podziałów i kolejnych
aktów mutacji tworzą heterogenną populację, z
której każda komórka jest w takim samym stopniu zdolna do odtworzenia nowotworu.
Komórki macierzyste
Aby omówić udział nowotworowych komórek
macierzystych w procesie powstania i rozwoju
nowotworu, należy najpierw poznać charakterystykę prawidłowych komórek macierzystych. Komórki te znane są ze swej zdolności do
samoodnowy, polegającej na tym, że podczas
asymetrycznego podziału komórkowego jedna z
komórek potomnych tworzy komórkę macierzystą, podczas gdy druga staje się komórką bardziej zróżnicowaną. W ten sposób, komórki
macierzyste dają początek wielu typom zróżnicowanych komórek obecnych w tkankach i organach. Komórki macierzyste występują w wielu
tkankach organizmu, jednak napotyka się trudności w ich izolacji ze względu na różnorodność
markerów powierzchniowych, jak również fakt,
że zwykle stanowią one jedynie niewielki odsetek (poniżej 1%) komórek danej tkanki. Najlepiej
poznane zostały hematopoetyczne komórki macierzyste obecne głównie w szpiku kostnym,
współcześnie często wykorzystywane w terapii
nowotworów krwi [5].
Łatwo zauważyć, że cechą wspólną, zarówno
prawidłowych komórek macierzystych, jak i komórek nowotworowych jest ich zdolność do samoodnowy.
Zrozumienie
mechanizmów
rządzących tym procesem jest kluczowe, ponieważ w niektórych przypadkach nowotwór może
być traktowany jako choroba polegająca na
utracie kontroli nad tymi mechanizmami [3].
Istnieją trzy główne szlaki sygnałowe odpowiedzialne za regulację samoodnowy w komórkach
macierzystych: Shh, Wnt, Notch. Zaburzenia w
ich funkcjonowaniu prowadzą do rozwoju różnych typów nowotworów [3]. Wydaje się więc, że
pierwotne zmiany genetyczne prowadzące do
kancerogenezy mogą, w pewnych typach nowotworów, zachodzić w prawidłowych komórkach
macierzystych [6], [7]. Pierwszym argumentem
przemawiającym za tą tezą jest fakt, że w prawidłowych komórkach macierzystych obecne są
mechanizmy zapewniające samoodnowę komórek podczas podziałów, więc utrzymanie tych
właściwości jest zdecydowanie prostsze niż nabycie ich de novo przez komórki zróżnicowane
[3]. Innymi słowy, więcej mutacji musiałoby zajść
w komórce, aby nabyła ona właściwości do samoodnowy niż, jeżeli już posiada takie właściwości a zmiana genetyczna powoduje tylko
deregulację mechanizmów samoodnowy. Ponadto czas życia komórek macierzystych w tkance
jest znacznie dłuższy niż dojrzałych komórek somatycznych, ze względu na ich zdolność do samoodnowy w trakcie podziału. Ma na to wpływ
również fakt, że w prawidłowych warunkach
proliferacja komórek macierzystych jest powolna [8]. Zróżnicowane komórki o wysokim potencjale proliferacyjnym eliminowane są po kilku
podziałach, dlatego też istnieje niewielka szansa
na nagromadzenie się w nich mutacji spowodowanych czynnikami zarówno fizycznymi, chemicznymi czy biologicznymi. Zupełnie odwrotnie
sytuacja przedstawia się w przypadku komórek
macierzystych. Ich długi czas bytowania w tkance sprawia, że zmiany genetyczne są przekazywane i gromadzone w kolejnych pokoleniach
komórek. Komórki nowotworowe mogłyby także
powstawać w wyniku mutacji zachodzących w
komórkach progenitorowych, które posiadają jedynie ograniczony potencjał do samoodnowy. W
takiej sytuacji musiałaby wystąpić pojedyncza
mutacja przywracająca tym komórkom nieograniczony potencjał do samoodnowy [3].
Nowotworowe komórki macierzyste
Wymienione wyżej cechy wskazują na podobieństwa między prawidłowymi komórkami macierzystymi i komórkami nowotworowymi. Oba typy
komórek dzięki temu, że posiadają wysoki potencjał proliferacyjny są w stanie dać początek
prawidłowej lub chorobowo zmienionej tkance.
Główną różnicą pomiędzy tymi dwoma nimi jest
to, że zarówno podział, jak i różnicowanie prawidłowych komórek macierzystych znajduje się
pod ścisłą kontrolą.
Ponadto zarówno tkanki prawidłowe, jak i nowotworowe złożone są z heterogennej populacji komórek, zróżnicowanych pod względem fenotypu,
morfologii czy potencjału proliferacyjnego [4].
Częściowo przyczyną heterogenności w guzach
może być zmienność mutacyjna aktywna na skutek zniesienia mechanizmów zapobiegających
podziałom komórki, w której nastąpiło uszkodzenie DNA. Mimo to, większość guzów jest pochodzenia klonalnego [9], więc komórki obecne
w guzie muszą w wyniku podziałów dawać początek zróżnicowanym fenotypowo komórkom, z
39
pomiędzy którymi znajdują się zarówno komórki
z niskim potencjałem proliferacyjnym, jak i te
które posiadają nieograniczone zdolności podziałowe [3]. W takim przypadku komórki obecne w guzie muszą przechodzić etapy rozwojowe
podobne do samoodnowy oraz różnicowania
prawidłowych komórek macierzystych. Komórki
nowotworowe obecne w guzie wykazujące cechy
komórek macierzystych nazywane są nowotworowymi komórkami macierzystymi (NKM). Grają
one kluczową rolę w powstawaniu i rozwoju guza nowotworowego, ponieważ to z nich, w wyniku upośledzonej regulacji samoodnowy,
podziałów i różnicowania, powstaje guz, podczas
gdy inne, bardziej zróżnicowane komórki, posiadające ograniczony potencjał proliferacyjny, giną
po kilku podziałach komórkowych. Zaproponowano, że większość objętości guza składa się
właśnie z szybko dzielących się zróżnicowanych
komórek, natomiast tylko niewielka subpopulacja komórek guza to nowotworowe komórki macierzyste [9] i tylko one zdolne są do odnawiania
pełnej populacji komórek guza.
Aby udowodnić, że nie wszystkie komórki guza
mają jednakowy potencjał podziałowy przeprowadzono test klonogenności in vitro. Okazało
się, że wśród komórek mysiego szpiczaka mnogiego pobranych od myszy tylko od 0,01% do 1%
było zdolnych do tworzenia koloni. Podobna sytuacja została wykazana w przypadku komórek
pochodzących z guzów litych [1].
Istnieją dwa wyjaśnienia wyników uzyskanych w
teście klonogenności. Możliwe jest, że wszystkie
komórki nowotworowe posiadają niewielką
szansę aby dzielić się intensywnie w warunkach
przeprowadzania testu, w wyniku czego obserwuje się niewielką ilość koloni. Oznaczałoby to,
że wszystkie komórki poddane testowi można
zaliczyć do nowotworowych komórek macierzystych. Zgodnie z drugim wytłumaczeniem większość komórek nowotworowych stanowią
komórki o ograniczonej zdolności do proliferacji,
a jedynie niewielka część to nowotworowe komórki macierzyste i to właśnie one zdolne są do
Rys. 1 . Przedstawienie dwóch modeli powstawania heterogennych populacji komórek w guzach litych [3].
a: Komórki guza o różnych fenotypach mogą intensywnie
proliferować jednak wszystkie wykazują niewielki potencjał
do tworzenia kolonii w teście klonogenności.
b: Większość komórek guza wykazuje niewielki potencjał proliferacyjny, a jedynie niewielka populacja dzieli się intensywnie i to te komórki dają początek koloniom w teście
klonogenności.
40
tworzenia kolonii [3]. Oba wyjaśnienia zobrazowane są na rysunku 1.
W celu udowodnienia drugiej możliwości, niezbędne było specyficzne wyizolowanie populacji
komórek wykazujących zwiększony potencjał
proliferacyjny względem reszty komórek danego
nowotworu. Udało się to wykazać dla ludzkiej
białaczki szpikowej. Wśród komórek nowotworowych pobranych od pacjentów, tylko wyizolowana populacja CD34+CD38- była zdolna do
indukcji nowotworu u myszy NOD/SCID [2].
Warto zauważyć, że te markery powierzchniowe
charakteryzują także prawidłowe hematopoetyczne komórki macierzyste. Udało się również
wykazać obecność specyficznych markerów powierzchniowych charakteryzujących komórki o
podwyższonym potencjale proliferacyjnym dla
kilku typów guzów litych (Tabela 1.).
Tabela 1 . Markery powierzchniowe nowotworowych komórek
macierzystych zidentyfikowane dla kilu typów guzów litych
[8].
Jak już wspomniano, guzy nowotworowe charakteryzują się wysoką heterogennością. Dotyczy to
zarówno guzów pierwotnych, jak i przerzutów.
Wynika więc z tego, że komórki przerzutujące,
aby odtworzyć heterogenną populację poza guzem pierwotnym muszą mieć zdolność do różnicowania w wiele typów komórek.
Znaczenie NKM dla terapii nowotworowych
Współczesna medycyna dysponuje wieloma rodzajami terapii przeciwnowotworowych. Możliwość
wyboru
między
chemioterapią,
radioterapią, chirurgią, czy terapią fotodynamiczną pozwala na dobranie leczenia w zależności od typu nowotworu czy też w sposób
indywidualny dla pacjenta. Nie zmienia to jednak faktu, że wszystkie dotychczas stosowane
terapie mają na celu jedynie maksymalne
zmniejszenie objętości guza, co nie gwarantuje
wyeliminowania nowotworowych komórek macierzystych, które często po pewnym czasie od
zastosowania terapii są w stanie odtworzyć guz.
Są one także odpowiedzialne za tworzenie przerzutów, które jak wiadomo stanowią główną
przyczynę śmierci pacjentów chorych na nowotwór. Zablokowanie działania nowotworowych
komórek macierzystych zdecydowanie poprawiłoby rokowania takich pacjentów. Istnieje zatem
potrzeba stworzenia terapii nakierowanej właśnie na nowotworowe komórki macierzyste, po-
nieważ ich wyeliminowanie pozbawi guz „rezerwuaru proliferacyjnego” i sprawi, że pozostałe
komórki w guzie po pewnym czasie obumrą (Rysunek 2.).
Rys. 2. Dwie możliwe drogi terapeutyczne w terapii przeciwnowotworowej [3].
A: Zastosowanie leku specyficznie eliminującego nowotworowe komórki macierzyste prowadzi do degeneracji guza po
pewnym czasie, nawet jeśli początkowy ubytek masy guza
jest niewielki.
B: Zastosowanie leku niszczącego szybko dzielące się komórki nowotworowe prowadzi co prawda do znacznego zmniejszenia się objętości guza, jednak nienaruszone nowotworowe
komórki macierzyste powodują odrost guza po pewnym czasie. Większość obecnie stosowanych terapii przeciwnowotworowych działa właśnie w ten sposób.
Planując stworzenie specyficznie nakierowanej
terapii można rozważyć trzy podejścia terapeutyczne [8]. Po pierwsze, udowodniono, że ważną
rolę w rozwoju nowotworowych komórek macierzystych ma nisza tkankowa, w jakiej się znajdują, ponieważ zapewnia ona odpowiednie
środowisko do przetrwania i sygnały do podziałów. W takim wypadku poznanie niszy komórkowej dla danego typu nowotworu i zastosowanie
terapii specyficznie niszczącej tę niszę mogłoby
pośrednio zniszczyć komórki macierzyste w niej
przebywające.
Kolejnym sposobem mogłoby być unieczynnienie
wspomnianych szlaków sygnałowych odpowiedzialnych za samoodnowę komórek. Terapia polegałaby na dostarczaniu leku blokującego te
szlaki specyficznie do komórek macierzystych
nowotworu, co prowadziłaby do stopniowej degeneracji guza poprzez zablokowanie jego rezerwuaru proliferacyjnego.
Kolejne potencjalne podejście terapeutyczne polegałoby na niszczeniu komórek macierzystych
poprzez indukcję ich różnicowania do bardziej
wyspecjalizowanych komórek, o mniejszym potencjale macierzystości. Komórki takie dzieliłyby
się w sposób symetryczny, w wyniku czego z jednej komórki macierzystej powstawałyby dwie
bardziej zróżnicowane. Jako przykład może służyć fakt, że nowotworowe komórki macierzyste z
nerek mogą zostać zróżnicowane do komórek
nabłonkowych w wyniku traktowanie interleukiną 15 [11]. Powstałe w ten sposób zróżnicowane
komórki są podatne na działanie chemioterapeutyków, w przeciwieństwie do nowotworo-
wych komórek macierzystych. Jednak również w
tym podejściu należałoby specyficznie nakierowywać sygnały różnicujące, aby nie niszczyć
prawidłowych komórek macierzystych w zdrowych tkankach.
Istnieje jednak wiele trudności w planowaniu terapii specyficznie nakierowanej na nowotworowe komórki macierzyste. Przede wszystkim
nowotworowe komórki macierzyste posiadają
wiele specyficznych mechanizmów obronnych
(Tabela 2.), które uniemożliwiają działanie większości konwencjonalnych terapii.
Tabela 2. Zestawienie cech charakterystycznych dla nowotworowych komórek macierzystych odróżniających je od prawidłowych komórek macierzystych [4].
Nadekspresja transporterów ABC sprawia, że
substancje terapeutyczne są aktywnie wypompowywane na zewnątrz komórki, co skutkuje
znacznie zmniejszoną skutecznością chemioterapii względem tych komórek. Ponadto wiele leków
stosowanych
w
terapii
przeciwnowotworowej powoduje bezpośrednio
uszkodzenia DNA w komórkach. NKM okazały
się być niewrażliwe na działanie tych leków [8],
więc kolejną przyczyną oporności na chemioterapię może być obecność wydajnych mechanizmów naprawy DNA. Z kolei zdolność od
indukcji stanu hipoksji jest przyczyną zmniejszonej skuteczności radioterapii. Większość uszkodzeń pojawiających się w komórce w wyniku
działania wysokoenergetycznego promieniowania, wynika z działania reaktywnych form tlenu.
Nieobecność tlenu w układzie drastycznie
zmniejsza więc skuteczność uszkadzania struktur komórkowych poprzez promieniowanie.
Również w tym wypadku wydajne mechanizmy
naprawy DNA wpływają negatywnie na skuteczność terapii.
Kolejną przeszkodą na drodze do specyficznej i
skutecznej terapii jest różnorodność markerów
powierzchniowych nowotworowych komórek
macierzystych dla różnych typów nowotworów.
Każdy typ guza musiałby być rozpatrywany indywidualnie, co wymaga wykorzystania większej
ilości czasu oraz funduszy. Ponadto wiele z wymienionych markerów powierzchniowych spotykanych jest także w prawidłowych komórkach
organizmu, co jak dotąd wyklucza możliwość
użycia przeciwciał w nakierowywaniu leków na
nowotworowe komórki macierzyste.
Podsumowanie
Nowotworowe komórki macierzyste stanowią
niewielką populację guza, która posiada nie-
41
ograniczony potencjał proliferacyjny oraz zdolność do różnicowania w różne typy komórek. W
przeciwieństwie do pozostałych komórek obecnych w guzie, tylko ta populacja komórek nowotworowych jest w stanie odtwarzać nowotwór,
czy to w procesie odrostu guza po terapii, czy
też podczas tworzenia przerzutów. Powstają one
najprawdopodobniej na skutek mutacji zachodzących w prawidłowych komórkach macierzystych, których proliferacja i różnicowanie są
ściśle kontrolowane. W wyniku mutacji następu-
je utrata tej kontroli.
Omówione właściwości nowotworowych komórek macierzystych jasno sugerują, że nie jest
możliwe skuteczne leczenie nowotworów terapią, która nie ich eliminacji w procesie terapeutycznym. Nieskuteczność większości terapii
względem tych komórek wynika z faktu, że posiadają one wiele mechanizmów obronnych. Potrzeba więc nowych podejść terapeutycznych,
które pozwoliłyby na specyficzne niszczenie nowotworowych komórek macierzystych.
Piśmiennictwo:
[1] Salmon, S. et. al. A. Primary bioassay of human tumor stem cells.
Science. 1977
[2] Bonnet, D. et. al. Human acute myeloid leukemia is organized as a
hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med.
1997
[3] Reya, T. et. al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 2001
[4] Szaryńska, M. Rola nowotworowych komórek macierzystych w
patogenezie i terapii chorób nowotworowych. Forum Medycyny Rodzinnej.
2011
[5] Akashi, K. & Weissman, I. L. in Developmental Biology of
Hematopoiesis (ed. Zon, L. I.) 15–34 (Oxford Univ. Press, New York, 2001).
[6] Sell, S. & Pierce, G. B. Maturation arrest of stem cell differentiation is a
common pathway for the cellular origin of teratocarcinomas and epithelial
cancers. Lab. Invest. 70, 6–22 (1994).
42
[7] Sawyers, C. et al. Leukemia and the disruption of normal
hematopoiesis. Cell. 1991
[8] Jiang, W. et al. The implications of cancer stem cells for cancer therapy.
International journal of molecular sciences. 2012
[9] Fialkow, P. J. Clonal origin of human tumors. Biochim. Biophys. Acta.
1976
[10] Clevers, H. The cancer stem cell: Premises, promises and challenges.
Nat. Med. 2011
[11] Azzi, S. et al. Differentiation therapy: Targeting human renal cancer
stem cells with interleukin 15. J. Natl. Cancer Inst. 2011
[12] Sonnenschein, C. et. al. Theories of carcinogenesis: an emerging
perspective. Seminars in cancer biology. 2008
JANUSOWE OBLICZE N RF 2:
ROLA W PROCESACH NOWOTWOROWYCH
M ateusz M endel
Zakład Biotechnologii M edycznej
Praca napisana pod opieką: dr Urszuli Florczyk
Streszczenie: Czynnik transkrypcyjny Nrf2 (NF-E2-related factor 2) pełni kluczowe funkcje w regulacji odpowiedzi komórek na stres oksydacyjny poprzez regulację genów kodujących białka o działaniu cytoprotekcyjnym, antyoksydacyjnym, detoksykacyjnym
i przeciwzapalnym.
W warunkach normalnych Nrf2 tworzy kompleks z białkiem cytoszkieletu Keap1 (Kelch-like ECH-associated protein 1), który jest kierowany do degradacji w proteasomie. Sytuacja
zmienia się w warunkach stresowych, kiedy to modyfikacja Keap1 prowadzi do oddysocjowania Nrf2 z kompleksu i jego translokacji do jądra. W efekcie Nrf2 indukuje ekspresję
wielu genów zawierających w promotorze element odpowiedzi antyoksydacyjnej (ARE).
Jako jeden z głównych czynników cytoprotekcyjnych i regulator enzymów II fazy metabolizmu ksenobiotyków, Nrf2 pełni kluczowe funkcje w zapobieganiu rozwoju procesów nowotworowych. Induktory Nrf2 są więc wykorzystywane w profilaktyce nowotworów. Z drugiej
strony, zwiększona ekspresja Nrf2 w wielu typach nowotworów jest związana z lepszą
przeżywalnością nowotworu, jego wzrostem i opornością na terapię.
W poniższej pracy przybliżony zostanie mechanizm działania Nrf2 w warunkach stresu
oksydacyjnego i chemicznego oraz jego złożona rola w procesach nowotworowych.
Wstęp
Światowa Organizacja Zdrowia szacuje, że do
roku 2030 roczna liczba zachorowań na raka
wyniesie 26,4 milionów, z czego 17 stanowić będą przypadki śmiertelne [1]. Dane te zakładają
ponad dwukrotny wzrost zachorowalności na
nowotwory w stosunku do chwili obecnej i wyraźnie wskazują na potrzebę opracowywania nowych sposobów leczenia, a przede wszystkim
zapobiegania chorobom nowotworowym. Jedną z
postulowanych dróg profilaktyki jest zastosowanie substancji obniżających w komórce poziom
wolnych rodników, powszechnie uznawanych za
przyczynę wielu stanów patologicznych, w tym
nowotworów. Działanie takich substancji jest
związane z regulacją genów znajdujących się
pod kontrolą sekwencji znanej jako element odpowiedzi antyoksydacyjnej (ARE, ang. antioxidant response element).
Element odpowiedzi antyoksydacyjnej
Najważniejsza grupa genów regulujących usuwanie wolnych rodników i rozkład reaktywnych
form tlenu znajduje się pod kontrolą promotorów zawierających cis-regulatorowe sekwencje
wzmacniające ARE [2]. Geny regulowane przez
te sekwencje kodują szeroką gamę białek o działaniu antyoksydacyjnym (NQO1, NQO2, HO-1),
antyapoptotycznym (Bcl-2), regulującym przemiany metaboliczne (G6PD, TKT, PPARγ) czy de-
toksyfikacyjnym (MRP3, MRP4, GST). Białka te
przywracają odpowiedni potencjał redoks, dezaktywują ksenobiotyki (substancje niewystępujące naturalnie w organizmie, np. leki lub
trucizny) czy usuwają nieprawidłowe białka
chroniąc komórkę przed uszkodzeniami i mutacjami [3]. Jedną z najważniejszych grup białek
podlegających regulacji przez ARE są enzymy II
fazy metabolizmu ksenobiotyków, które przeprowadzają reakcję koniugacji endogennych ligandów takich jak glutation czy kwas glukuronowy
z produktami I fazy metabolizmu ksenobiotyków,
tworząc związki łatwiej rozpuszczalne, mniej
toksyczne i łatwiejsze do usunięcia z komórki
[4].
Regulacja genów zależna od ARE jest kontrolowana przez rodzinę białek cap 'n' collar (CNC)
składającą się z czterech członków: Nrf1, Nrf2,
Nrf3 i p45 NF-E2, zawierających w swej strukturze motyw zamka leucynowego (bZip, ang. basic leucine zipper) [5,6]. Spośród nich
najważniejsze funkcje cytoprotekcyjne w ochronie komórek przed szkodliwym działaniem stresu oksydacyjnego i chemicznego przypisuje się
Nrf2 (ang. NF-E2-related factor 2) [7].
Czynnik transkrypcyjny Nrf2
Czynnik transkrypcyjny Nrf2 został po raz
pierwszy wyizolowany i opisany w roku 1994 [8].
43
Mendel M. „Janusowe oblicze Nrf2: rola w_procesach nowotworowych” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
Nrf2 ulega ekspresji we wszystkich tkankach
ludzkiego organizmu [8]. Badania z użyciem myszy z brakiem funkcjonalnego genu Nrf2 (Nrf2
-/-) wykazały jednak, że jego obecność nie jest
niezbędna dla prawidłowego rozwoju [9]. Niemniej jednak zwierzęta takie wykazywały znaczne obniżenie poziomu ekspresji genów zależnych
od ARE, a co za tym idzie zwiększoną wrażliwość na toksyny i substancje rakotwórcze [10].
W budowie Nrf2 zidentyfikowano sześć domen
homologicznych zwanych domenami Neh (ang.
Nrf2-ECH homology). Domena Neh1 zawiera
motyw CNC-bZip (ang. cap'n'collar/basic leucine
zipper) konieczny dla wiązania się z DNA i dimeryzacji z innymi czynnikami transkrypcyjnymi,
co jest niezbędne dla aktywacji Nrf2 [10]. Dodatkowo wewnątrz tej domeny występuje sygnał
lokalizacji jądrowej (NLS, ang. nuclear localization signal), konieczny dla importu białka Nrf2
do jądra oraz sygnał eksportu jądrowego (NES,
ang. nuclear export signal), którego delecja powoduje upośledzenie transportu Nrf2 z jądra do
cytoplazmy i akumulację Nrf2 w jądrze [11]. Domena Neh2 jest domeną N-końcową, odpowiedzialną za interakcję z białkiem Keap1 (ang.
Kelch-like ECH associated protein 1) oraz posiadającą siedem reszt lizyny ulegających ubikwitynacji [12,13]. Znajdujące się wewnątrz domeny
Neh2 motywy ETGE i DLG są niezbędne dla interakcji z Keap1 i degradacji Nrf2. C-końcowa
domena Neh3 jest konieczna dla aktywności
transkrypcyjnej Nrf2 [14]. Domeny Neh4 i Neh5
mogą niezależnie wiązać się z białkiem wiążącym CREB (ang. cAMP response element binding protein) - CBP, zwiększając tym samym
aktywność transkrypcyjną Nrf2 [6,7]. Ostatnia
domena, Neh6, jest bogata w reszty seryny i razem z Neh2 odgrywa ważną rolę w degradacji
Nrf2. Wewnątrz tej domeny znajdują się 2 motywy rozpoznawane przez białko β-TrCP (ang. βtransducin repeat-containing protein), zawierające powtórzenia β-transducyny aktywujące
niezależną od Keap1 drogę degradacji, opartą
na ubikwitynacji przez kompleks ligazy Skp1Cul1-Rbx1/Roc1 (ang. Skp1-cullin1-ring box
1/regulator of cullins-1) [15,16].
Rys 1 . Schematyczna budowa białka Nrf2.
REGULACJA AKTYWACJI NRF2
Kompleks Nrf2-Keap1
Keap1 jest cytoplazmatycznym białkiem będącym głównym negatywnym regulatorem Nrf2
[17]. Jego rolę w regulacji Nrf2 zbadano przy
zastosowaniu myszy niosących mutację w genie
kodującym Keap1. Takie zwierzęta charakteryzowały się znacznie podniesionym poziomem
44
ekspresji enzymów II fazy wynikającym z nagromadzenia się Nrf2 w jądrze. Obserwowany fenotyp został odwrócony u myszy z podwójnym
nokautem genów Keap1 oraz Nrf2, co potwierdziło nadrzędną rolę Nrf2 w wykształceniu obserwowanych fenotypów [18,19].
W strukturze białka Keap1 wyróżnia się: region
N-końcowy, domenę BTB (ang. broad complex,
Tramtrack, and Bric a brac domain), region rozdzielający (IVR, ang. intervening region), domenę DGR (ang. Double Glycine Repeat; Kelch
domain) oraz karboksylowy region końcowy
(CTR, ang. carboxyl terminal region).
Domena BTB jest zaangażowana w tworzenie
homodimerów Keap1 oraz wiązanie z kompleksem ligazy ubikwityny kuliny 3/Rbx1 (ang.
Cul3/Rbx1 - cullin 3/ring box 1), promując ubikwitynację Nrf2 i w efekcie jego degradację
przez proteasom 26S [20]. Region rozdzielający
IVR w dużej mierze odpowiada za odpowiedź
Keap1 na oksydacyjne i elektrofilowe bodźce, w
której kluczowe znaczenie przypisuje się dwóm
resztom cysteiny. Dodatkowo w rejonie IVR znajduję się sekwencja NES, odpowiedzialna za usuwanie Keap1 z przestrzeni jądrowej [7,21].
C-końcowa domena DGR zawiera sześć powtórzeń sekwencji Kelch. Wiąże się ona z domeną
Neh2 w cząsteczce Nrf2 oraz dodatkowo wiąże
cały kompleks do białek cytoszkieletu (aktyny
lub miozyny VIIa) [7].
Rys 2. Schematyczna budowa białka Keap1 . Na rysunku zaznaczono położenie funkcjonalnie ważnych reszt cysteiny oraz
sekwencję NES (czarna kropka).
Aby związać się z Nrf2, Keap1 musi utworzyć
homodimer, który następnie przyłącza się do domeny Neh2, a dokładniej do wcześniej wspomnianych motywów ETGE i DLG. Niedawno
zaproponowany mechanizm tworzenia kompleksu Nrf2-Keap1 opiera się na modelu "zawiasu i
zatrzasku" (ang. hinge and latch). Motywy ETGE
oraz DLG różnią się powinowactwem, z jakim łączą się z domeną DGR białka Keap1 (motyw ETGE cechuje się większym, zaś motyw DLG
niższym powinowactwem) i stanowią, odpowiednio, część "zawiasową" kompleksu i element
"zatrzasku". Nrf2 łączy się z Keap1 poprzez motyw ETGE, ale w dalszym ciągu może poruszać
się w przestrzeni. Dopiero związanie z motywem
DLG, stabilizującym Nrf2 w optymalnej pozycji
dla poliubikwitynacji reszt lizyny, prowadzi do
proteasomalnej degradacji Nrf2 [22,23].
W normalnych warunkach białko Nrf2 jest stale
przyłączane i kierowane do degradacji przez homodimer Keap1 związany z kompleksem ligazy
ubikwityny Cul3-Rbx1. W związku z tym okres
półtrwania Nrf2 w komórce wynosi około 10-20
minut [24,25].
Aktywacja Nrf2
Istnieje kilka różnych teorii wyjaśniających mechanizm aktywacji Nrf2 po zadziałaniu sygnału
aktywującego. Najbardziej powszechny pogląd
zakłada, że w warunkach stresu oksydacyjnego/chemicznego Nrf2 oddysocjowuje od kompleksu z Keap1 i ulega translokacji z cytoplazmy
do jądra, gdzie tworzy heterodimery z małymi
białkami Maf lub białkami Jun. Utworzenie heterodimerów jest niezbędne do związania się z sekwencją ARE i aktywacji transkrypcji genów
cytoprotekcyjnych [5,26]. Dokładny mechanizm
tego procesu nie został jeszcze ostatecznie zdefiniowany, niemniej jednak, za najbardziej prawdopodobne uznaje się obecnie dwie drogi
aktywacji Nrf2 prowadzące do jego ucieczki z
cytoplazmy.
Pierwsza z nich oparta jest na występowaniu w
cząsteczce Keap1 reszt cysteinowych, będących
sensorami stresu oksydacyjnego. Ich modyfikacja przez elektrofile lub reaktywne formy tlenu
prowadzi do zmian konformacyjnych białka. W
efekcie Keap1 traci zdolność wiązania Nrf2,
chroniąc ten ostatni przed proteasomalną degradacją. Z drugiej strony do aktywacji może
dochodzić w wyniku modyfikacji reszt aminokwasowych białka Nrf2. Kluczowa wydaje się
być tutaj reszta seryny zlokalizowana w domenie
Neh2 wiążącej się bezpośrednio z Keap1. Wykazano mianowicie, że fosforylacja seryny 40 przez
białkową kinazę C (PKC, ang. protein kinase C)
prowadzi do oddysocjowania Nrf2 od Keap1 i jego transportu do jądra [27,28].
Ponadto fosforylacja Nrf2 może zachodzić także
w wyniku działania innych szlaków przekazu sygnału, obejmujących m.in. kinazy aktywowane
mitogenami (MAPK, ang. mitogen-activated protein kinases), kinazę fosfatydyloinozytolu (PI3K,
ang. phosphoinositide-3 kinase), kinazę GSK3β
(ang. glycogen synthase kinase 3 beta), kinazę
aktywowaną czynnikami zewnętrznymi (ERK,
ang. extracellular signal-regulated kinase) czy
kinazę CK2 (ang. casein kinase 2) [29,30].
Druga hipoteza aktywacji Nrf2 zakłada, że w
warunkach stresowych zatrzymana zostaje degradacja Nrf2 związanego z Keap1, jednak nie
dochodzi do odłączania się Nrf2 z kompleksu z
Keap1. Dopiero nowopowstające białko ulega
transportowi do jądra. Mechanizm tego procesu
oparty jest na już wcześniej wspomnianym modelu zawiasu i zatrzasku. W warunkach stresu
oksydacyjnego/elektrofilowego następuje modyfikacja reszt cysteiny białka Keap1, prowadząca
do jego zmian konformacyjnych. W efekcie dochodzi do odłączenia się motywu DLG stanowiącego element "zatrzasku" od wiązania z Keap1.
Nrf2 pozostaje jednak w dalszym ciągu połączony z Keap1 poprzez motyw ETGE. W takim układzie niemożliwa jest degradacja Nrf2, ponieważ
do zajścia ubikwitynacji wymagane jest związa-
nie się Keap1 z oboma motywami. Ostatecznie
prowadzi to do wysycenia miejsc wiążących Keap1. Nowo produkowane białko Nrf2 akumuluje
się w cytoplazmie, a następnie translokuje do jądra indukując transkrypcję genów będących pod
kontrolą sekwencji ARE [29].
W komórce wykształciły się ponadto mechanizmy regulacji ilości Nrf2 na poziomie ekspresji
genów. Okazuję się, że gen kodujący Nrf2 posiada w swoim regionie promotorowym sekwencję
ARE. Oznacza to, że w warunkach stresu oksydacyjnego/elektrofilowego Nrf2 może zwiększać
swoją własną ekspresję, odpowiadając w ten
sposób na zwiększone zapotrzebowanie komórki
[29]. Co ciekawe, istnieje również mechanizm
odwrotny. Geny kodujące Keap1 oraz składniki
kompleksu ubikwityny Cul3/Rbx1 także posiadają sekwencje ARE. Białka te wspólnie tworzą
kompleks Keap1/Cul3/Rbx1, prowadzący do degradacji Nrf2. Zwiększenie poziomu ich ekspresji przez Nrf2 prowadzi do jego wzmożonej
degradacji i zapobiega nadmiernej aktywacji genów cytoprotekcyjnych. Mechanizm ten stanowi
klasyczny przykład pętli sprzężenia zwrotnego
[31,32].
REGULACJA AKTYWNOŚCI NRF2
Z powodu istotnych funkcji biologicznych, jakie
spełnia białko Nrf2, powstał cały szereg mechanizmów regulujących poziom jego aktywności.
Mogą to być zarówno pozytywne regulatory,
przyłączające się do cząsteczki Nrf2 i ułatwiające oddziaływanie z DNA, jak i negatywne, konkurujące z Nrf2 o wiązanie się z sekwencjami
ARE czy prowadzące do jego eksportu z jądra.
Pozytywne regulatory Nrf2
Jednym z niedawno odkrytych czynników, będącym pozytywnym regulatorem Nrf2, jest białko
KAP1 (ang. KRAB-associated protein 1). Łączy
się ono z N-końcowym fragmentem Nrf2 wpływając na jego aktywność. Wykazano, że wyciszenie KAP1 doprowadza do obniżenia ekspresji
genów regulowanych przez Nrf2, takich jak HO1 i NQO-1. Jednakże wydaje się, że KAP1 nie jest
niezbędny do zajścia samej indukcji transkrypcji,
a jego rolą jest raczej wzmaganie aktywności
Nrf2. Co ciekawe, zauważono, że wyciszenie
KAP1 w różnym stopniu wpływa na poziom ekspresji HO-1 i NQO-1, jednakże sam mechanizm
tego procesu jest w dalszym ciągu niejasny i wymaga dalszych badań [33].
Negatywne regulatory Nrf2
W normalnych warunkach aktywny jest system
oparty na białku Bach1 (ang. BTB and CNC homology 1, basic leucine zipper transcription factor 1), zapobiegający nadmiernej ekspresji
genów regulowanych przez Nrf2,. Bach1 współzawodniczy z Nrf2, tworząc heterodimery z ma-
45
łymi białkami Maf i w efekcie wiążąc się do sekwencji ARE, co powoduje represję zależnych
genów. W warunkach stresu oksydacyjnego
Bach1 ulega fosforylacji, w wyniku której odłącza się od ARE i jest eksportowany do cytoplazmy umożliwiając tym samym wiązanie się Nrf2
do ARE [34,35].
często związany jest z gorszymi prognozami leczenia pacjentów. W związku z tym rozważane
są nowe strategie terapeutyczne uwzględniające
przeciwstawną rolę Nrf2 w indukcji i progresji
nowotworów.
Ważną rolę w regulacji aktywności Nrf2 odgrywają mechanizmy aktywowane w tzw. późnej fazie odpowiedzi, pojawiającej się po pewnym
czasie od zaistnienia warunków stresowych i aktywacji Nrf2. Prowadzą one do degradacji Nrf2
znajdującego się w jądrze, nie dopuszczając tym
samym do nadmiernej ekspresji regulowanych
przez niego genów [27].
Jednym z najważniejszych mechanizmów zaangażowanych w późną odpowiedź jest dezaktywacja Nrf2 przez kinazy Src, Yes, Fyn i Fgr, będące
podrodziną kinaz tyrozynowych Src [36]. W odpowiedzi na stres białka te są aktywowane przez
GSK3β i w jądrze fosforylują 568 resztę tyrozyny
białka Nrf2. W efekcie Nrf2 jest eksportowany z
jądra i kierowany do degradacji, co wiąże się z
obniżeniem ekspresji genów cytoprotekcyjnych
[27].
Inny mechanizm oparty jest na białku Keap1. Co
ciekawe, chociaż większość Keap1 znajduję się
w cytoplazmie, to okazuje się, że niewielka ilość
kompleksów Keap1/Cul3/Rbx1 znajduje się również w jądrze, w następstwie transportu przy
udziale protymozyny-α, która dostarcza sygnał
jądrowej lokalizacji. W jądrze protymozyna-α
jest wymieniana na Nrf2, a ten ostatni kierowany jest do proteasomalnej degradacji. Mechanizm transportu jądrowego kompleksu
Keap1/Cul3/Rbx1 jest silnie indukowany warunkami stresowymi i zachodzi z opóźnieniem w
stosunku do transportu Nrf2. Ponadto, zastosowanie genisteiny (inhibitora kinaz tyrozynowych) prowadzi do zahamowania wymiany
protymozyny-α na Nrf2, i tym samym hamuje
degradację Nrf2. Może to wskazywać na bezpośredni udział w tym procesie jeszcze jednego
elementu, mianowicie opisanej powyżej fosforylacji prowadzonej przez kinazy tyrozynowe Src
[37].
Z powodu swoich właściwości detoksyfikacyjnych białko Nrf2 budzi duże nadzieje związane z
jego zastosowaniem w profilaktyce nowotworów.
Przeciwnowotworowe działanie Nrf2 było przedmiotem wielu badań wykorzystujących myszy z
brakiem funkcjonalnego genu Nrf2 (Nrf2 -/-)
[38–41]. Myszy te były znacznie bardziej wrażliwe na działanie kancerogenów oraz wykazywały
niższy poziom genów cytoprotekcyjnych w porównaniu do myszy typu dzikiego [38,39]. Dodatkowo, w modelu raka płuc, brak Nrf2
skutkował nie tylko zwiększoną podatnością na
rozwój nowotworów, ale również wytworzeniem
warunków sprzyjających przerzutowaniu [42].
Wykazano również, że wiele związków o działaniu przeciwnowotworowym, takich jak sulforafan, kurkumina czy oltipraz, cechuje się
zmniejszoną aktywnością u myszy z niedoborem
Nrf2 [38,43]. Okazuję się, że działanie tych substancji w dużej mierze oparte jest o indukcję genów zależnych od Nrf2, co potwierdzono
porównując poziom ekspresji genów u myszy
posiadających oraz nieposiadających genu kodującego Nrf2, poddanych działaniu sulforafanu.
Myszy typu dzikiego, wykazywały znaczne
zwiększenie ekspresji genów kodujących enzymy
II fazy. Efekt ten nie występował w przypadku
myszy pozbawionych ekspresji Nrf2 [44].
Działanie ochronne Nrf2 może wynikać nie tylko
z aktywacji transkrypcji genów detoksyfikacyjnych i antyoksydacyjnych, lecz również z regulacji ekspresji genów przeciwzapalnych czy
składników proteasomu, pomagających w usuwaniu uszkodzonych białek z komórki [45]. Najnowsze doniesienia wskazują ponadto na rolę
Nrf2 w regulacji PPARγ [46], receptora aktywowanego przez proliferatory peroksysomów, białka znanego z właściwości hamujących
proliferację komórek oraz indukującego apoptozę i różnicowanie komórek mogących prowadzić
do zatrzymania rozwoju nowotworu na jego
wczesnych stadiach [47].
Dodatkowo zaobserwowano, że poziom Nrf2
może być kontrolowany przez białka o znaczeniu
w procesach nowotworowych. Białka supresorowe, takie jak p21 czy BRCA2 stabilizują Nrf2 poprzez
zapobieganie
ubikwitynacji
i proteasomalnej degradacji. Jednocześnie białka
kodowane przez onkogeny, takie jak rodzina kinaz Src, biorą udział w negatywnej regulacji aktywności Nrf2 [27].
PODWÓJNA ROLA NRF2 W NOWOTWORACH
W ostatnim czasie Nrf2 stał się przedmiotem
ożywionej dyskusji dotyczącej jego roli w procesach nowotworowych. Z jednej strony Nrf2 odgrywa bardzo ważną rolę w zapobieganiu
rozwojowi wielu schorzeń wywoływanych przez
wolne rodniki i elektrofile (w tym nowotworów),
jednak z drugiej, coraz częściej zauważana jest
"ciemna" strona Nrf2. Mianowicie zwiększona
ekspresja Nrf2, stwierdzona w wielu typach nowotworów, może wpływać na rozwój guza,
zwiększając proliferację i żywotność komórek
oraz prowadząc do ich zwiększonej odporności
na terapie. Dodatkowo, podniesiony poziom Nrf2
46
Chemoprewencyjna rola Nrf2
Ciemna strona Nrf2 - czynnik onkogenny
Badania ostatnich lat doprowadziły do odkrycia,
że mutacje prowadzące do zwiększonej ekspresji
Nrf2 w nowotworach korelują z większą agresywnością i opornością na terapie. Do nadmiernej aktywacji Nrf2 może dochodzić zarówno
w wyniku mutacji w genie kodującym Nrf2, jak i
Keap1 [48].
Mutacje dotyczące Nrf2 zostały zlokalizowane w
nowotworach płuc, głowy, szyi, czy też raków
kolczystokomórkowych przełyku lub skóry. Istotne jest, że mutacje są zlokalizowane w krytycznych miejscach oddziaływania Nrf2 z białkiem
Keap1. I tak około 43% obserwowanych w badaniach przypadków dotyczyło motywu DLG, a
57% przypadków związanych było z motywem
ETGE [48]. Mutacja zmieniająca ETGE może
uniemożliwiać przyłączenie się Keap1 do Nrf2,
chroniąc je przed proteasomalną degradację. W
przypadku zmian w DLG Keap1 może w dalszym
ciągu przyłączać się do cząsteczki Nrf2, jednak
w wyniku zaburzenia ubikwitynacji niemożliwa
jest jego proteasomalna degradacja. W obu
przypadkach dochodzi do niekontrolowanego
zwiększenia poziomu Nrf2 w jądrze [48–50].
Mutacje dezaktywujące działanie białka Keap1
zostały z kolei zlokalizowane w nowotworach
płuc, woreczka żółciowego, piersi, wątroby czy
żołądka. Wpływ mutacji Keap1 na komórkę może
być znacznie szerszy niż w przypadku mutacji
Nrf2, ponieważ Keap1 wpływa także na inne
białka. Przykładowo wiąże się on z podjednostką
β kinazy IKK, odpowiedzialnej za degradacje
białka IκB będącego inhibitorem czynnika NFkB. Przyłączenie hamuje jej aktywność i tym samym prowadzi do inaktywacji NF-κB [48,51].
Podniesiony poziom Nrf2 w komórkach nowotworowych nie musi jednak wynikać z występowania mutacji w genach kodujących Nrf2 lub
Keap1. Okazuje się, że m.in. onkogeny K-Ras, BRaf i Myc czy epigenetyczne modyfikacje promotora Keap1 również mogą wpływać na podniesienie poziomu Nrf2 w komórce [52,53].
Nrf2 w terapii nowotworów
Zwiększenie poziomu Nrf2 w nowotworach ma
szczególne znaczenie dla terapii przeciwnowotworowych, które okazują się nieskuteczne ze
względu na nabywanie przez komórki guza
oporności na wiele stosowanych obecnie chemioterapeutyków, m.in. cisplatynę, 5-fluorouracyl, bleomycynę czy doksorubicynę [54–56].
Może to wynikać ze zwiększonej odporności na
stres oksydacyjny, poprzez detoksyfikację opartą
o enzymy II fazy czy też zwiększoną ekspresję
transporterów błonowych wypompowujących leki z komórki [51]. Mechanizm działania Nrf2 w
ochronie komórek nowotworowych może opierać
się także o regulację innych białek, takich jak
antyapoptotyczne białko Bcl-2 [57] czy też enzymy modyfikujące metabolizm komórki i kierujące glukozę i glutaminę w stronę ścieżki
anabolicznej [58].
Poza bezpośrednią ochroną komórek nowotwo-
rowych Nrf2 może również wpływać na tworzenie nowych naczyń krwionośnych (angiogenezę)
- proces, który jest krytyczny dla wzrostu i przerzutowania guzów litych. Rola Nrf2 w angiogenezie oparta jest m.in. na zwiększaniu poziomu
ekspresji interleukiny-8 (IL-8), będącej istotnym
mediatorem tworzenia nowych naczyń krwionośnych [59,60]. Jednakże mechanizm ten jest hamowany w warunkach hipoksji: badania
prowadzone w Zakładzie Biotechnologii Medycznej Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie wykazały występowanie negatywnej
korelacji między poziomem białka HIF-1 (ang.
hypoxia-inducible factor 1) a ekspresją Nrf2.
Białko HIF-1 ulega silnej aktywacji w warunkach
hipoksji i poprzez przyłączanie się do elementów
HRE (ang. hypoxia response element), występujących w rejonach promotorowych wielu genów,
reguluje odpowiedź komórki na warunki niedotlenienia. Jednocześnie HIF-1 prowadzi do obniżenia poziomu Nrf2 i regulowanych przez niego
genów, w tym proangiogennej IL8 [61]. Co ciekawe, izoforma HIF-2 pomimo obniżania ekspresji Nrf2 wykazuje efekt odwrotny i prowadzi do
zwiększenia poziomu IL8 [62].
Indukowana przez Nrf2 ekspresja IL8 może
mieć istotne znaczenie w antyangiogennych terapiach nowotworów. Przykładowo, najnowsze
badania wskazują na dużą rolę IL8 w oporności
kolczystokomórkowego raka szyi i głowy na terapię za pomocą bevacizumabu [63].
Odkrycie korelacji łączącej występowanie nieprawidłowości w poziomie Nrf2 w nowotworach
z ich zwiększoną złośliwością i opornością zasugerowało możliwość zastosowania terapii opartej o zmniejszenie poziomu białka Nrf2. Badania
prowadzone in vitro i na modelach zwierzęcych
z użyciem różnych typów komórek nowotworowych wykazały, że wyciszenie ekspresji Nrf2 w
komórkach nowotworowych m.in. za pomocą
shRNA Nrf2 (małe interferujące RNA o strukturze spinki do włosów, które prowadzi do degradacji komplementarnej sekwencji mRNA),
skutkuje ograniczeniem wzrostu guzów i zwiększeniem jego czułości na chemioterapeutyki.
Zaobserwowano szereg istotnych zmian w przypadku wyciszenia ekspresji Nrf2 w dwóch liniach
komórkowych
ludzkiego
niedrobnokomórkowego raka płuc charakteryzujących się konstytutywnie wysokim poziomem
Nrf2, wynikającym z mutacji w genie kodującym
Keap1. Po zastosowaniu shRNA Nrf2 komórki te
charakteryzowały się obniżonym poziomem genów regulowanych przez Nrf2 oraz zwiększoną
wrażliwością na chemioterapeutyki. Dodatkowo,
obserwowano wyraźnie zmniejszony wzrost guzów po wprowadzeniu shRNA do myszy nagich
(nude), którym wszczepiono ludzkie komórki nowotworowe. Co znamienne, zastosowanie samego shRNA Nrf2 zmniejszyło o 53% średnią masę
powstałych guzów w stosunku do kontrolnego
47
shRNA [64]. Badania te potwierdzają rolę Nrf2
we wzroście nowotworów i wskazują na potrzebę opracowania skutecznych metod obniżania
poziomu aktywnego Nrf2 w komórkach guza
[64–66].
Zakończenie
Czynnik transkrypcyjny Nrf2 poprzez stymulowanie ekspresji genów cytoprotekcyjnych i
ochronnych łączy pozornie przeciwstawne funkcje czynnika hamującego indukcję i promującego dalszy rozwój nowotworów.
W zdrowych komórkach Nrf2 stanowi ważny
mechanizm ochrony przed działaniem karcynogenów. Wykazano na przykład, że myszy z niedoborem Nrf2, poddane działaniu gazów
pochodzących ze spalania oleju napędowego czy
benzopirenu wykazują zwiększoną częstotliwość
występowania nowotworów w porównaniu do
myszy typu dzikiego [40,41]. Z drugiej strony,
Piśmiennictwo:
[1]P. Boyle et al. World Cancer Report 2008. IARC Press. 2008
[2]M.-K. Kwak et al. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention.
Toxicology and Applied Pharmacology. 2010
[3]P. Shelton et al. The transcription factor NF-E2-related Factor 2 (Nrf2): a
protooncogene?. The FASEB Journal. 2013
[4]W.D. Holtzclaw et al. Protection against electrophile and oxidative stress
by induction of phase 2 genes: the quest for the elusive sensor that
responds to inducers. Advances in Enzyme Regulation. 2004
[5]S.K. Niture et al. Regulation of Nrf2 - An update. Free Radical Biology &
Medicine. 2013
[6]U. Florczyk et al. Rola czynnika transkrypcyjnego Nrf2 w odpowiedzi
komórkowej na stres oksydacyjny. Postępy Biochemii. 2010
[7]H. Motohashi et al. Nrf2-Keap1 defines a physiologically important
stress response mechanism. Trends in Molecular Medicine. 2004
[8]P. Moi et al. Isolation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2), a NF-E2-like basic
leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NFE2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America. 1994
[9]K. Chan et al. NRF2, a member of the NFE2 family of transcription
factors, is not essential for murine erythropoiesis, growth, and
development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America. 1996
[10]D. Zhang Mechanistic Studies of the Nrf2-Keap1 Signaling Pathway.
Drug Metabolism Reviews. 2006
[11]A.K. Jain et al. Nuclear import and export signals in control of Nrf2. The
Journal of Biological Chemistry. 2005
[12]X.-J. Wang et al. Nrf2 enhances resistance of cancer cells to
chemotherapeutic drugs, the dark side of Nrf2. Carcinogenesis. 2008
[13]D. Zhang et al. Keap1 is a redox-regulated substrate adaptor protein
for a Cul3-dependent ubiquitin ligase complex. Molecular and Cellular
Biology. 2004
[14]Y. Kawai et al. Acetylation-deacetylation of the transcription factor Nrf2
(nuclear factor erythroid 2-related factor 2) regulates its transcriptional
activity and nucleocytoplasmic localization. The Journal of Biological
Chemistry. 2011
[15]S. Chowdhry et al. Nrf2 is controlled by two distinct β-TrCP recognition
motifs in its Neh6 domain, one of which can be modulated by GSK-3
activity. Oncogene. 2012
[16]J. Kulbacka et al. Stres oksydacyjny w procesach uszkodzenia komórek.
Pol. Merk. Lek. 2009
[17]K. Itoh et al. Keap1 represses nuclear activation of antioxidant
responsive elements by Nrf2 through binding to the amino-terminal Neh2
domain. Genes & Development. 1999
[18]N. Wakabayashi et al. Keap1-null mutation leads to postnatal lethality
due to constitutive Nrf2 activation. Nature Genetics. 2003
[19]T.W. Kensler et al. Nrf2: friend or foe for chemoprevention?
Carcinogenesis. 2010
[20]M. Furukawa et al. BTB protein Keap1 targets antioxidant transcription
factor Nrf2 for ubiquitination by the Cullin 3-Roc1 ligase. Molecular and
Cellular Biology. 2005
[21]W. Li et al. Molecular mechanisms of Nrf2-mediated antioxidant
response. Molecular Carcinogenesis. 2009
[22]K.I. Tong et al. Different electrostatic potentials define ETGE and DLG
motifs as hinge and latch in oxidative stress response. Molecular and
Cellular Biology. 2007
[23]B. Padmanabhan et al. Structural analysis of the complex of Keap1
48
nadekspresja Nrf2 w komórkach nowotworowych może je chronić przed szkodliwymi warunkami i skutkami terapii, a co więcej, promować
wzrost i dalszy rozwój guza. Komórki charakteryzujące się zwiększoną ekspresją Nrf2 wykryto
w wielu typach nowotworów, a jej obniżenie
skutkowało wyraźnie zwiększoną podatnością na
leczenie i zahamowaniem wzrostu guza
[48–50,64–66].
Dalsze badania powinny brać po uwagę oba kierunki działania Nrf2 i przebiegać dwutorowo. Z
jednej strony istotne jest poszukiwanie nowych,
aktywnych i bezpiecznych induktorów aktywności Nrf2 o znaczeniu w profilaktyce nowotworów, z drugiej zaś inhibitorów prowadzących do
zablokowania wzrostu guza. Do tego celu kluczowe jest dalsze dogłębne poznanie mechanizmów rządzących aktywacją Nrf2 i
wpływających na jego transkrypcyjną aktywność.
with a prothymosin alpha peptide. Acta Crystallographica. 2008
[24]D. Stewart et al. Degradation of transcription factor Nrf2 via the
ubiquitin-proteasome pathway and stabilization by cadmium. The Journal
of Biological Chemistry. 2003
[25]K. Itoh et al. Keap1 regulates both cytoplasmic-nuclear shuttling and
degradation of Nrf2 in response to electrophiles. Genes to Cells. 2003
[26]J.W. Kaspar et al. Nrf2:INrf2 (Keap1) signaling in oxidative stress. Free
Radical Biology & Medicine. 2009
[27]S.K. Niture et al. Src subfamily kinases regulate nuclear export and
degradation of transcription factor Nrf2 to switch off Nrf2-mediated
antioxidant activation of cytoprotective gene expression. The Journal of
Biological Chemistry. 2011
[28]H.-C. Huang et al. Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase
C regulates antioxidant response element-mediated transcription. The
Journal of Biological Chemistry. 2002
[29]H.K. Bryan et al. The Nrf2 cell defence pathway  : Keap1-dependent
and -independent mechanisms of regulation. Biochemical Pharmacology.
2013
[30]P.L. Apopa et al. Phosphorylation of Nrf2 in the transcription activation
domain by casein kinase 2 (CK2) is critical for the nuclear translocation
and transcription activation function of Nrf2 in IMR-32 neuroblastoma cells.
Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 2008
[31]O.-H. Lee et al. An auto-regulatory loop between stress sensors INrf2
and Nrf2 controls their cellular abundance. The Journal of Biological
Chemistry. 2007
[32]J.W. Kaspar et al. An autoregulatory loop between Nrf2 and Cul3-Rbx1
controls their cellular abundance. The Journal of Biological Chemistry. 2010
[33]A. Maruyama et al. The novel Nrf2-interacting factor KAP1 regulates
susceptibility to oxidative stress by promoting the Nrf2-mediated
cytoprotective response. The Biochemical Journal. 2011
[34]S. Dhakshinamoorthy et al. Bach1 competes with Nrf2 leading to
negative regulation of the antioxidant response element (ARE)-mediated
NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 gene expression and induction in
response to antioxidants. The Journal of Biological Chemistry. 2005
[35]J.W. Kaspar et al. Antioxidant-induced phosphorylation of tyrosine 486
leads to rapid nuclear export of Bach1 that allows Nrf2 to bind to the
antioxidant response element and activate defensive gene expression.
The Journal of Biological Chemistry. 2010
[36]E. Ingley Src family kinases: regulation of their activities, levels and
identification of new pathways. Biochimica Et Biophysica Acta. 2008
[37]S.K. Niture et al. Prothymosin-alpha mediates nuclear import of the
INrf2/Cul3 Rbx1 complex to degrade nuclear Nrf2. The Journal of Biological
Chemistry. 2009
[38]M. Ramos-Gomez et al. Sensitivity to carcinogenesis is increased and
chemoprotective efficacy of enzyme inducers is lost in nrf2 transcription
factor-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America. 2001
[39]T.O. Khor et al. Increased Susceptibility of Nrf2 Knockout Mice to
Colitis-Associated Colorectal Cancer. Cancer Prevention Research. 2008
[40]Y. Aoki et al. Enhanced spontaneous and benzo(a)pyrene-induced
mutations in the lung of Nrf2-deficient gpt delta mice. Cancer Research.
2007
[41]Y. Aoki et al. Accelerated DNA adduct formation in the lung of the Nrf2
knockout mouse exposed to diesel exhaust. Toxicology and Applied
Pharmacology. 2001
[42]H. Satoh et al. Nrf2-deficiency creates a responsive microenvironment
for metastasis to the lung. Carcinogenesis. 2010
[43]K. Iida et al. Nrf2 is essential for the chemopreventive efficacy of
oltipraz against urinary bladder carcinogenesis. Cancer Research. 2004
[44]R. Thimmulappa et al. Identification of Nrf2-regulated genes induced
by the chemopreventive agent sulforaphane by oligonucleotide
microarray. Cancer Research. 2002
[45]P. Shelton et al. The transcription factor NF-E2-related Factor 2 (Nrf2):
a protooncogene?. FASEB Journal. 2013
[46]J. Pi et al. Deficiency in the nuclear factor E2-related factor-2
transcription factor results in impaired adipogenesis and protects against
diet-induced obesity. The Journal of Biological Chemistry. 2010
[47]A. Hojka et al. Receptory aktywowane proliferatorami peroksysomów
(PPAR). Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 2011
[48]K. Taguchi et al. Molecular mechanisms of the Keap1–Nrf2 pathway in
stress response and cancer evolution. Genes to Cells. 2011
[49]Y. Kim et al. Oncogenic NRF2 mutations in squamous cell carcinomas
of oesophagus and skin. The Journal of Pathology. 2010
[50]T. Shibata et al. Cancer related mutations in NRF2 impair its
recognition by Keap1-Cul3 E3 ligase and promote malignancy. Proceedings
of the National Academy of Sciences. 2009
[51]M.B. Sporn et al. NRF2 and cancer: the good, the bad and the
importance of context. Nature Reviews. Cancer. 2012
[52]G.M. DeNicola et al. Oncogene-induced Nrf2 transcription promotes
ROS detoxification and tumorigenesis. Nature. 2011
[53]R. Wang et al. Hypermethylation of the Keap1 gene in human lung
cancer cell lines and lung cancer tissues. Biochemical and Biophysical
Research Communications. 2008
[54]S. Homma et al. Nrf2 enhances cell proliferation and resistance to
anticancer drugs in human lung cancer. Clinical Cancer Research. 2009
[55]G. Shim et al. Acquisition of doxorubicin resistance in ovarian
carcinoma cells accompanies activation of the NRF2 pathway. Free Radical
Biology & Medicine. 2009
[56]T. Jiang et al. High levels of Nrf2 determine chemoresistance in type II
endometrial cancer. Cancer Research. 2010
[57]S.K. Niture et al. Nrf2 protein up-regulates antiapoptotic protein Bcl-2
and prevents cellular apoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 2012
[58]Y. Mitsuishi et al. Nrf2 redirects glucose and glutamine into anabolic
pathways in metabolic reprogramming. Cancer Cell. 2012
[59]X. Zhang et al. Activation of the Nrf2/antioxidant response pathway
increases IL-8 expression. European Journal of Immunology. 2005
[60]K. Xie Interleukin-8 and human cancer biology. Cytokine & Growth
Factor Reviews. 2001
[61]A. Loboda et al. HIF-1 induction attenuates Nrf2-dependent IL-8
expression in human endothelial cells. Antioxidants & Redox Signaling.
2009
[62]U. Florczyk et al. Opposite effects of HIF-1α and HIF-2α on the
regulation of IL-8 expression in endothelial cells. Free Radical Biology &
Medicine. 2011
[63]R. Gyanchandani et al. Interleukin-8 as a modulator of response to
bevacizumab in preclinical models of head and neck squamous cell
carcinoma. Oral Oncology. 2013
[64]A. Singh et al. RNAi-mediated silencing of nuclear factor erythroid-2related factor 2 gene expression in non-small cell lung cancer inhibits
tumor growth and increases efficacy of chemotherapy. Cancer Research.
2008
[65]X. Ma et al. Nrf2 knockdown by shRNA inhibits tumor growth and
increases efficacy of chemotherapy in cervical cancer. Cancer
Chemotherapy and Pharmacology. 2012
[66]T.-H. Kim et al. NRF2 blockade suppresses colon tumor angiogenesis
by inhibiting hypoxia-induced activation of HIF-1α. Cancer Research. 2011
49
CO NAM DZIŚ POWIE SEKWENCJA?
PRZEWIDYWANIA STRUKTURY DRUGORZĘDOWEJ ORAZ
REJONÓW SAMOISTNIE NIEUPORZĄDKOWANYCH BIAŁEK
NA PODSTAWIE SEKWENCJI AMINOKWASOWEJ.
Adam Górka
Zakład Biochemii Fizycznej
Wydział Biochemii Biofizyki i Biotechnologii
e-mail: adam. gorka@uj. edu. pl
Praca napisana pod opieką: dr P. Bonarka
Streszczenie: Współczesne metody przewidywania struktur drugorzędowych białek
opierają się na wiedzy zawartej w ich eksperymentalnie wyznaczonych strukturach
przestrzennych. Zebrane są one w bazach danych PDB (ponad 70 tys. struktur) i DisProt
(1421 obszarów nieuporządkowanych). Informacje zawarte w nowo zsekwencjonowanych
genomach pozwalają na identyfikację nowych białek występujących w przyrodzie. Ze
względu na rosnącą przepaść między ilością zdeponowanych struktur przestrzennych,
a ilością znanych sekwencji oraz na brak skutecznych technik rejonów o strukturze
samoistnie nieuporządkowanej w białkach, wiele z nich pozostaje bez opisu swojej
struktury i funkcji. Kluczowym krokiem w procesie badania ich struktury drugorzędowej
oraz wewnętrznego nieuporządkowania jest porównywanie, przy użyciu odpowiednich
algorytmów, ich sekwencji i sekwencji białek o znanej strukturze przestrzennej.
Bioinformatyczna analiza pozostaje podstawowym narzędziem w rękach badaczy.
Białka samoistnie nieuporządkowane
Białka w przyrodzie mogą występować w czterech stanach konformacyjnej organizacji struktury przestrzennej. Wyróżnia się stan
uporządkowany (z ang. order), stan stopionej
globuli (z ang. molten globule), pre-stopionej
globuli (z ang. pre-molten globule) oraz stan
kłębka statystycznego (z ang. random coil). Natywnie białka mogą występować w każdym z wymienionych stanów konformacyjnej organizacji
przestrzennej. Białkami samoistnie nieuporządkowanymi (z ang. intrinsically disordered proteins - IDPs) nazywamy te, które natywnie
występują w stanie kłębka statystycznego lub
pre-stopionej globuli. Białka te, w odróżnieniu
od białek o uporządkowanej strukturze, charakteryzuje brak ściśle zdefiniowanej struktury
trzeciorzędowej, jednakże mogą one posiadać
lokalnie pojawiające się i zanikające elementy
struktury drugorzędowej [1]. Białka samoistnie
nieuporządkowane charakteryzuje wzbogacenie
sekwencji w zawartość małych, hydrofilowych
aminokwasów często obdarzonych ładunkiem.
W odróżnieniu od nich, sekwencje promujące
uporządkowanie, są bogate w aminokwasy hydrofobowe [2–4].
Obszary nieuporządkowane występują w 33%
białek eukariotycznych, a tylko w 2% u archei w 4,2% u eubakterii [5]. Przewiduje się, że 12%
białek u eukariontów ma całkowicie nieuporządkowaną strukturę przestrzenną [6]. Wiadomo
50
również, że odcinki o długości co najmniej 60
aminokwasów nie posiadają zdefiniowanej
struktury drugorzędowej i występują u więcej
niż 20% białek [7]. Techniki standardowo wykorzystywane do badania struktury przestrzennej
białek, takie jak krystalografia rentgenowska,
okazują się być niewystarczające w przypadku
badania trójwymiarowej struktury przestrzennej
dynamicznych białek o samoistnie nieuporządkowanej strukturze [1, 2]. Dodatkowo rośnie
przepaść pomiędzy ilością zdeponowanych nowych struktur przestrzennych białek, a ilością
znanych nowych sekwencji aminokwasowych.
Wszystko to sprawia, że bioinformatyczna analiza pozostaje podstawowym narzędziem w rękach
badaczy
białek
samoistnie
nieuporządkowanych.
Stworzono wiele podejść do przewidywania nieuporządkowania struktury łańcucha polipetydowego i struktur drugorzędowych w sekwencjach
białek. Kluczowym krokiem w procesie badania
ich struktury oraz funkcji jest porównywanie ich
sekwencji i sekwencji białek o znanej strukturze
przestrzennej, przy użyciu odpowiednich algorytmów. Współczesne metody przewidywania
opierają się na wiedzy zawartej w eksperymentalnie wyznaczonych strukturach przestrzennych białek. Jest ona zebrana w dwóch zbiorach:
w bazie danych PDB (ponad 70 tys. struktur)
i w bazie danych DisProt (1421 obszarów samoistnie nieuporządkowanych) [8].
Górka A. „Przewidywania struktury drugorzędowej oraz rejonów samoistnie nieuporządkowanych białek” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
Programy do przewidywania struktur drugorzędowych w białkach
Programy do przewidywania rejonów samoistnie nieuporządkowanych w białkach
Obecne metody przewidywania struktur drugorzędowych bazują głównie na algorytmach sieci
neuronowych. Przewidywanie jest jednak poprzedzone wyszukiwaniem homologów zadanej
sekwencji algorytmem PSI-BLAST. Zgromadzone
informacje zostają przepuszczone przez jedną
lub kilka sieci neuronowych prowadzących przewidywanie. Zbiór wyników bardzo często jest
opracowywany przez końcowy algorytm bazujący na sieciach neuronowych, ukrytych modelach
markowa (HMM) lub maszynie wektorów nośnych (SVM), który na końcu daje nam ujednolicone końcowe przewidywanie struktur
drugorzędowych w sekwencji. Wśród metod
przewidywania struktur drugorzędowych należy
wyróżnić: PsiPred [9], Yaspin [10], Jpred3 [11],
SSpro [12], Proteus 2 [13], a w szczególności algorytm Porter [14]. Porter jest rozwojową wersją
algorytmu SSpro. Wykorzystuje on zaawansowany protokół wymyślnej dwukierunkowej rekurencyjnej sieci neuronowej pozwalający na
uwzględnienie oddziaływań dalekozasięgowych.
Zastosowana architektura sieci neuronowej pozwala na wykorzystanie dwóch dodatkowych
przesuwnych okien poruszających się po sekwencji w przeciwnych kierunkach, w poszukiwaniu oddziaływań daleko zasięgowych.
Dodatkowo w porównaniu do SSpro, Porter posiada rozszerzoną listę aminokwasów opisującą
profil wejściowy- użyto w nim bardziej wyrafinowanego filtra na wyjściu, a także większej bazy danych do szkolenia sieci neuronowych [15].
Spośród metod przewidywania nieuporządkowania struktury w białkach, należy zwrócić szczególną uwagę na kilka algorytmów. GLOBPLOT 2
swoje działanie opiera na analizie składu aminokwasowego zadanej sekwencji i prawdopodobieństwach występowania danego aminokwasu
w obszarach globularnych i nieglobularnych.
Metoda ta sprawdza się dobrze w przypadku
przewidywania domen i linkerów w strukturach
globularnych białek [16]. IUPRED 2 przewiduje
samoistne nieuporządkowanie struktury w białkach na podstawie wyliczonych parami energii
oddziaływania miedzy resztami bocznymi aminokwasów w sekwencji. Energia ta jest wyliczana jako forma kwadratowa z składu
aminokwasowego. Algorytm ten występuje w
dwóch wariantach do przewidywania długich i
krótkich obszarów samoistnie nieuporządkowanych. IUPRED 2 jest obecnie najlepszą metodą
do wyznaczania długich odcinków samoistnie
nieuporządkowanych w sekwencjach białek [17].
Sieć neuronowa PONDR VSL2 została zoptymalizowana pod kątem poprawnego przewidywania
długich i krótkich rejonów samoistnie nieuporządkowanych struktury w sekwencji. Jego dokładność jest porównywalna z IUPRED 2. Jest
obecnie jedną z najlepszych metod przewidywania samoistnego nieuporządkowana w białkach [4]. MetaPrDOS jest meta serwerem
opartym na jury ekspertów. Serwer wykorzystuje następujące algorytmy do przewidywania samoistnego nieuporządkowania struktury w
białkach: PrDOS, DISOPRED 2 DisEMBL, DISPROT, DISpro IUPRED, POODLES-S. Następnie
algorytm zbudowany na bazie maszyny wektorów nośnych (z ang. suport vector machine,
SVM), na podstawie zebranych wyników wykonuje końcowe przewidywanie [18]. PONDR FIT
jest meta serwerem do przewidywania samoistnego nieuporządkowania struktury w białkach.
Zasada jego działania oparta jest na jury metod
ekspertów: PONDR VXLT, PONDR VL3, PONDR
VSL2, IUPRED 2, FoldIndex, TopIDP. Przewidywanie metod ekspertów jest analizowane przez
dodatkową sieć neuronową, która podejmuje
ostateczną decyzję [19]. Jeszcze innym meta
serwerem jest MetaDisorder, oparty na wybranych 13 algorytmach do przewidywania nieuporządkowania w białkach [20].
Rys. 1 . Model kwartetu białkowego. Białka w przyrodzie mogą
występować w czterech stanach konformacyjnej organizacji
struktury przestrzennej: w stanie kłębka statystycznego, prestopionej globuli, stopionej globuli i w stanie uporządkowanym.
Każdy z nich może być stanem natywnym białka lub rejonu białka. Pojedyncza funkcja białka może wynikać z któregokolwiek z
tych stanów, a co więcej z dowolnego przejść pomiędzy nimi [1 ].
Usystematyzowane podejście do przewidywania rejonów samoistnie nieuporządkowanych i struktur drugorzędowych w białkach
W praktyce można zaproponować kilka etapów
postępowania prowadzącego do poprawnego
przewidywania struktur drugorzędowych i rejonów o samoistnie nieuporządkowanej strukturze
w białkach. W pierwszym etapie, dla badanego
51
Górka A. „Przewidywania struktury drugorzędowej oraz rejonów samoistnie nieuporządkowanych białek” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
białka należy wyszukać sekwencje homologiczne
oraz przeanalizować dostępną literaturę w poszukiwaniu wyznaczonych obszarów funkcjonalnych w jego sekwencji (informacje te będą
przydatne podczas interpretacji wyników). Następnie, dla wszystkich analizowanych sekwencji
należy wyznaczyć rejony o niskiej złożoności
składu aminokwasowego, wyznaczyć rejony tworzące zwoje heliakalne (coiled-coil), odcinki
trans membranowe, peptydy sygnałowe, mostki
disiarczkowe, sprawdzić obecność znanych motywów sekwencji. Należy też sprawdzić czy w
zbiorze badanych sekwencji znajdują się takie,
dla których są już wyznaczone struktury krystalograficzne. Dla wszystkich sekwencji warto też
wygenerować wykresy HCA (z ang. Hydrofobic
Cluster Analysis) i LCA (z ang. Loop Cluster
Analysis). Kolejnym krokiem jest stworzenie uliniowienia wielosekwencyjnego i naniesienie na
nie wszystkich zebranych dodatkowych informacji. W kolejnym etapie należy wyznaczyć obszary
konserwowane ewolucyjnie i obszary o dużej
zmienności sekwencji. Należy tez zwrócić uwagę, w których miejscach występują insercje do-
datkowych aminokwasów pomiędzy konserwowanymi rejonami. Dla przygotowanego uliniowienia wielosekwencyjnego należy uruchomić
przewidywanie struktur drugorzędowych i obszarów nieuporządkowanych, przy użyciu kilku
najlepszych metod. Wyniki przewidywania należy nanieść na uliniowienie wielosekwencyjne.
Na podstawie zebranych informacji warto postulować podział białka na możliwe domeny. Następnie dobrze jest wyznaczyć stosunek ładunku
do hydrofobowości dla proponowanych domen
białka (CH-plot). Parametr ten pozwala na odróżnienie domen nieuporządkowanych od globularnych [3, 6, 15].
W ostatniej fazie analizy należy przyjrzeć się dokładnie wszystkim zebranym wynikom, zwrócić
szczególną uwagę na ich spójność. Istotne są
korelacje wyników przewidywania z poziomom
konserwacji sekwencji i zebranymi danymi literaturowymi. Końcowym wynikiem takiej analizy
powinny być nowe hipotezy badawcze, które
można weryfikować eksperymentalnie w laboratorium.
Piśmiennictwo:
[1.] Uversky VN: Natively unfolded proteins: a point where biology waits
for physics. Protein science : a publication of the Protein Society 2002,
11:739-56.
[2.] Dunker AK, Lawson JD, Brown CJ, et al. Intrinsically disordered protein.
Journal of molecular graphics & modelling 2001, 19:26-59.
[3.] Ferron F, Longhi S, Canard B, Karlin D: A practical overview of protein
disorder prediction methods. Proteins 2006, 65:1-14.
[4.] He B, Wang K, Liu Y, et al. Predicting intrinsic disorder in proteins: an
overview. Cell research 2009, 19:929-949.
[5.] Ward JJ, Sodhi JS, McGuffin LJ, Buxton BF, Jones DT: Prediction and
functional analysis of native disorder in proteins from the three kingdoms
of life. Journal of molecular biology 2004, 337:635-45.
[6.] Bourhis JM, Canard B, Longhi S: Predicting protein disorder and
induced folding: from theoretical principles to practical applications.
Current protein & peptide science 2007, 8:135-149.
[7.] Rost B: Review : Protein Secondary Structure Prediction Continues to
Rise. Journal of Structural Biology 2001, 218:204 -218.
[8.] Vucetic S, Obradovic Z, Vacic V, et al. DisProt: a database of protein
disorder. Bioinformatics (Oxford, England) 2005, 21:137-140.
[9.] McGuffin LJ, Bryson K, Jones DT: The PSIPRED protein structure
prediction server. Bioinformatics (Oxford, England) 2000, 16:404-5.
[10.] Lin K, Simossis V a, Taylor WR, Heringa J: A simple and fast secondary
structure prediction method using hidden neural networks. Bioinformatics
(Oxford, England) 2005, 21:152-159.
[11.] Cole C, Barber JD, Barton GJ: The Jpred 3 secondary structure
prediction server. Nucleic acids research 2008, 36:W197-201.
52
[12.] Pollastri G, Przybylski D, Rost B, Baldi P: Improving the prediction of
protein secondary structure in three and eight classes using recurrent
neural networks and profiles. Proteins 2002, 47:228-35.
[13.] Montgomerie S, Cruz J a, Shrivastava S, et al. PROTEUS2: a web
server for comprehensive protein structure prediction and structure-based
annotation. Nucleic acids research 2008, 36:W202-9.
[14.] Pollastri G, McLysaght A: Porter: a new, accurate server for protein
secondary structure prediction. Bioinformatics (Oxford, England) 2005,
21:1719-20.
[15.] Pirovano W, Heringa J: Protein secondary structure prediction.
Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 2010, 609:327-48.
[16.] Linding R, Russell RB, Neduva V, Gibson TJ: GlobPlot: Exploring
protein sequences for globularity and disorder. Nucleic acids research
2003, 31:3701-3708.
[17.] Dosztányi Z, Csizmok V, Tompa P, Simon I: IUPred: web server for the
prediction of intrinsically unstructured regions of proteins based on
estimated energy content. Bioinformatics (Oxford, England) 2005,
21:3433-4.
[18.] Ishida T, Kinoshita K: Prediction of disordered regions in proteins
based on the meta approach. Bioinformatics (Oxford, England) 2008,
24:1344-8.
[19.] Xue B, Dunbrack RL, Williams RW, Dunker a K, Uversky VN: PONDRFIT: a meta-predictor of intrinsically disordered amino acids. Biochimica et
biophysica acta 2010, 1804:996-1010.
AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNA GLUKANÓW POCHODZENIA GRZYBOWEGO
Katarzyna Chamera
Koło N aukowe Studentów Biotechnologii „ M ygen”
Praca napisana pod opieką dr M oniki Osińskiej-Jaroszuk
Streszczenie: Grzyby są cenione nie tylko z uwagi na walory smakowe, ale przede
wszystkim ze względu na fakt, iż są źródłem wielu substancji biologicznie czynnych. Wśród
takich związków, szczególnie interesującą grupę tworzą glukany. Są one polimerami
glukozy i stanowią jeden z głównych składników zapewniających sztywność ściany
komórkowej grzybów. Liczne badania sugerują, że glukany, dzięki swojemu
wielokierunkowemu działaniu, mogą być w przyszłości rozpatrywane jako potencjalne
środki lecznicze lub wspomagające terapię chorób, takich jak: nowotwory, cukrzyca,
nadciśnienie tętnicze, infekcje wirusowe, czy zakażenia bakteryjne.
Wstęp
Ostatnimi laty wiele uwagi poświęca się poszukiwaniom związków aktywnych biologicznie,
które mogłyby wzmocnić (lub nawet zupełnie
zastąpić) działanie współcześnie stosowanych
środków leczniczych oraz poszerzyć zakres dostępnych terapii wielu chorób, między innymi
nowotworów, nadciśnienia tętniczego, czy cukrzycy, które stały się chorobami „naszych czasów”. W związku z tym, iż w krajach takich jak
np.: Chiny czy Japonia, od setek lat, grzyby (na
przykład Ganoderma lucidum, Lentinus edodes,
Tremella fuciformis) są zbierane, uprawiane i
stosowane jako związki lecznicze [1], naukowcy
postanowili bliżej przyjrzeć się zawartym w nich
substancjom. W wyniku licznych analiz odkryto,
że organizmy te zawierają rozmaite polisacharydy, stanowiące bardzo obiecujące źródło alternatywnych preparatów leczniczych. Dalsze
badania ujawniły, że szczególnie wyróżniającymi
się pod względem aktywności biologicznej
związkami są glukany.
Czym są glukany?
Glukany tworzą najbardziej powszechną grupę
biologicznie czynnych polisacharydów grzybowych. Są one cząsteczkami składającymi się z
reszt glukozy, połączonych wiązaniami α- lub βglikozydowymi. Przykłady wzorów β-(1→3)(1→6)glukanów ukazujących powtarzające się jednostki monosacharydowe przedstawiono na rysunku
1. Glukany mają budowę liniową lub rozgałęzioną. Niektóre z nich posiadają przyłączone w różnych pozycjach łańcuchy boczne, które
zawierają molekuły monosacharydów połączone
w rozmaitych kombinacjach [2].
Jednym z głównych źródeł pozyskiwania glukanów są ściany komórkowe drożdży Saccharomyces cerevisiae, Sclerotium glucanicum i
Rhodotorula rubra. Glukany występują również
Rys. 1 . Przykłady struktur β-(1 →3)(1 →6)-glukanów ukazujące
ich powtarzające się jednostki monosacharydowe [3].
w bakteriach. Ponadto polisacharydy te występują także w roślinach wyższych (zwłaszcza
w_ziarnach zbóż takich jak jęczmień i_owies) i w
grzybach jadalnych. Od źródła pochodzenia glukanów zależy ich struktura chemiczna (głównie
masa cząsteczkowa, sposób i liczba odgałęzień
łańcuchów bocznych), ta zaś wpływa na ich aktywność biologiczną. Glukany wzmacniają ściany
komórkowe bakterii, drożdży i_grzybów wyższych poprzez tworzenie matryc z innymi wielocukrami [4].
Bogatym źródłem wielu typów glukanów są
grzyby z klasy Basidiomycetes. Wyizolowano
z_nich m. in.: lentinan, schizofyllan i pleuran [4].
Przykładowe glukany pochodzenia grzybowego
zestawiono w tabeli 1. Bioaktywne polisacharydy mogą być ekstrahowane z grzybni, owocników i sklerotów, które reprezentują trzy
odmienne stadia rozwojowe grzybów wielkoowocnikowych [1].
53
Chamera K. „Aktywność biologiczna glukanów pochodzenia grzybowego” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
Tabela 1 . Przykłady β-glukanów pochodzenia grzybowego [1 , 3].
Jeden z podstawowych podziałów glukanów, zaproponowany przez Augustίn’a et. al. [4], opiera
się na właściwościach fizykochemicznych tych
związków. Obejmuje on cztery grupy:
1. grupa rozgałęzionych β-1,3-glukanów o dużej
masie cząsteczkowej. Główny poliglukozowy
łańcuch tych glukanów zwija się w wodzie w jeden do trzech kłębków. Przykładowymi związkami zaliczanymi do tej grupy są: pleuran,
lentinan, grifolan i_schizofyllan, wywodzące się
kolejno z następujących gatunków grzybów:
boczniak ostrygowaty (Pleurotus ostreatus),
shiitake (Lentinus edodes), żagwica listkowata
(Grifola frondosa) i rozszczepka pospolita (Schizophyllum commune).
2. grupa β-glukanów o niższej masie cząsteczkowej. Zawierają one hydrofilowe grupy glukozy, a
także tworzą przypadkowe konfiguracje przestrzenne w wodzie. Przykładem glukanu należącego do tej grupy jest karboksymetylo-glukan.
3. grupa glukanów drobnocząsteczkowych. Jej
typowym przedstawicielem jest zymosan wyizolowany z drożdży Saccharomyces cerevisiae.
4. grupa α-glukanów. Zawierają w swojej chemicznej strukturze grupę hydroksylową w αkonfiguracji przy C1.
Ponadto glukany można podzielić ze względu na
ich rozpuszczalność. Jest ona związana ze stopniem polimeryzacji tych związków (DP). Dla
przykładu β-glukany są całkowicie nierozpuszczalne w_wodzie, gdy ich DP > 100. Rozpuszczalność wzrasta wraz ze spadkiem wartości DP.
Co więcej, β-glukany można także klasyfikować
biorąc pod uwagę ich rozpuszczalność w zasadach, czy kwasie octowym [5], jak również w
związku z ich charakterem chemicznym. Podział
ten obejmuje trzy grupy: glukany kwasowe, glukany zasadowe oraz glukany obojętne.
AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNA GLUKANÓW
Glukany stanowią niezwykle ciekawą grupę
związków polisacharydowych ze względu na ich
wielokierunkowe właściwości biologiczne.
Szczególnie interesująca jest ich aktywność
przeciwnowotworowa, która pozwala na wyko-
54
rzystanie tych związków w profilaktyce i wspomaganiu leczenia chorób nowotworowych. W
kontekście tym, najlepszym zastosowaniem dla
ekstraktów grzybowych wydaje się być ich użycie w leczeniu bardzo małych guzów. Sądzi się,
że substancje te są bezpieczne mimo długoterminowego stosowania oraz skuteczne w wydłużaniu okresu przeżycia pacjentów, remisji guzów
i_redukcji bólu [4].
Glukany, oprócz szeroko udokumentowanego
działania przeciwnowotworowego, wykazują
również liczne aktywności, umożliwiające ewentualne wykorzystanie tych związków w leczeniu
innych chorób, takich jak: cukrzyca, nadciśnienie tętnicze, choroby grzybicze, zakażenia pasożytami, czy infekcje wirusowe [3, 6]. Ponadto,
posiadają zastosowanie przy obniżaniu poziomu
cholesterolu we krwi, stymulacji komórek nerwowych oraz w procesie gojenia ran [2, 3, 6]. Co
więcej, mogą być wykorzystywane w leczeniu
schorzeń związanych z utratą kości lub niską ich
gęstością (takich jak np.: osteoporoza), a także
w metodach wspierających proces rozwoju kośćca [7].
Aktywność przeciwnowotworowa
Udział i znaczenie polisacharydów pochodzenia
grzybowego, w tym glukanów, w leczeniu chorób
nowotworowych postulowane są już od kilkudziesięciu lat [1]. Ich przeciwnowotworowe
działanie opiera się głównie na aktywacji odpowiedzi immunologicznej gospodarza, dlatego też
związki te uważa się za biologiczne modyfikatory odpowiedzi – BRMs (ang. Biological Response
Modifiers) [8]. Mechanizm działania glukanów w
odniesieniu do nowotworów obejmuje indukcję
apoptozy komórek guza, a także zapobieganie
onkogenezie i przerzutowaniu, co jest związane
z ich aktywnością immunostymulującą. Nie zabijają one natomiast komórek nowotworowych w
sposób bezpośredni – oddziałują niespecyficznie
na organizm i pomagają mu pokonać chorobę.
Badania wykazały, że czynnikiem wymaganym
do aktywności przeciwnowotworowej glukanów
jest obecność limfocytów T, oraz że opiera się
ona na grasicozależnym mechanizmie odporności [1]. Nie mniej jednak, związki te mogą oddziaływa
na wiele różnych receptorów błonowych, znajdujących się na komórkach odpornościowych.
Prowadzi to do aktywacji licznych szlaków sygnałowych, co z kolei powoduje zaangażowanie
takich komórek jak: monocyty, makrofagi, komórki dendrytyczne, komórki NK i neutrofile.
Tak więc, immunomodulujące działanie glukanów obejmuje zarówno wrodzoną, jak i nabytą
odpowiedź immunologiczną [9].
Jednym z szeroko zbadanych glukanów, pod kątem aktywności przeciwnowotworowej jest lentinan pochodzący z grzyba Lentinus edodes (Rys.
2). Podawanie tego związku może promować ak-
tywację makrofagów przez cytokiny, produkowane po specyficznym rozpoznaniu komórek rakowych przez pewne grupy limfocytów. Lentinan
indukuje wzrost ilości TNF-α, IL-1, IL-3 oraz interferonu, powodując dojrzewanie, różnicowanie
i proliferację komórek immunokompetentnych
[1].
siae posiada zdolność redukowania replikacji,
przy jednoczesnym zwiększaniu poziomu interferonu-gamma i tlenku azotu, co pokazano w badaniach prowadzonych na świniach zakażonych
wirusem świńskiej grypy [12].
Niektóre glukany, między innymi lentinan, WGP
(glukan pochodzący z Saccharomyces cerevisiae), oraz skleroglukan (SSG) są również skuteczne w zwalczaniu infekcji bakteryjnych.
Lentinan zwiększa liczbę makrofagów, dzięki
czemu redukuje infekcje wywołane przez Mycobacteriaum tuberculosis (badania in vivo u
szczurów). Co więcej, badania in vitro wykazały,
że makrofagi te charakteryzowały się zwiększoną zdolnością zabijania komórek Mycobacterium
tuberculosis [13]. PGG z Saccharomyces cerevisiae wykazuje skuteczne działanie lecznicze
przeciwko infekcjom spowodowanym przez
oporne na antybiotyki β-laktamowe (w_tym metycylinę) szczepy Staphylococcus aureus. Wykazano, że u szczurów zakażonych takimi
szczepami, przeżywalność po zastosowaniu PGG
znacząco wzrosła [14]. Glukan ten może również
zapobiegać zakażeniom ran, z tym że jego wartość terapeutyczna wzrasta w leczeniu skojarzonym z_antybiotykiem cefazoliną. Jednak
mechanizm tego zjawiska nie został jeszcze wyjaśniony [3].
Rola w gojeniu się ran
Rys. 2. Lentinus edodes [1 8].
Z praktyki klinicznej wiadomo, że polisacharydy
grzybowe działają najefektywniej w_połączeniu z
innymi metodami konwencjonalnego leczenia
nowotworów, takimi jak chemioterapia, czy operacyjne usuwanie guzów nowotworowych [10].
Dzięki temu, że glukany, w przeciwieństwie do
tradycyjnych leków przeciwnowotworowych, nie
powodują istotnych działań niepożądanych,
możliwe jest ich stosowanie zarówno w terapii
monolekowej, jak również jako środki wspomagające chemioterapię [2].
Aktywność antywirusowa i przeciwbakteryjna
Udowodniono, że wybrane glukany, takie jak
np.: schizofyllan (SPG), lentinan, czy zymosan
mogą być skuteczne przeciwko niektórym czynnikom wirusowym. SPG moduluje zarówno komórkową, jak i humoralną odpowiedź
immunologiczną przy przewlekłym zapaleniu
wątroby typu B [3]. Wykazano, że doustne podawanie glukanu pochodzącego z Aureobasidium
pullulans zwiększa przeżywalność myszy zainfekowanych szczepem A/Puerto Rico/8/34 wirusa
grypy, a także znacząco tłumi jego replikację
[11]. Również zymosan z Saccharomyces cerevi-
Jak wynika z badań przeprowadzonych zarówno
u zwierząt, jak i u ludzi, stymulowanie makrofagów glukanami z Saccharomyces cerevisiae może korzystnie wpływać na gojenie ran oraz
redukowanie poziomu tkanki bliznowatej, powstałej w wyniku operacji, czy urazu [6]. W
przypadku prawidłowych ludzkich fibroblastów
skóry, podanie preparatu z tego β-glukanu
zwiększa poziom mRNA dla prokolagenu typu I i
III, oraz biosyntezę kolagenu. Co więcej, stymuluje on aktywność czynnika transkrypcyjnego
NF-1 (ang. Nuclear factor-1) [15]. Ten sam glukan indukuje także syntezę mRNA dla wielu innych czynników wzrostu, istotnych w gojeniu się
ran, w tym czynnika transkrypcyjnego AP-1
(ang. Activator protein-1), czynnika transkrypcyjnego Sp1 (ang. Specificity protein-1), neurotrofiny 3, płytkopochodnego czynnika wzrostu
(zarówno A, jak i B), kwaśnego czynnika wzrostu
fibroblastów, podstawowego czynnika wzrostu
fibroblastów, oraz czynnika wzrostu śródbłonka
naczyń [16]. Mechanizm regulowania syntezy
tych czynników pozostaje jednak niejasny [3].
Podsumowanie
Glukany pochodzenia grzybowego stanowią grupę związków wykazujących zróżnicowane aktywności biomedyczne, co sprawia, iż w
przyszłości mogą się one stać obiecującą alternatywą dla obecnie stosowanych konwencjonal-
55
nych metod leczenia wielu chorób. Glukany
prawdopodobnie mogą być również źródłem nowych, niestosowanych dotychczas terapii leczniczych. Co więcej, wraz z rozwojem metod
badawczych, przypuszczalnie możliwe stanie się
całkowite wyjaśnienie cech strukturalnych tych
związków, co pozwoli lepiej zrozumieć mechanizmy, na których opiera się działanie glukanów.
Prawdopodobnie dzięki metodom z zakresu biotechnologii również produkcja glukanów na szeroką skalę stanie się przystępniejsza. Procedury
wykorzystujące mikroorganizmy (np.: Saccharomyces cerevisiae), czy techniki wprowadzania
specyficznych genów do transgenicznej żywności mogą okazać się skuteczne właśnie w ściśle
kontrolowanej produkcji tych związków. Takie
Piśmiennictwo:
[1] Zhang M., et. al. Antitumor polysaccharides from mushrooms: a review
on their isolation process, structural characteristics and antitumor activity.
Trends in Food Science & Technology. 2007
[2] Malinowska E., et. al. Pozyskiwanie, budowa i działanie biologiczne
polisacharydów grzybowych na przykładzie soplówki jeżowatej (Hericium
erinaceum). Biotechnologia. 2008
[3] Chen J., et. al. Medicinal importance of fungal β-(1→3), (1→6)-glucans.
Mycological Research. 2007
[4] Augustίn J., et. al. Boczniak ostrygowaty (Pleurotus ostreatus) jako
źródło β-D-glukanów. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość. 2007
[5] Mantovani M. S., et. al. β-Glucans in promoting health: Prevention
against mutation and cancer. Mutation Research. 2008
[6] Mayell M. Maitake Extracts and Their Therapeutic Potential – A Review.
Alternative Medicine Review. 2001
[7] Sorgente N., et. al. Use of beta glucans for the treatment of
osteoporosis and other diseases of bone resorption. United States Patent.
2006
[8] Novak M. et. al. Glucans as Biological Response Modifiers. Endocrine,
Metabolic & Immune Disorders – Drug Targets. 2009
[9] Chan G. C. F. et. al. The effects of β-glucan on human immune and
cancer cells. Journal of Hematology & Oncology. 2009
[10] Zhang Y. et. al. Advances in lentinan: Isolation, structure, chain
conformation and bioactivities. Food Hydrocolloids. 2011
56
postępowanie byłoby pożądane głównie ze
względu na możliwość dopasowania procedury
w_zależności od ostatecznego przeznaczenia
produkowanej substancji (produkt farmaceutyczny, funkcjonalna żywność, itp.) [5].
Szeroko zbadaną grupą polisacharydów są
głównie β-glukany. Obecnie wiadomo jednak, że
również α-glukany wykazują potencjalnie korzystne aktywności biologiczne (np.: wywierają
efekty cytotoksyczne względem pewnych komórek). Mimo to stanowią one ciągle mało poznaną
grupę związków [17]. Pozwala to sądzić, iż
ewentualny potencjał glukanów nie został jeszcze do końca wyczerpany, a dalsze analizy poszerzą zakres ich praktycznego wykorzystania.
[11] Muramatsu D. et. al. β-Glucan Derived from Aureobasidium pullulans
Is Effective for the Prevention of Influenza in Mice. PLoS ONE. 2012
[12] Jung K. et. al. Antiviral Eﬀect of Saccharomyces cerevisiae b-glucan to
Swine Influenza Virus by Increased Production of Interferon-c and Nitric
Oxide. Journal of Veterinary Medicine Series B. 2004
[13] Markova N. et. al. Protective activity of Lentinan in experimental
tuberculosis. International Immunopharmacology. 2003
[14] Liang J. et. al. Enhanced clearance of a multiple antibiotic resistant
Staphylococcus aureus in rats treated with PGG-glucan is associated with
increased leukocyte counts and increased neutrophil oxidative burst
activity. International Journal of Immunopharmacology. 1998
[15] Wei D. et. al. Glucan stimulates human dermal fibroblast collagen
biosynthesis through a nuclear tactor-1 dependent mechanism. Wound
Repair And Regeneration. 2002
[16] Wei D. et. al. Activation of AP-1 and SP1 correlates with wound growth
factor gene expression in glucan-treated human fibroblasts. International
Immunopharmacology. 2002
[17] Wiater A., et. al. α-(1→3)-D-Glucans from fruiting bodies of selected
macromycetes fungi and the biological activity of their carboxymethylated
products. Biotechnol Lett. 2011
[18]
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/4/4e/Lentinula_edo
des_USDA.jpg/200px-Lentinula_edodes_USDA.jpg
Projekt Koła Naukowego
PRODUKCJA BIOETANOLU JAKO POTENCJALNY SPOSÓB
ZAGOSPODAROWANIA ODPADÓW LIGNINOCELULOZOWYCH
Z WYKORZYSTANIEM GRZYBÓW STRZĘPKOWYCH
Edyta Bańcyr, Kinga Chałupka, Dorota Lisiecka, M ichał Piegza
Studenckie Koło N aukowe Biotechnologów
Katedra Biotechnologii i M ikrobiologii Żywności
Wydział N auk o Żywności
Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu,
Opiekun Koła: dr inż. M ichała Piegza
Streszczenie: Wysokie koszty przetwarzania i utylizowania odpadów z równoczesnym
wzrostem świadomości proekologicznej skłaniają do poszukiwania nowych, alternatywnych
metod ich zagospodarowania bezpiecznych dla środowiska. Jedną z nich jest użycie metod
biotechnologicznych, bazujących na wykorzystaniu enzymów pochodzenia mikrobiologicznego. Użycie mikroorganizmów zdolnych do wydajnej biosyntezy frakcji celulaz i hemicelulaz pozwala na efektywną degradację trudno rozkładalnego surowca roślinnego, jakim
jest ligninoceluloza. W efekcie może to prowadzić do uzyskania surowca pośredniego zawierającego dużą ilość cukrów. Jeśli zostanie on poddany procesom fermentacji, uzyska się
produkty, takie jak np. bioetanol, które mogą stanowić alternatywne źródła energii.
Wstęp
Wykorzystanie metod biotechnologicznych, stanowiących integrację nauk inżynieryjnych
i przyrodniczych, otworzyło nowe możliwości
ekologicznej metody zagospodarowania kłopotliwych odpadów ligninocelulozowych. Problem
ochrony środowiska naturalnego wzbudza coraz
większe zainteresowanie ze strony instytucji
rządowych jak i przedsiębiorstw prywatnych.
Liczne dyrektywy Unii Europejskiej (m. in.
2001/77/WE, 2009/29/WE) nakazują ograniczenie emisji dwutlenku węgla i spalin. Perspektywa ogromnych kar finansowych, które będą
nakładane za przekroczenie limitów emisji gazów cieplarnianych zmusza do szukania nowych,
alternatywnych metod pozyskiwania energii.
Wykorzystanie produktów przetwarzania odpadowej biomasy roślinnej daje realną szansę na
zmniejszenie ilości szkodliwych zanieczyszczeń
przedostających się do środowiska, zaś niewykorzystane limity emisji gazów pozwolą na wzbogacenie się krajów rozwiniętych. Główny nacisk
kładziony jest na otrzymywanie bioetanolu, który ze względu na swoje właściwości stanowi nie
lada konkurencję dla tradycyjnego diesla. BioEtOH, obok wodoru, uchodzi za paliwo najbardziej przyjazne dla środowiska. Poprzez
stosowanie go jako dodatku do paliw, uzyskuje
się ograniczenie emisji dwutlenku węgla czy
związków toksycznych, jak benzen. Niewątpliwe
istotny jest fakt, że bioetanol produkowany jest
z surowców odnawialnych, przez co nie ma
obaw o nagły wzrost cen BioEtOH spowodowanego znacznym spadkiem ilości surowca do jego
produkcji. Badania wskazują, że produkty spalania paliwa roślinnego – woda i dwutlenek węgla
– w żaden sposób nie wpływają na wzrost zawartości CO2 w atmosferze. Wynika to z faktu,
że bioetanol produkowany jest z surowców roślinnych, które w wyniku fotosyntezy przekształcają atmosferyczny dwutlenek węgla
w cukry proste. Z tego względu utlenianie etanolu można uznać za jeden z elementów naturalnego obiegu węgla w przyrodzie.
W niniejszej pracy przedstawiono budowę kompleksu ligninocelulozy, mechaniczne, fizyczne
i chemiczne metody obróbki kompleksu oraz potencjalne możliwości wykorzystania produktów
degradacji enzymatycznej ligninocelulozy. Zaprezentowano projekt przykładowej linii technologicznej otrzymania bioetanolu z dowolnego
surowca, zawierającego w swoim składzie frakcję ligninocelulozy.
Budowa kompleksu ligninocelulozy
Biomasa roślinna powstaje na Ziemi w wyniku
przekształcenia energii słonecznej, w energię
wiązań chemicznych. W wyniku akumulacji
przez rośliny dwutlenku węgla i wody, przy
udziale energii słonecznej powstają cukry proste i tlen – uboczny produkt fotosyntezy. Światowa produkcja biomasy roślinnej sięga 2,5 - 5,5 x
1010 mln ton rocznie, z czego ponad połowę
stanowi biomasa odpadowa, zawierająca kompleks ligninocelulozy [51, 24]. W skład kompleksu ligninocelulozy wchodzą trzy składowe:
lignina, celuloza i hemiceluloza [4, 13, 40]. Połączone są one wiązaniami wodorowymi i kowalencyjnymi, które nadają im sprężystość
i elastyczność [39]. Celuloza stanowi ok. 40%
kompleksu ligninocelulozowego. Głównym
składnikiem budulcowym cząsteczki celulozy są
57
Bańcyr E. et al. „Produkcja bioetanolu z wykorzystaniem grzybów strzępkowych” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
reszty glukozy, połączone wiązaniami βDglikozydowymi. Ilość cząsteczek glukozy sięga od 250
do 10 000 [45, 47]. Kompleksy celulozy charakteryzowane są przez stopień polimeryzacji, który
może ulegać zmianie [13, 14, 29]. Na stopień
polimeryzacji wpływa ilość wiązań wodorowych,
powstających między cząsteczkami glukozy, nadających łańcuchowi twardość i sprężystość.
Struktury celulozy przybierają również formy
krystaliczne, zwane micelami. W strukturze wyróżnia się również mikroskopijne pory, które
umożliwiają działanie enzymom celulolitycznym.
Drugą frakcję budulcową ligninocelulozy stanowi hemiceluloza. Może ona stanowić nawet
40% s.m. drewna [40]. Zbudowana jest z podjednostek, które stanowią pentozy (D–ksyloza,
L–arabinoza), heksozy (D–glukoza, D–mannoza,
D–galaktoza) oraz kwasy uronowe – glukuronowy, galakturonowy [3, 45, 46, 52]. Podjednostki
połączone są za pośrednictwem wiązań
β–1,4–glikozydowych i β1,3glikozydowych. Hemiceluloza nie tworzy struktur krystalicznych,
może za to przybierać formy rozgałęzione.
Ostatnim elementem składowym jest lignina
(drzewnik), która stanowi ok. 25% [53, 54, 55].
Jednostkami budulcowymi są pochodne alkoholi
aromatycznych jak kumarylowy, synapinowy, koniferylowy [2, 3, 17, 42, 43].
Źródeł ligninocelulozy można doszukiwać się
niemal w każdej branży przemysłu. Surowce
możemy pogrupować na: odpady rolne (słoma,
kaczany kukurydziane, pestki, korzenie, plewy,
pozostałości przerobu owoców), odpady drewnopochodne (trociny, wióry, kora, odpady z przemysłu papierniczego), odpady komunalne
(gazety, papier, nieużyteczne meble) [36, 42].
O ich ogromnej wartości decyduje fakt, że wytworzone są z surowców odnawialnych, nie stanowiących zagrożenia dla środowiska
naturalnego. Uwzględniając wartość biotechnologiczną surowca należy uwzględnić procentową
zawartość poszczególnych składników budulcowych.
Tabela 1 . Zawartość ligninocelulozy w powszechnych pozostałościach i odpadach rolniczych [24, 31 ].
Metody obróbki biomasy odpadowej
Do najpopularniejszych metod obróbki mechanicznej zalicza się mielenie i eksplozję parową.
Mielenie to najstarsza ze stosowanych metod
58
obróbki. Prowadzone jest najczęściej przy użyciu młynów, gniotowników i rębarek. Głównym
celem jest rozdrobnienie surowca poprzez
zgniatanie, tarcie i użycie sił ścinających. Efektem procesów mielenia, jest zmniejszenie krystaliczności i obniżenie stopnia polimeryzacji
celulozy [32, 47, 59]. Dzięki temu zwiększa się
powierzchnia, na którą mogą działać enzymy
celulolityczne. Stosując metodę mielenia należy
zwrócić uwagę na surowiec, z jakim mamy do
czynienia. W przypadku surowców pochodzących z przemysłu drzewnego zastosowanie znajdują młyny młotkowe (pionowe, poziome
i z młotkami umocowanymi przegubowo),
w przypadku słomy czy kaczanów kukurydzianych wystarczą zwykłe młyny bijakowe. Metodą
równie powszechną co mielenie jest eksplozja
parowa, która również zaliczana jest do metod
obróbki mechanicznej. Rozdrobniony materiał
ligninocelulozowy poddawany jest działaniu pary wodnej, przy jednoczesnym zastosowaniu wysokiego ciśnienia. Efektem współdziałania tych
dwóch składowych jest dekompresja wybuchowa z jednoczesnym rozluźnieniem struktury komórkowej biomasy. Dochodzi wtedy do
zmniejszenia wielkości cząsteczek, a tym samym do intensywnej degradacji hemicelulozy
i celulozy. Eksplozja parowa jest jednym z bardziej atrakcyjnych procesów wstępnej obróbki
ze względu na to, że nie generuje niebezpiecznych substancji chemicznych, nie ingeruje
w środowisko, nie powoduje jego zanieczyszczenia oraz nie wymaga dużych nakładów energetycznych. Negatywnym aspektem zastosowania
eksplozji parowej jest możliwość powstawania
lotnych produktów ubocznych, które mogą
wpływać na zahamowanie dalszych procesów
hydrolizy i fermentacji [2, 10, 28, 59].
Metody chemiczne są stosowane rzadziej, ze
względu na wyższe ryzyko zanieczyszczenia środowiska. Niebezpieczeństwo przedostania się
do środowiska groźnych, trujących substancji
stawia metody chemiczne w nieco niekorzystnym świetle. Wśród metod chemicznych wyróżnia się hydrolizę kwasową i zasadową, oraz
mniej popularną autohydrolizę. Hydroliza kwasowa związana jest z użyciem kwasu siarkowego, azotowego lub solnego. Użycie silnych
kwasów umożliwia usuwanie hemicelulozy
i zwiększenie podatności celulozy na działanie
enzymów. Aparatura stosowana w procesie
z użyciem silnego kwasu, musi spełniać szereg
dodatkowych kryteriów jak wysoka odporność
na korozję, materiał, z którego wykonane jest
urządzenie, nie powinien reagować z używanymi w procesie związkami chemicznymi. Z tego
względu koszty hydrolizy kwasowej rosną powodując spadek zainteresowania tą metodą [1, 17,
65, 66]. Hydroliza zasadowa jest chemiczną metodą obróbki, która zamiast silnych kwasów
opiera się na wykorzystaniu związków alkalicznych (głównie wodorotlenku sodu, wapnia czy
amoniaku). W czasie procesu obserwuje się
zmydlanie i solwatację, w wyniku których następuje „puchnięcie” biomasy [20, 21, 22, 32].
Metoda pozwala na stosunkowo efektywne usunięcie ligniny i hemicelulozy, dzięki czemu
zwiększa się dostępność biomasy dla enzymów.
Hydroliza zasadowa, podobnie jak metoda z użyciem kwasów, jest niebezpieczna dla środowiska
i stosunkowo droga. Autohydroliza to metoda
chemiczna, przeprowadzana w wysokich temperaturach (pomiędzy 200o a 230o C). Zastosowanie wysokiej temperatury pozwala na usunięcie
dużej części hemicelulozy, 35–60% ligniny, a także 4–20% celulozy [38, 44]. Zaletami tej metody
są większa wydajność cukrów redukujących
otrzymanych z hemiceluloz oraz większa podatność celulozy na enzymatyczną hydrolizę. Jednak w wyniku degradacji cukrów prostych
powstają niepożądane produkty, które mogą
wpływać negatywnie na późniejsze procesy fermentacji [28]. Do odmian metod chemicznych
zalicza się metody termochemiczne. Metody te
łączą w sobie wykorzystanie wysokiej temperatury, ciśnienia oraz silnych utleniaczy, przez co
biomasa zostaje przekształcona w paliwo gazowe. Jako czynniki zgazowujące stosuje się tlen,
powietrze atmosferyczne, dwutlenek węgla, parę wodną i mieszaniny gazowe [56, 59, 65, 66].
Najpopularniejszą metodą termochemiczną jest
tzw. zagazowanie biomasy [57].
Ze względu na występowanie wielu negatywnych aspektów związanych z użyciem metod
chemicznych, które łączą się z zagrożeniem dla
środowiska naturalnego, zaczęto poszukiwać
metod alternatywnych, które okażą się tańsze
i bezpieczniejsze. Coraz większego znaczenia
nabierają metody enzymatyczne, stanowiące alternatywę dla potencjalnie szkodliwych dla środowiska metod obróbki chemicznej. Metody te
opierają się na wykorzystaniu enzymów pochodzenia mikrobiologicznego [4, 8, 9], które degradują składniki kompleksu ligninocelulozy.
W wyniku procesu z ich wykorzystaniem otrzymywana jest mieszanina cukrów pięciowęglowych i sześciowęglowych. Procesy hydrolizy
enzymatycznej są względnie powolne, ponadto
prowadzone są w stosunkowo łagodnych warunkach: 50oC, pH=4,5-5,0. W celu przyspieszenia
przebiegu reakcji, przed przystąpieniem do procesu z użyciem enzymów surowiec poddaje się
działaniu metod mechanicznych [12, 21, 25, 37,
39]. Najważniejszymi grupami enzymów stosowanych w tych procesach są celulazy i hemicelulazy. Produktami działania celulaz są cukry
redukujące (glukoza). Ze względu na stosunkowo niskie tempo hydrolizy enzymatycznej, korzystne jest stosowanie mieszaniny enzymów,
dzięki czemu zwiększa się tempo degradacji surowca [16, 27, 35, 49, 63]. Najczęściej stosowane endoglukanazy (1,4–D–glukanohydrolazy)
powodują hydrolizę wiązań znajdujących się wewnątrz łańcucha celulozy. Użycie celobiohydrolazy przyczynia się do degradacji celulozy od jej
końca, dzięki czemu powstają cząsteczki celobiozy. Użycie β–glukozydazy umożliwia degradację oligosacharydów bezpośrednio do cząsteczki
glukozy. Głównymi mikroorganizmami syntetyzującymi celulazy są bakterie jak Cellulomonas,
Bacillus polomyxa oraz grzyby strzępkowe jak
Trichoderma czy Aspergillus [39, 43, 44, 56, 62].
Celulazy charakteryzują się specyficznością
względem pH i temperatury.
Tabela 2. Porównanie aktywności (μmol ∙ min-1 mg-1 ) enzymów celulolitycznych w różnych warunkach [24, 40].
Hemicelulazy to grupa enzymów, intensywnie
degradująca frakcję hemicelulozy [13, 19, 23,
26]. Najczęściej wykorzystywane hemicelulozy
to: endoksylanaza (1,4–β–D–ksylan, ksylanohydrolaza) atakująca główny łańcuch ksylanu, endomannaza
(1,4–β–D–mannan,
mannanohydrolaza) uwalniająca β–1,4–manno–oligomery, 1,4–β–D–ksylozydaza hydrolizu-jąca ksylooligosacharydy i ksylobiozę do
D-ksylozy. Ponadto, istotną rolę odgrywają:
α–D–glukuronidaza, α–L–arabinofuranozydaza
i α–L–arabinoza, które ze względu na szeroką
specyficzność substratową, mogą hydrolizować
wiązania O-2, O-3 i O-5 glikozydowe. Producentami hemiceluloz są głównie bakterie i grzyby
strzępkowe [11, 27, 30, 60]. Aktywność enzymu
ma zróżnicowaną zależność od pH i temperatury w zależności jego pochodzenia (bakteryjne
czy grzybowe).
Tabela 3. Porównanie aktywności (μmol.min-1 mg-1 ) hemicelulaz w różnych warunkach [24, 45, 61 ].
Potencjalne możliwości zagospodarowania
biomasy odpadowej w kierunku bioprzemysłu
Istnieje wiele metod zagospodarowania biomasy
odpadowej. Ostatnie doniesienia naukowe dowodzą, że najistotniejszą metodą z punktu widzenia ekonomicznego jest produkcja bioetanolu
[15, 29, 50].
Na proces wytworzenia bioetanolu z surowca ligninocelulozowego składa się wiele operacji jednostkowych. Najważniejszą z nich jest dokładne
59
oszacowanie zawartości poszczególnych frakcji
ligninocelulozy, a tym samym dobranie jak najwydajniejszej metody wstępnej obróbki. Wśród
metod obróbki surowców ligninocelulozowych
można wyróżnić kilka składowych: metody mechaniczne, chemiczne, termochemiczne i enzymatyczne. Dobór odpowiedniej metody jest
najistotniejszym etapem przygotowania surowca
do dalszego przemysłowego wykorzystania. Nieodpowiednio dobrane parametry technologiczne,
mogą niekorzystnie wpłynąć na właściwości surowca, a tym samym – na spadek ilości interesującego produktu. Z tego względu bardzo
znaczące staje się przeprowadzenie szeregu symulacji i analiz, aby dobrać jak najlepsze parametry, które pozwolą uzyskać zadowalające
wyniki w skali przemysłowej.
Istnieje wiele potencjalnych aspektów zagospodarowania surowców ligninocelulozowych – począwszy od wykorzystania jej na cele paszowe
(produkcja wysokostrawnego białka), wykorzystanie w procesach grzewczych czy w końcu
produkcja bioetanolu. Proces otrzymania bioetanolu z surowca ligninocelulozowego obejmuje
kilka etapów:
zmami chorobotwórczymi. Dzięki produkcji licznych enzymów znajdują one zastosowane
w przemyśle paszowym, spożywczym, piwowarstwie, przemyśle winiarskim, produkcji bioetanolu, w przemyśle tekstylnym czy papierniczym
[5, 18, 19, 23]. Trichoderma zdolne są do produkcji enzymów takich jak: celulazy, ksylanazy,
pektynazy, β–1,3–glukanazy, chitynazy i proteazy
[6, 17, 40, 59, 62].
a) wstępną obróbkę surowca
b) hydrolizę enzymatyczną przy wykorzystaniu
enzymów syntetyzowanych przez Trichoderma
c) fermentację etanolową
d) destylację i rektyfikację
Otrzymanie bioetanolu z surowca ligninocelulozowego obejmuje kilkanaście procesów jednostkowych, których zoptymalizowanie daje szansę
na uzyskanie znacznych ilości produktu finalnego. Istnieje kilka kluczowych momentów, od których zależy powodzenie całego procesu
produkcji. Przede wszystkim należy dobrać odpowiednią metodę przygotowania surowca, która nie spowoduje powstania produktów
ubocznych, mogących negatywnie wpływać na
proces późniejszej fermentacji etanolowej. Surowiec poddawany jest jednej z fizycznych metod
obróbki, najczęściej mieleniu przy użyciu młynów młotkowych lub bijakowych [7, 9, 13, 20].
Istotną rolę odgrywa również odpowiednio zoptymalizowana hodowla grzybów strzępkowych.
Zapewnienie odpowiednich parametrów procesu
pozwoli na uzyskanie znacznych ilości enzymów,
które będą wykorzystane w etapie hydrolizy enzymatycznej surowca. Ostatnie lata potwierdziły
wykorzystanie grzybów strzępkowych z rodzaju
Trichoderma jako jednych z najefektywniejszych
producentów enzymów stosowanych w procesach degradacji surowców ligninocelulozowych.
Grzyby są heterotroficznymi organizmami eukariotycznymi o nitkowatej strukturze [3, 4, 33,
34].
Grzyby Trichoderma są znane jako mikroorganizmy wspomagające wzrost i chroniące rośliny
przed czynnikami stresowymi, głównie organi-
60
Rys. 1 , 2. Trichoderma harzanium. Powiększenie 1 5 x (Rys.
1 ) i 0x (Rys. 2)
Źródło: Zbiory Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu
Najpopularniejszą metodą hodowli grzybów
strzępkowych jest hodowla okresowa polegająca na załadowaniu pożywki do fermentora, wysterylizowaniu pożywki wraz z fermentorem,
zaszczepieniu materiału posiewowego i prowadzeniu namnażania mikroorganizmów. Hodowla
taka to system zamknięty, mikroorganizmy wyrastają na określonej, ograniczonej ilości pożywki, po jej wyczerpaniu hodowla się kończy,
ponieważ w podłożu nie ma czynników niezbędnych do wzrostu mikroorganizmów (kończy się
źródło węgla, azotu i mikroelementów) [19, 41].
Zoptymalizowana hodowla okresowa grzybów z
rodzaju Trichoderma
Rys. 3. Wykres zmian stężenia substratu i biomasy w czasie
[51 , 62, 63]. X – stężenie biomasy; S – stężenie substratu; I –
lag-faza; II – faza przyspieszonego wzrostu; III – faza logarytmiczna; IV – faza spowalniania wzrostu; V – faza stacjonarna;
VI –zamieranie komórek
Główną fazą wzrostu grzybów strzępkowych jest
faza liniowa. Kłopotliwe w hodowli grzybów
strzępkowych może okazać się tworzenie form
typu „pelets” oraz zarastanie przewodów i mieszadeł używanych bioreaktorów. Problematyczna
bywa również potencjalna szkodliwość dla ludzi
ze względu na tworzenie mykotoksyn. Mimo to,
grzyby strzępkowe w porównaniu do drożdży
czy bakterii stanowią lepsze źródło enzymów,
ponieważ w głównej fazie wzrostu produkują
znacznie więcej substratu. Ta cecha zdecydowanie wpływa na wykorzystanie grzybów strzępkowych jako źródła enzymów stosowanych
w degradacji ligninocelulozy. Grzyby strzępkowe
są także łatwiejsze do wydzielenia z płynu pohodowlanego niż drożdże i bakterie. Grzyby z rodzaju Trichoderma nie wytwarzają toksyn, mogą
być wykorzystywane do produkcji enzymów litycznych, nie stwarzając przy tym zagrożenia
dla środowiska i ludzi.
Proces namnożenia biomasy grzybowej składa
się z wielu etapów, obejmujących aktywację zliofilizowanych zarodników, poprzez dodatek wody.
Kolejnym etapem jest propagacja biomasy w odpowiednio dobranym bioreaktorze propagacyjnym. Proces prowadzony jest w temperaturze
25oC przez ok. 24 h. Namnożona biomasa przepompowywana jest do kolejnego bioreaktora,
gdzie na podłożu złożonym z wysłodków buraczanych prowadzony jest dalszy etap namnażania
biomasy.
Kolejnymi
operacjami
jednostkowymi są: wirowanie płynu pohodowlanego ( przy założeniu, że biomasa zawracana
jest do bioreaktora) oraz filtracja supernatantu
mająca na celu ostateczne usunięcie grzybni
Rys. 4. Schemat blokowy procesu technologicznego hodowli i
separacji biomasy Trichoderma harzanium.
z płynu pohodowlanego. Oczyszczony supernatant, ze względu na wysoką zawartość enzymów,
jest kierowany do etapu hydrolizy enzymatycznej rozdrobnionego surowca ligninocelulozowego.
Rozdrobniona biomasa roślinna poddawana jest
ekspansji parowej, czyli kolejnej metodzie obróbki fizycznej. Dzięki temu następuje degradacja hemicelulozy i ligniny, a tym samym
zmniejszenie cząsteczek surowca, co umożliwi
działanie enzymom, stosowanym w kolejnym
etapie. Do procesu hydrolizy enzymatycznej, wykorzystywane są enzymy pochodzące z hodowli
okresowej grzybów z rodzaju Trichoderma. Produkty działania enzymów, tworzące mieszaninę
cukrów pięcio- i sześciowęglowych poddawane
są zatężaniu w celu oddzielenia wody. Pozostałość przekazywana jest do dużego tankofermentora, do którego wpompowywane będą również
drożdże Saccharomyces cerevisiae, które przeprowadzają procesy fermentacji alkoholowej.
Drożdże te zaliczane są do podgromady workowców, klasa Ascomycetes (drożdże właściwe).
61
tolerancją na zmiany pH i wysokie stężenie alkoholu [5, 9, 19, 22].
W przypadku procesu produkcji bioetanolu
drożdże wyprowadzane są od etapu czystej kultury poprzez kolejne stadia propagacyjne. Zawracanie biomasy drożdży z III stadium
propagacyjnego pozwala na prowadzenie procesu ciągłego, a ponadto umożliwia zwiększenie
wydajności otrzymywanego etanolu. Po dwudobowej fermentacji zacier poddawany jest destylacji, a następnie rektyfikacji, w celu usunięcia
przedgonów i niedogonów.
Podsumowanie
Rys. 5. Schemat linii otrzymywania bioetanolu.
Znajdują one niezwykle szerokie zastosowanie
[11], zaś największe wykorzystanie znalazły
w gorzelnictwie i piekarstwie. Saccharomyces
cerevisiae klasyfikowane są jako fakultatywne
anaeroby. W przypadku braku tlenu w środowisku mogą przeprowadzać żądane procesy [57,
59, 60]. Ze względu na uzdolnienia do produkcji
etanolu, znalazły powszechne wykorzystanie
w przemyśle spożywczym. Drożdże te mogą się
rozmnażać wegetatywnie przez pączkowanie lub
generatywnie poprzez krzyżowanie płciowe komórek [62, 63]. Komórki drożdży S. cerevisiae
mają kształt owalny i najczęściej występują pojedynczo. Tradycyjne drożdże Saccharomyces fermentują jedynie glukozę, z tego względu
uwzględnia się zastosowanie modyfikacji genetycznych, które umożliwią efektywną fermentację również cukrów pięciowęglowych. Jak
wskazują Balat i wsp. [2, 3], wykorzystanie modyfikowanych szczepów Saccharomyces może
przynieść znaczne korzyści ekonomiczne. Drożdże te naturalnie charakteryzują się wysoką odpornością na znaczne stężenie alkoholu
w środowisku. Przeniesienie genów kodujących
możliwość fermentacji pentoz (np. z Klebsiella,
Escherichia coli) pozwoli na uzyskanie wyższych
wydajności. Zastosowanie w czasie fermentacji
mieszanych kultur S. cerevisiae i Zymomonas
mobilis pozwala na podniesienie wydajności procesu o nawet 5%. Mikroorganizmy wykorzystywane w trakcie procesu fermentacji powinny
charakteryzować się przede wszystkim wysoką
62
Dziesięciolecia silnej dewastacji środowiska naturalnego odcisnęły znaczne piętno na stanie
wód, gleb czy powietrza. Zwiększająca się liczba ludności na świecie, powiększanie areałów
pól uprawnych i postępująca urbanizacja przyczyniają się do wzrostu ilości niewykorzystanych odpadów. Perspektywa zagospodarowania
surowców ligninocelulozowych jest niezwykle
kusząca, ze względu na możliwość otrzymywania znacznych ilości cennych produktów. Jest to
niezwykle istotny aspekt zwłaszcza dla gospodarki narodowej, gdyż rosnące ceny paliw kopalnych powodują wzrost cen wszystkich
artykułów dostępnych na rynku. Szczególną rolę w procesach przerobu surowca ligninocelulozwego
zaczynają
odgrywać
metody
biotechnologiczne, które poprzez połączenie
metod inżynieryjnych i biologicznych umożliwiają efektywną redukcję kosztów przerobu surowca. Produkcja bioetanolu z surowców
odpadowych pozwoli na zahamowanie gwałtownego wzrostu cen, a tym samym – polepszenie
nastrojów społecznych. Co ważne, bioetanol pochodzący z surowców ligninocelulozowych nie
stwarza zagrożenia dla środowiska naturalnego,
gdyż wykazuje znacznie niższą emisję dwutlenku węgla w stosunku do tradycyjnych paliw kopalnych [8, 13]. Potentatami światowymi
w produkcji bioetanolu są USA i Brazylia, gdzie
początki procesu produkcji BioEtOH sięgają
pierwszych lat XX wieku. Obecnie wiele firm
motoryzacyjnych próbuje iść za przykładem firm
brazylijskich, czyniąc próby dodawania coraz
większych frakcji bioetanolu do paliwa. Jak na
razie koszty wyprodukowania samochodu mogącego wykorzystywać jako źródło energii tylko
bioetanol, są wysokie. Użycie surowców odpadowych pozwala nie tylko na zmniejszenie zanieczyszczenia środowiska, ale również na
znaczne wpływy do budżetu państwa. Już na początku XX wieku Henry Ford zwracał uwagę na
możliwość wykorzystania „paliwa pochodzącego
z roślin”. Warto zastanowić się nad optymalizacją procesów produkcji etanolu z biomasy roślinnej, gdyż nie wykluczone jest, że negatywne
nastroje na Bliskim Wschodzie prędzej czy później
wymuszą szybkie wprowadzenie technologii pozyskiwania bioetanolu z surowców odnawialnych.
Piśmiennictwo:
[1]Aiba S., Humphrey A., Willis, N.F.1977. Biochemical Engineering. 2ªEd.
Academic Press, Nueva York
[2]Balat M., Balat H. 2009. Recent trends in global production and utilization of bio-etahnol fuel. Applied Energy 86 (2009), 2273-2282.
[3].Balat M., Balat H., Oz C. 2008. Progress in bioethanol processing. Progress in Energy and Combustion science 34 (2008); 551-573.
[4].Bednarski W., Reps A. 2001. Biotechnologia żywności, WNT, Warszawa
[5].Bieszk H., 2010 Urządzenia do realizacji procesów mechanicznych
w technologii chemicznej, Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej
[6].Bilitewski B., Hardtle G., Marek K. 2006. Podręcznik gospodarki odpadami. Teoria i praktyka. Wydawnictwo „Seidel- Przywecki” Sp. zo.o. Warszawa, 268-276, 356-358.
[7].Burczyk B. 2009. Biorafinerie ile w nich chemii? Wiadomości chemiczne. Wydział Chemiczny Politechniki Wrocławskiej, 739-776.
[8].Calvalheiro F., Duarte L.C., Migrio F.M. 2008. Hemicellulose biorefineries: a review on biomass pretreatments. Journal of Scientific & Industrial
Research, 67 (2008), 849-864.
[9].Chandel Kumar A., Es Ch., Rudravaram R., Narasu M.L., Rao L.V., Ravindra P. 2007. Economics and environmental impact of bioethanol production technologies: an appraisal.Biotechnology and Molecular Biology
Review Vol.2 (1), 14-32
[10].Chen H., Qiu W. 2010. Key technologies for bioethanol production
from lignocellulose. Biotechnology Advances 28, 556-562.
[11].Chmiel A. 1998. Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN, Warszawa
[12].Ciechanowicz W., Bartoszczuk P. 2003. Procesy Termicznej Konwersji
Biomasy. Warszawa, 245-249.
[13].De Ruyck 1996. Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical
and molecular perspectivites.Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology, Vol.35 Number 5
[14].De Ruyck, Allard. 2005.Biofuels from lignocellulosic materials in the
Norwegian context 2010. Technology, potential costs. Norwegian University of Science and Technology 2005
[15].Dombek K.M., Ingram L.O. 1987. Ethanol production during batch fermentation with S.cerevisiae : changes in glycolytic enzymes and internal
pH. Apply Environment and Microbiology 53(6), 1286-1291
[16].Fiedurek J. 2000. Procesy jednostkowe w biotechnologii. Ćwiczenia,
Wydawnictwo UMCS, Lublin
[17].Foyle T., Jennings L., Mulcahy P. 2007. Compositional analysis of lignocellulosic materials: Evaluation of methods used for sugar analysis of waste paper and straw. Bioresource technology 98 (2007); 3026-3036.
[18].Galante Y. M., De Conti A., Monteverdi R., 1998 a. Aplication of Trochoderma enzymes in the textile industry. W: Trichoderma & Glicoladium,
vol. 2. Ed.: G. E. Harman, CP. Kubicek, Taylor & Francis, Padstow: 311 – 326
[19].Galante Y. M., De Conti A., Monteverdi R., 1998 b. Aplication of Trochoderma enzymes in the textile industry. W: Trichoderma & Glicoladium,
vol. 2. Ed.: G. E. Harman, CP. Kubicek, Taylor & Francis, Padstow: 327 – 342
[20].Hahn-Hagerdal B., Galbe M., Gorwa- Grausland M.F. 2006. Bio-ethanol
– the fuel of tomorrow from the residues of today. Trends in Biotechnology
Vol. 24, No. 12, 549-566.
[21].Hamelinck C.N., Van Hooijdonk G., Faaij A.2004 Ethanol from lignocellulosic biomass: techno-economic performance in short-, middle and long
term. Biomass and bioenergy 28 (2004), 384-410.
[22].Hendriks A.T.W.M., Zeeman G.2009. Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology 100, 10-18.
[23].Heymann J., Böttcher P 1997.: Textile Filtermedien-Beschaffenheit und
Eingeschaften. Filtrieren und Separieren 11 (1997) 43-51
[24].Howard R.L., Abotsi E. 2003. Lignocellulose biotechnology: issues of
bioconversion and enzyme production. African Journal 2 (12), 602-619.
http://www.dnv.pl/Binaries/Handel%20emisjami_tcm144-294595.pdf
[25].Jakubiak M., Kordylewski W. 2008. Pelety podstawowym biopaliwem
dla energetyki. Archiwum Spalania 8, 1-12.
[26].Kadar Z., Maltha S.F., Szengyel Z., Reczey K., De Laat W. Ethanol fermentation of various pretreatmed and hydrolyzed substrates at low initial
pH. Applied Biochemistry and Biotechnology Vol. 136-140 (2007).
[27].Kim D.W., Yang J.H., Jeong Y.K. 1998. Adsorption of cellulose from Trichoderma viridae on microcrystalline cellulose. Applied Microbiology and
Biotechnology 28: 148-154.
[28].Knauf M., Moniruzzaman M. 2004. International Sugar Journal Vol. 106
No. 1263.
[29].Kumar R., Singh S., Singh O.2008. Bioceonversion of lignocellulosic
biomass: biochemical and molecular perspectives. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 35 (2008); 377-391.
[30]Leśniak W., Biotechnologia żywności. Procesy fermentacji i biosyntezy.
2002. Wydawnictwo Akademii Ekonomicznej im. Oskara Langego we Wrocławiu.
[31]Lewicki P. 1990, Inżynieria procesowa i aparatura przemysłu spożywczego, Tom 1 Procesy mechaniczne, WNT, Warszawa
[32]Margeot A., Hahn-Hagerdal B., Edlund M., Slade R., Monot F. 2009.
New improvements for ligninocellulosic ethanol. Current Opinionin Biotechnology: 20 (2009), 371-380.
[33]Martinez A., Speranza M, Ruiz- Duenas F., Ferreira P, Camarero S., Guillen F., Martinez M., Gutierrez A., Del Rio J. 2005. Biodegradation of lignocellulosics: microbial, chemical and enzymatic aspects of the fungal attack of
lignin. International Microbiology 8 (3); 195-204.
[34].Matsushika A., Inoue H., Kodaki T., Sawayama S. 2009. Etanol production from xylose in engineeres S.cervisiae strains: current state and pesr-
pectivites. Applied Miciobiology and Bioetchnology (2009): 84: 37-53
[35].Mosier M., Wyman Ch., Dale B., Elander R., Lee Y.Y., Holtzapple M., Ladisch M. 2005. Features of promising for pretreatment of lignocellulosic
biomass. Bioresource Technology 96, 673-686.
[36].Nakata T., Miyafuji H., Saka S. Bioethanol from cellulose with supercritical water treatment followed by enzmatic hydrolysis. Applied Microbiology and Biotechnology Vol. 129-136 (2006),
[37].Nicklin J., Graeme – Cook K., Killington R. 2007. Krótkie wykłady. Mikrobiologia, PWN, Warszawa
[38].Oscs R., Valenzuela S., Freer J., Bacza J., Rodriguez J. 2006. Evaluation
of fungal endophytes for ligninocellulytic enzyme productionand wood
biodegradation. International biodeteriotaion & biodegradation: 57 (2006),
129-135.
[39].Palonen H. 2004. Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocelluloses. VTT Publications 520, 11-19.
[40].Perez, M.Perlack R.D., Wright L., Turhollow A., Graham R., Stokes B.,
Erbach D. 2005. Biomass and feedstock for a bioenergy and bioproduct industry. Oak Ridge Natl.Lab.No. 66, 500-522
[41].Rani P., Sharma S., Garg F.C., Raj K., Wati L. 2010. Ethanol production
from potato flour by Saccharomyces cerevisiae. Indian Journal of Science
and Technology, Vol. 3, No 7, 733-736
[42].Rybak W. 2006. Spalanie i współpalanie biopaliw stałych. Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej. Wrocław, 61-74, 97-104, 141-166.
[43].Sanchez 2009. Lignocellulosic residues: biodegradation and bioconversion by fungi. Biotechnology Adv. 2009. 185-194
[44].Selecki A., Gradoń L. 1985. Podstawowe procesy przemysłu chemicznego, WNT, Warszawa
[45].Shallom D., Shoham Y. Microbial hemicellulases. 2003. Current Opinion in Microbiolgy, 6 (2003), 219-228.
[46].Shoham Y. 2003. Microbial hemicellulases. Curr. Opin. Microbiol.
6:219-228
Silverstein R.A., Chen Y., Sharma- Shivappa R.R., Boyetle M.D., Osborne J.
2007. A comparison of chemical pretreatment methods for improving saccharification of cotton stalks. Bioresource Technology 98, 3000-3011.
[47].Sukumaran R., Singhania R.R., Pandey A. 2005. Microbial cellulasesproduction, applications and challenges. Journal of Scientific & Industrial
Research, 64 (2005), 832-844.
[48] Sun Y., Cheng J. 2002. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: A review. Bioresource Technology 83, 1-11.
[49]Szczech M. Grzyby Trichoderma - dlaczego warto się nimi zainteresować? Instytut Warzywnictwa im. Emila Chroboczka w Skierniewicach,
http://trichoderma.iwarz.pl/?d=informacje_o_trichoderma&id=117
[50]Szczodrak J., Fedurek J. 1993. Możliwości wykorzystania surowców ligninocelulozowych
w mikrobiologicznej produkcji bioetanolu. Biotechnologia 3 (22), 145-164.
[51]Szewczyk K., Technologia biochemiczna. 1996. Oficyna wydawnicza
Politechniki Warszawskiej.
[52]Taherzadeh M.J., Karimi K. 2008. Pretreatment of Lignocellulosic Wastes to Improve Ethanol and Biogas Production: A Review. Int. J. Mol. Sci.,
1621-1651.
[53]Targoński Z. 1996. Biokonwersja materiałów ligninocelulozowych. Biotechnologia 3 (34), 116-130.
[54]Targoński Z. 1996. Problemy biokonwersji materiałów ligninocelulozowych do alkoholi. Biotechnologia 3 (34), 137-142.
[55]Targoński Z., Rogalski J., Lechowicz A. 1992. Biologiczna transfromacja
ligninocelulozy jako potencjalne źródło surowców żywnościowych . Biotechnologia 2 (17), 56-65.
[56]Tolan J.S. Fuel- oriented Biorafineries. Biorafineries- Industrial Processes for producing Ethanol from Cellulosic Biomass. Viley Online Libray Vol.
1 (2006), 193-208.
[57]Van Wyk. J.; Mohulatsi M. 2003. biodegradation of Waste Cellulose. Journal of Polymers and the Environment, Vol. 11. No.1, January 2003
[58]Viola E., Cardinale M., Santarcangelo R., Villone A., Zimbardi F. 2008.
Ethanol from eel grass via steam explosion and enzymatic hydrolysis. Biomass and bioenergy 32 (2008); 613-618.
[59]Vucurović V.M., Razmovski R.N, Popov S.D. 2009. Ethanol production
using S.cerevisiae cells immbolised on corn steam ground tissiue. Proceedings of National Academy of Science Novi Sad, No 116, 315-322
[60]Weil J., Westgate P., Kohlman K., Ladish M. 1994. Cellulose pretreatment of lignocellulosic substrate. Enzyme and Microbial Tehcnology Elsevier 16 (1994), 1002-1004.
[61]Wiegert T., Ripperger S.: Das Verhalten von Geweben und Vilesen bei
der Kuchenfiltration. Filtrieren und Separieren 11 (1997), 11-15
[62]Wojtatowicz M., Stempniewicz R., Żarowska B. 2009. Mikrobiologia
żywności, Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, Wrocław
[63]Wojtatowicz M., Stempniewicz R., Żarowska B., Rymowicz W., Robak
M. 2008. Mikrobiologia ogólna, Wydawnictwo Uniwersytetu Przyrodniczego
we Wrocławiu, Wrocław
[64]Zakrzewski R. 2001. Niektóre aspekty termicznego rozkładu drewna
i wybranych surowców ligninocelulozowych. Roczniki Akademii Rolniczej
w Poznaniu. Rozprawy Naukowe, 7-23.
[65]Zaldivar J., Nielsen J., Olsson L. 2001. Fuel ethanol production from lignocellulose: a challenge for metabolic engineering and process integration. Applied Microbiology and Biotechnology 56 (2001); 17-34.
63
Projekt Koła Naukowego
MYGENerator - NARZĘDZIE DO ZAUTOMATYZOWANEGO I
UPROSZCZONEGO KORZYSTANIA Z PAKIETU GROMACS
Jan M ajta, M aciej Bąk, Rościsław Krutyhołowa
Koło N aukowe Studentów Biotechnologii „ M ygen”
Wydział Biochemii Biofizyki i Biotechnologii
Opiekun Koła: dr hab. Joanna Bereta, prof. UJ
Streszczenie: W obecnych czasach wykorzystywanie informatyki staje się ważną
umiejętnością przydatną do pracy w zakresie biologii molekularnej. Niestety wiele technik
informatycznych pozostaje nadal dostępnych jedynie dla specjalistów w tej dziedzinie.
Jedną z takich metod jest dynamika molekularna (MD). Jest to kompleksowa symulacja
ruchów wszystkich atomów w układzie. Metoda ta jest powszechnie wykorzystywana
wszędzie tam, gdzie podejście laboratoryjne nie jest w stanie dostarczyć odpowiednich
informacji. Dynamika molekularna dzięki swoim niezaprzeczalnym zaletom jest
szczególnie popularna w badaniach strukturalnych. W przeciwieństwie do technik
eksperymentalnych daje możliwość wglądu w oddziaływania w skali atomowej. Dzięki
temu uzyskać można zupełnie inny rodzaj informacji niż podczas pracy doświadczalnej. W
niniejszej pracy zaprezentowano narzędzie upraszczające i automatyzujące proces
generowania dynamiki molekularnej przy użyciu pakietu GROMACS.
Wstęp
Przy prowadzeniu badań metodami eksperymentalnymi często natrafia się na problemy, których rozwiązanie sprawia ogromne trudności.
Jednym z takich zagadnień mogą być problemy
natury strukturalnej, do rozwiązania których coraz częściej stosuje się metody in silico. Coraz
popularniejszą metodą prowadzenia badań strukturalnych są symulacje dynamiki molekularnej
(MD, ang. molecular dynamics). Polegają one na
rozwiązywaniu równań ruchu Newtona, dzięki
czemu można przewidzieć zachowania poszczególnych atomów układu w kolejnych krokach
czasowych. W obliczeniach używa się specjalnie
przygotowanych zestawów parametrów dla
funkcji opisujących energię cząsteczek układu pól siłowych. Dzięki takiemu podejściu dostępne są informacje w skali atomowej, jednocześnie
z możliwością ich analizy w zakresie czasowym z
rozdzielczością femtosekundową.
Głównym ograniczeniem w używaniu symulacji
MD jest moc obliczeniowa komputerów. Jednak
64
w ostatnich latach postęp techniki umożliwił wykonywanie prostych symulacji nawet na komputerach dostępnych podczas codziennej pracy. Na
komputerze z procesorem Intel DualCore o mocy 2× 2GHz w ciągu doby można wygenerować
niemal 1,5 ns symulację dynamiki lizozymu w
wodzie.
Na przestrzeni lat powstało wiele narzędzi pozwalających generować symulacje dynamiki molekularnej. Do najbardziej popularnych należą
AMBER [1], CHARMM [2] czy GROMACS [3,4].
Ten ostatni pakiet zdobył ogromną popularność,
w dużej mierze dzięki wysokiej wydajności oraz
darmowemu rozpowszechnianiu. Składa się on z
wielu narzędzi, które umożliwiają generowanie
plików wsadowych, przeprowadzanie symulacji
oraz analizę ich wyników. Głównym powodem tego, że osoby nieobeznane
z zagadnieniami bioinformatycznymi mają problemy z wykorzystywaniem techniki MD jest
nieumiejętność obsługi narzędzi. Pakiet GROMACS w całości obsługiwany jest z poziomu
Majta J. et al. „MYGENerator - narzędzie do korzystania z pakietu GROMACS” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
wiersza poleceń, przy użyciu wielu przełączników oraz opcji. Dodatkowo cały proces generowania symulacji składa się z sekwencji ściśle
powiązanych etapów. Narzędzie, które powstało
w ramach projektu naukowego naszego Koła pozwala osobom bez przygotowania generować
proste symulacje w sposób zautomatyzowany.
Opis narzędzia
Narzędzie MYGENerator to skrypt napisany w
języku Python [5]. Wywoływany jest z wiersza
poleceń pojedynczą komendą wraz z podaniem
nazwy pliku konfiguracji jako argumentu wywołania, a następnie działa na zasadzie odpowiadania na zadawane pytania o podstawowe
parametry (Rys. 1).
atomów w układzie. Kolejne pytanie dotyczy ilości kroków czasowych, które obejmie symulacja.
Standardowe 500 000 kroków odpowiada symulacji o długości 1 nanosekundy (przy kroku pozostawionym na 2 fs). Kolejne pola to pytania o
częstotliwość zapisu danych o układzie. Standardowy zapis co 1000 kroków czasowych to dobry
kompromis między dobrą jakością próbkowania
a niewielkimi rozmiarami plików wyjściowych.
Na koniec można wybrać prowadzenie symulacji
w wodzie lub w próżni; jednak tę drugą opcję
powinno się wybierać tylko w szczególnych sytuacjach. Po procedurze w której MYGENerator
generuje plik protokołu symulacji oraz uruchamia poszczególne składniki pakietu GROMACS
tworzące dalsze pliki wsadowe do symulacji MD
program uruchamia narzędzie "mdrun", które
wyzwala właściwą symulację. Po zakończeniu
obliczeń generowane są pliki z danymi analizy
symulacji. Pierwszym jest plik, który zawiera te
parametry, które wybrano podczas uruchamiania programu. Drugi to zapis całej trajektorii w
formacie .pdb[8], trzecim plikiem jest wykres
zmian parametru RMSD (średniego przemieszczenia wszystkich atomów układu względem stanu początkowego) w czasie symulacji, a ostatni
to dane do wykreślenia diagramów Ramachandrana [9] (wizualizacja kątów torsyjnych ψ i φ
łańcucha aminokwasowego).
Przykładowe zastosowanie
W celu przetestowania działania MYGENeratora
postanowiono wykonać symulację w polu GROMOS 53a6 nieustrukturyzowanego peptydu o
Rys. 1 Zrzut ekranu podczas pracy z narzędziem MYGENerator.
W pierwszej kolejności użytkownik zostaje zapytany o wybór pola siłowego. Do wyboru jest pole
CHARMM27 [6], szczególnie zalecane do symulacji dynamiki i oddziaływań układów zawierających kwasów nukleinowe oraz GROMOS 53a6
[7], które dobrze opisuje właściwości peptydów
w środowisku wodnym. Następnie należy ustalić, w jakiej temperaturze wykonana zostanie symulacja. Kolejne dwa parametry odnoszą się do
rozmiaru symulacji. Pierwszy to rozmiar kroku
czasowego (domyślna wartość to dwie femtosekundy), co jaki przeliczane są wartości energii
65
Majta J. et al. „MYGENerator - narzędzie do korzystania z pakietu GROMACS” Acta Mygenica nr. 4, lip. 201 3
Rys. 3 Wykres zmian RMSD peptydu w czasie symulacji
wyjściowe z przebiegu symulacji dla czasów 0ns,
2ns, 4ns, 6ns (Rys. 2), na których widać wyraźną
ewolucję struktury peptydu. Na wykresie RMSD
widać także wyraźny skok tempa zmian konformacyjnych w okolicach 4,5 ns (Rys. 3). Tempo
obliczeń wyniosło 3,118 nanosekundy na dobę
na procesorze Intel Dual Core 2×2GHz.
Podsumowanie:
Piśmiennictwo:
MYGENerator to proste narzędzie, które pozwala w nieskomplikowany sposób zarządzać pakietem GROMACS. Dzięki pełnej automatyzacji
pracy, po początkowym wprowadzeniu danych
MYGENerator zarządza składnikami pakietu
GROMACS, które nieprzerwanie współpracują
ze sobą aż do wygenerowania ostatecznych wyników. Narzędzie do pobrania ze strony:
http://www.mygen.wbbib.uj.edu.pl/mygenerator
[1] R. Salomon-Ferrer, D.A. Case, R.C.Walker. An overview of the Amber
biomolecular simulation package. WIREs Comput. Mol. Sci. 3, 198-210
(2013).
[2] Bernard R. Brooks et. al, CHARMM: A program for macromolecular
energy, minimization, and dynamics calculations, Journal of
Computational Chemistr Volume 4, Issue 2, pages 187–217, Summer
1983
[3] Van Der Spoel D, Lindahl E, Hess B, Groenhof G, Mark AE, Berendsen
HJ. GROMACS: fast, flexible, and free. J Comput Chem. 2005
Dec;26(16):1701-18
[4] Pronk S et. al, GROMACS 4.5: a high-throughput and highly parallel
open source molecular simulation toolkit. Bioinformatics. 2013 Apr
1;29(7):845-54
[5] G. van Rossum and F.L. Drake (eds), Python Reference Manual,
PythonLabs, Virginia, USA, 2001. Available at http://www.python.org
[6] P v. R. Schleyer et al., CHARMM: The Energy Function and Its
Parameterization with an Overview of the Program, in The Encyclopedia
of Computational Chemistry, 1, 271-277
[7] Chris Oostenbrink et. al, A biomolecular force field based on the free
enthalpy of hydration and solvation: The GROMOS force-field parameter
sets 53A5 and 53A6, Journal of Computational Chemistry
Volume 25, Issue 13, pages 1656–1676, October 2004
[8] http://www.wwpdb.org/documentation/format32/v3.2.html
[9] Ramachandran, G.N.; Ramakrishnan, C.; Sasisekharan, V. (1963).
"Stereochemistry of polypeptide chain configurations". Journal of
Molecular Biology 7: 95–9
Rys. 2 Diagramy Ramachandrana dla klatek 0ns, 2ns, 4ns,
6ns wraz z obrazami struktury peptydu w tym czasie.
długości 35 aminokwasów. Ilość kroków ustalono na 5 000 000, co przy standardowej długości
kroku czasowego (2 fs) daje 10 ns. Częstotliwość
zapisu zwiększono do 2000 dla każdego z parametrów. Zaprezentowano przykładowe dane
66
Otwieramy nabór artykułów do piątego wydania Acta Mygenica! Zapraszamy do udziału w
tym przedsięwzięciu i przesyłaniu publikacji na adres [email protected].
Pisząc artykuły prosimy kierować się wymaganiami redakcyjnymi zamieszczonymi poniżej.
1. Umieszczenie w nagłówku „Praca napisana pod opieką: xx Xxx Xxxxx”
2. Struktura wg schematu
Tytuł
autor
afiliacja
Abstrakt: Treść abstraktu
Treść:
· Treść publikacji z akapitami. Śródtytuły (Materiały i Metody, Dyskusja itp) oddzielone z góry
i z dołu wolną linią. Prosimy nie używać tabulatorów ani sekwencji kilku spacji.
· Odnośniki do bibliografii zamieszczane powinny być w klamerkach np. [1]
· Prosimy nie pisać dużymi literami tekstu innego niż oznaczenia itp. Jeśli
coś ma być
napisane w sposób *szczególny* proszę oznaczyć to w tekście komentarzem w nastepujący
sposób // treść komentarza //.
· Wszelkie grafiki, tabele etc. Powinny być zapisane z wysoką rozdzielczością w formacie .jgp
z nazwą wg wzoru Nazwisko_Fig1.jpg.
· Prosimy nie umieszczać w tekście obrazków a jedynie podpisy po nimi oddzielone z góry i z
dołu wolną linią.
w razie potrzeby można załączyć szczegółowe informacje co do składu.
Bibliografia:
[1] Nazwisko gł. autora Tytuł Czasopismo Rok Vol. Str.
[2] Dumoulin M, et. al. A camelid antibody fragment inhibits the formation of amyloid fibrils
by human lysozyme. Nature. 2003 Aug 14;424(6950):783-8
(PubMed -> DisplaySettings -> Summary Text)
Pliki w formacie .doc powinny mieć nazwy Nazwisko_AMIV.doc
Prosimy o brak formatowania tekstu – zostanie zmienione w trakcie
składu czasopisma.
67

Zeszyt Koła Naukowego Studentów Biotechnologii

Transkrypt

Podobne dokumenty

Nrf2

Transport przez pory jądrowe