Biodegradacja związków organicznych przez mikroorganizmy

Biotechnologia stosowana - biotechnologia środowiska – studia II stopnia
Biodegradacja związków organicznych przez mikroorganizmy
Termin remediacja oznacza oczyszczanie i usuwanie zanieczyszczeń powstałych w wyniku działania przemysłu lub w przypadku
awaryjnym ( np. awaria cysterny, wyciek benzyny, awaria tankowca przewożącego ropę naftową). Słowo bioremediacja składa się
ze słów: remediacja - oznaczająca uleczenie (powrót do stanu wyjściowego) i bio - życie.
Możemy następujące zdefiniować bioremediację jako proces likwidacji skażeń (okazjonalnych i trwałych) z wykorzystaniem
drobnoustrojów lub (i) roślin. W przypadku wykorzystania do tych celów roślin używa się terminu fitoremediacja.
Dokładna ocena środowiska wodno-gruntowego zarówno pod względem krążenia wód jak i stopnia zanieczyszczenia jest bardzo
istotna i stanowi domenę badań hydrologicznych, które pozwalają określić warunki migracji zanieczyszczeń oraz wybrać właściwą
metodę remediacji. Po wycieku produktów naftowych przechodzą one przez strefę aeracji do warstwy wodonośnej, ulegając po
części adsorpcji na materiale skalnym, glebie, a po części zaś infiltrując aż do osiągnięcia zwierciadła wody podziemnej lub wody
gruntowej. Większość produktów naftowych (PN) ulega rozkładowi biologicznemu (biodegradacji) za pomocą bakterii, grzybów,
które wykorzystują źródło energii, jakimi są produkty naftowe w swoim procesie metabolizmu, szczególnie w procesach
tlenowych.
Metody remediacji:
Fizykochemiczne:
Remediacja termiczna polega na cieplnej obróbce wybranego gruntu
- spalenie w temp. powyżej 1300 K
- podgrzewanie, piroliza do temperatury 900 K, a następnie spalanie gazu pirolitycznego
Remediacja ekstrakcyjna polega na płukaniu gruntu czyli na przeniesieniu zanieczyszczeń PN do medium płuczącego ( woda lub
woda z dodatkiem substancji chemicznych).
Elektroreklamacja
- elektroosmoza – polega na ruchu zanieczyszczonej wody porowej między elektrodami
- elektroforeza – ruch cząstek pod działaniem pola elektrycznego
- elektroliza – ruch jonów lub kompleksów między elektrodami
Metody biologiczne:
Landfarming LF polega na umieszczeniu skażonego gruntu PN w warstwach o grubości O,5- 1,5 m na nieprzepuszczalnym podłożu
wyposażonym w system drenażowy. Następuje biodegradacja aerobowa PN wspomagana dodatkiem tlenu, nutrientów i wody.
Czas trwania LF od 1-3 lat.
Bioreaktory, w reaktorach specjalnej konstrukcji, zachodzą procesy biodegradacji wspomagane mikroorganizmami i podwyższoną
temperaturą. Czas reakcji jest dużo krótszy, 3 doby do miesiąca w zależności od temperatury.
Procesy bioremediacji odbywają się z udziałem: mikroflory bytującej w danym środowisku i mikroflory wprowadzanej w formie
biopreparatów.
Dzięki metodą bioremediacji można usuwać między innymi skażenia spowodowane: węglowodorami ropy naftowej, metanem,
metalami ciężkimi, fosforem, truciznami fosfoorganicznymi, pestycydami, fenolami, chlorkiem dodecylopirydynowym (środek
bakteriostatyczny dodawany do emulsji), zeolitami.
Bioremediacja gleb z ropopochodnych
Od kilkunastu lat praktycznie we wszystkich uprzemysłowionych krajach świata istnieje problem skażenia gruntów ropą naftową i
jej produktami. Zanieczyszczenia te dostają się do gleb głównie w wyniku procesów wydobywczych ropy i jej przerobu w rafineriach
oraz awarii podczas magazynowania paliw. Niektóre węglowodory aromatyczne występujące w ropie (benzen, toluen, ksylen,
fenol) są bardzo szkodliwe dla człowieka, ze względu na toksyczne i kancerogenne działanie. Związki te charakteryzują się bardzo
dużą rozpuszczalnością w wodzie, w związku z czym łatwo przedostają się do wód podziemnych, a następnie do ujęć wodnych.
Zanieczyszczenie gleb produktami ropopochodnymi wpływa niekorzystnie na produkcję roślinną oraz na jakość wód
powierzchniowych i podziemnych.
Czynniki warunkujące efektywność procesów bioremediacyjnych
Efektywność bioremediacji gruntów z ropy i jej pochodnych zależy od tempa rozkładu tych zanieczyszczeń przez mikroorganizmy
glebowe, na które mają wpływ takie czynniki jak: budowa chemiczna, stężenie węglowodorów i ich toksyczność w stosunku do
mikroflory, mikrobiologiczny potencjał gleby (stężenie biomasy, różnorodność populacji, aktywność enzymów), fizykochemiczne
parametry środowiska (m.in. odczyn, temperatura, zawartość materii organicznej, wilgotność) oraz dostępność węglowodorów
dla komórek mikroorganizmów.
Minimalna liczebność mikroorganizmów w glebie skażonej produktami ropopochodnymi konieczna dla efektywnej biorekultywacji
wynosi ponad 105 komórek/g s.m. gruntu. W powierzchniowych warstwach gleby, zawierających odpowiedni
stosunek C:N:P występuje od 107 do 109 komórek/g gruntu, z tego od 0,1 do 1,0% stanowią organizmy zdolne do rozkładu
substancji ropopochodnych. W glebach skażonych produktami ropopochodnymi liczba bakterii może zwiększyć się od 100 do 1000
razy.
Większość metod biologicznego oczyszczania zaolejonych gruntów oparta jest na intensyfikacji procesu poprzez zastosowanie
odpowiednio dobranych i przygotowanych zespołów współdziałających ze sobą mikroorganizmów – biocenoz lub konsorcjów
mikroorganizmów, wyspecjalizowanych w rozkładzie węglowodorów naftowych. Biocenozy te, zwane biopreparatami, zawierają
specjalnie wyselekcjonowane ze środowiska naturalnego określone gatunki drobnoustrojów. Wprowadzane są do gleb jako
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Biotechnologia stosowana - biotechnologia środowiska – studia II stopnia
Biodegradacja związków organicznych przez mikroorganizmy
zaszczepy biologiczne (inokulum) zawierające ok. 109 komórek/cm3. Takie biopreparaty znacznie wspomagają, a niekiedy
warunkują, biodegradację zanieczyszczeń.
Właściwości i cechy środowiska w przeważającym stopniu decydują o możliwości przeprowadzenia bioremediacji in situ na danym
terenie, bowiem wpływają na mikrobiologiczną aktywność (np. temperatura, wilgotność) oraz transport (głównie przez dyfuzję)
zanieczyszczeń do wnętrza komórek drobnoustrojów (np. zawartość i jakość materii organicznej). Dostępność węglowodorów
naftowych dla komórek mikroorganizmów (biodostępność) zależy od różnych czynników fizycznych, chemicznych i
mikrobiologicznych, które wpływają zarówno na transport tych związków, jak i migrację mikroorganizmów w glebie. Słabo
rozpuszczalne węglowodory alifatyczne i aromatyczne z czterema i większą liczbą pierścieni łatwo ulegają adsorpcji na ziarnach
gruntu. Istotną rolę w kierowaniu bakterii w stronę węglowodorów naftowych (i innych zanieczyszczeń), które uległy sorpcji na
cząstkach gleby odgrywa chemotaksja. Do cząstek gleby, głównie materii organicznej i frakcji gliny (posiadają dobrze
rozwiniętą i ujemnie naładowaną powierzchnię), mogą również zostać związane mikroorganizmy o hydrofobowych osłonach
komórkowych. Najlepszą metodą poprawienia transportu węglowodorów naftowych do komórek mikroorganizmów i ich
biodostępności jest użycie środków powierzchniowo czynnych (SPC), które obniżają napięcie powierzchniowe i interfazowe cieczy
oraz emulgują substancje lipofilowe powodując zwiększenie powierzchni wymiany i rozpuszczalności. Liczne mikroorganizmy
degradujące węglowodory naftowe produkują środki powierzchniowo czynne (SPC). W sprzedaży dostępne są również różnego
rodzaju syntetyczne środki powierzchniowo czynne, jednak wiele z nich ma ograniczone zastosowanie w bioremediacji, ponieważ
są zbyt łatwo degradowane przez mikroorganizmy lub działają toksycznie na ich komórki. Korzystniejsze jest wprowadzanie do
zanieczyszczonych gruntów biologicznych SPC ze względu na ich biodegradowalność w środowisku i niską toksyczność. Jednak
wysokie koszty ich produkcji sprawiają, że powszechniej wykorzystuje się syntetyczne SPC. Prawidłowy przebieg procesu
biodegradacji może prowadzić do prawie 100% redukcji zanieczyszczeń w ciągu zaledwie kilku tygodni. Obecnie usunięcie z
gruntów lekkich takich zanieczyszczeń jak paliwo Diesla, benzyna, nafta lotnicza nie stanowi żadnej kwestii. Problem pojawia się
w przypadku bioremediacji gleb (w szczególności ciężkich) z czystej ropy lub frakcji ciężkich.
Szybkość rozkładu różnorodnych produktów ropopochodnych w powierzchniowych warstwach gruntów zachodzi z prędkością od
0,02 do ponad 0,4 g/kg gruntu/dobę, średnio od 0,09 do 0,14 g/kg gruntu/dobę. W głębszych warstwach gruntu szybkość
degradacji maleje z powodu niższego stężenia tlenu oraz mniejszej liczby drobnoustrojów .
Strategie stosowane w procesach bioremediacji
Bioremediację gruntów można przeprowadzać sposobem in situ – w miejscu występowania skażenia lub ex situ – po wybraniu
zanieczyszczonej gleby z danego terenu i umieszczeniu w specjalnie przygotowanym miejscu. Technologia in situ stosowana jest
w przypadku braku możliwości usunięcia skażonej ziemi, na przykład na obszarach przeznaczonych pod budownictwo, dróg, awarii
miejscowych pod rurociągami i instalacjami, skażeń dużych obszarów. Głównymi metodami bioremediacji gleb in situ są: uprawa
gleby, biowentylacja, bioekstrakcja. Technologia ex situ umożliwia skuteczniejsze wykonanie procesowych zabiegów
intensyfikacyjnych bioremediacji skażeń, co prowadzi do skrócenia całkowitego czasu rekultywacji.
Wśród metod oczyszczania ex situ wymienić należy: uprawę gleby, kompostowanie, biostosy i bioreaktory. Wyróżnić można trzy
typy bioremediacji gleb: bioremediację naturalną , biostymulację i bioaugmentację.
W bioremediacji naturalnej wykorzystuje się proces naturalnej przeprowadzanej przez mikroorganizmy i wymaga jedynie
prowadzenia regularnego monitorowania stężenia zanieczyszczeń. Najpowszechniej stosowaną metodą bioremediacji gruntów
jest biostymulacja polegająca na stymulowaniu wzrostu i aktywności rodzimych populacji drobnoustrojów (przyspieszaniu
procesów biodegradacji zanieczyszczeń) poprzez dostarczenie im odpowiednich substancji pokarmowych lub/i tlenu. Zdarza się,
że rodzime populacje na danym terenie nie wykazują pożądanej aktywności w degradacji zanieczyszczeń. Jest to spowodowane
toksycznym działaniem związków wchodzących w skład skażenia lub brakiem odpowiedniej ilości i jakości organizmów. W takiej
sytuacji można zastosować bioaugmentację. Metoda ta polega na wprowadzeniu do środowiska odpowiednich mikroorganizmów.
Mogą to być wyizolowane ze skażonego gruntu i namnożone szczepy, które wykazują największą aktywność w rozkładzie
zanieczyszczeń (reinokulacja), rodzime drobnoustroje o selektywnie wzmocnionych w laboratorium zdolnościach
funkcjonalnych lub mikroorganizmy modyfikowane genetycznie (GMM).
Genetycznie zmodyfikowane mikroorganizmy można wykorzystywać nie tylko do przyspieszenia biodegradacji w skażonej glebie,
ale również do monitorowania obecności wprowadzonych do gruntu bakterii oraz oceny biodostępności zanieczyszczeń
(biosensory) i możliwości ich eliminacji. W pierwszym przypadku bakterie są wyposażone w odpowiedni konstrukt genowy, który
jest łatwo wykrywany. Wówczas gdy biodostępność zanieczyszczeń jest warunkiem koniecznym do przeprowadzenia na danym
terenie biologicznego oczyszczania można wykorzystać bakterie zawierające w swoim genomie promotor indukowany przez
związek, którego biodostępność jest badana. Promotor ten jest połączony z genem, którego produkt można łatwo obserwować i
zmierzyć. Najpowszechniej używanymi genami reporterowymi są geny bioluminescencji (luc, lux) oraz gen gfp kodujący zielone
białko fluorescencyjne i jego pochodne.
Praktyczne zastosowanie w bioremediacji gruntów z ropy i jej produktów mogą mieć bakterie ze wstawionymi do chromosomu
genami enzymów uczestniczących w rozkładzie węglowodorów naftowych (np. genem tod kodującym dioksygenazę toluenu) czy
chemotaksji (np. NahY kodującym białko uczestniczące w chemotaksji do naftalenu i salicylanu) lub z wprowadzonymi plazmidami
degradacji węglowodorów (np. plazmidem degradacji piranu z Mycobacterium sp.).
Mikroorganizmy rozkładające węglowodory naftowe
Zdolność do degradacji i/lub wykorzystywania węglowodorów naftowych wykazuj ą liczne rodzaje bakterii i grzybów, a także
drożdże, niektóre Cyanobacteria i zielone glony. Jednak w bioremediacji gruntów, z wielu względów, wykorzystuje się przede
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Biotechnologia stosowana - biotechnologia środowiska – studia II stopnia
Biodegradacja związków organicznych przez mikroorganizmy
wszystkim bakterie. Charakteryzują się one wysoką liczebnością, szybkim wzrostem i zdolnością degradacji różnorodnych
zanieczyszczeń. Można je łatwo hodować oraz poddawać manipulacjom genetycznym. Biologiczne oczyszczanie gleb z produktów
ropopochodnych zachodzi głównie w wyniku działalności bakterii tlenowych, które wykorzystują węglowodory naftowe jako
źródło węgla i energii potrzebne do ich wzrostu i rozmnażania. Grzyby mają ograniczone zastosowanie w bioremediacji, ponieważ
transformują węglowodory naftowe najczęściej kometabolicznie, wymagając podstawowego substratu wzrostu (glukoza lub
celuloza), a tempo przeprowadzanej przez nie degradacji jest niskie. Organizmy te nie potrafią dalej metabolizować produktów
kooksydacji, dlatego też całkowita mineralizacja zanieczyszczeń ropopochodnych następuje w wyniku aktywności bakterii.
Mikroorganizmy najbardziej aktywne w biodegradacji węglowodorów naftowych: Pseudomonas, Arthrobacter, Alcaligenes,
Corynebacterium, Flavobacterium, Achromobacter, Micrococcus, Nocardia i Mycobacterium. Długołańcuchowe węglowodory
(alkany i alkeny) są rozkładane przez wiele gatunków bakterii (z rodzaju Pseudomonas, Acinetobacter, Arthrobacter,
Corynebacterium, Nocardia, Mycobacterium, Geobacillus), a także liczne drożdże (większość gatunków Candida), przy czym ich
liczba i intensywność degradacji wzrasta wraz z długością łańcucha. Mniej licznie występują w glebach mikroorganizmy zdolne do
biodegradacji cykloalkanów, przy czym zachodzi ona przede wszystkim przy udziale
konsorcjum mikroorganizmów w drodze kometabolizmu. Niskocząsteczkowe (dwu- lub trójpierścieniowe) węglowodory
aromatyczne są degradowane przez wiele bakterii glebowych, a także liczne rodzaje grzybów m.in. Rhizopus, Aspergillus, Candida,
Penicillium, Psilocybe, Smittum. Natomiast zdolność rozkładu wysokocząsteczkowych (z 4 i większą liczbą pierścieni)
węglowodorów aromatycznych występuje stosunkowo rzadko u bakterii. Zdolność do wzrostu na wysokocząsteczkowych
wielopierścieniowych węglowodorach aromatycznych jest prawdopodobnie szeroko rozpowszechniona w obrębie rodzaju
Mycobacterium.
Mechanizmy biodegradacji węglowodorów ropopochodnych
Najpowszechniejszą drogą tlenowej degradacji n-alkanów jest utlenianie terminalne z udziałem monooksygenazy. Hydroksylacja
przy końcowym węglu w łańcuchu prowadzi do wytworzenia odpowiedniego alkoholu, który jest następnie utleniany do
aldehydów i kwasów tłuszczowych. Kwasy tłuszczowe przechodzą proces β-oksydacji, a powstały w nim acetylo-CoA zostaje
włączony w cykl Krebsa. Alkeny ulegają hydrolizie w miejscu podwójnego wiązania, a następnie są metabolizowane jak alkany.
Krótkołańcuchowe węglowodory są trudniej degradowane z wyjątkiem metanu, który w warunkach tlenowych jest szybko
wykorzystywany jako jedyne źródło węgla przez metanotroficzne bakterie (np. Methylomonas methanica) i drożdże. Degradację
cykloheksanu zapoczątkowuje hydroksylacja prowadząca do powstania cykloheksanolu, który przekształcany jest w cykloheksanon
i kaprolakton. Następnie hydrolaza laktozowa otwiera pierścień i powstaje odpowiedni kwas organiczny – kwas adypinowy.
Bakterie i grzyby wykorzystują odmienne drogi w tlenowej biodegradacji węglowodorów aromatycznych. U bakterii początkowe
utlenienie pierścienia katalizowane jest przez wieloskładnikową dioksygenazę. Powstały cis-dihydrodiol ulega re aromatyzacji
(udział dehydrogenazy cis-dihydrodiolu) do pochodnych dihydroksylowych. Dalsze utlenianie prowadzi do utworzenia katecholu
(1,2-dihydroksybenzen) lub kwasu protokatechowego (3,4-dihydroksybenzoesan). Potem następuje oksydacyjne otwarcie
pierścienia aromatycznego (w pozycji orto lub meta) katecholu lub kwasu protokatecholowego z udziałem dioksygenaz. Dalszy
rozkład prowadzi do powstania intermediatów centralnych szlaków metabolicznych, takich jak bursztynian,
acetylo-CoA, pirogronian.
Grzyby nieligninolityczne oraz ligninolityczne utleniają pierścień aromatyczny do tlenków arenu za pomocą monooksygenazy
cytochromu P-450. Tlenki mogą następnie izomeryzować do fenoli lub ulec enzymatycznej hydroksylacji katalizowanej przez
hydrolazę epoksydową z wytworzeniem trans-dihydrodioli. W przeciwieństwie do grzybów nieligninolitycznych, z których
stosunkowo niewiele ma zdolność degradowania WWA do CO2, systemy enzymatyczne grzybów ligninolitycznych potrafią ciąć i
mineralizować pierścień aromatyczny. Posiadają one silne zewnątrzkomórkowe enzymy odpowiedzialne za degradację ligniny,
które działają na szeroką gamę WWA. Znane są, jak dotąd, dwie drogi beztlenowej degradacji alkanów. Pierwsza z nich polega na
addycji fumaranu, druga zaś obejmuje karboksylację i usunięcie terminalnej dwuwęglowej jednostki, co prowadzi do powstania
odpowiedniego kwasu tłuszczowego. Na podstawie dotychczasowych badań wskazuje się na trzy możliwe mechanizmy
początkowej aktywacji pierścienia benzenu, takich jak: karboksylacja, hydroksylacja i metylacja. Pierścień ulega przekształceniu do
centralnego intermediatu – benzylo-CoA, który jest redukowany do 1,5-dien-1-karboksylo-CoA przez główny enzym – reduktazę
benzoilo-CoA.
Ekstrakcja (z łaciny: extraho = wyciągam) jest to metoda wyodrębniania z mieszaniny ciał stałych lub cieczy jakiegoś składnika przy
pomocy rozpuszczalnika tak dobranego, aby rozpuszczał przede wszystkim żądany związek. Chemicy stosują tę metodę do
otrzymania związków naturalnych z materiału roślinnego (liści, kory itp.). Wszyscy korzystamy z tej metody np. przy parzeniu kawy.
W syntezie organicznej produkt reakcji otrzymywany jest często wraz z innymi związkami w postaci roztworu lub zawiesiny w
wodzie. Podczas wytrząsania takiej mieszaniny z nie mieszającym się z wodą rozpuszczalnikiem, produkt reakcji ulega ekstrakcji i
może być następnie odzyskany przez odparowanie rozpuszczalnika. Ekstrakcja związku z jednej fazy ciekłej do drugiej jest
procesem ustalania się równowagi zależnym od rozpuszczalności związku w obu rozpuszczalnikach. Stosunek stężenia w jednym
rozpuszczalniku do stężenia w drugim nosi nazwę współczynnika podziału i jest wielkością stałą w danej temperaturze,
charakterystyczną dla danej substancji i określonej pary rozpuszczalników.
Prawo to zwane prawem Nernsta wyraża się następującym wzorem:
𝒄𝑨
= 𝒄𝒐𝒏𝒔𝒕𝒂𝒏𝒔 = 𝑲
𝒄𝑩
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Biotechnologia stosowana - biotechnologia środowiska – studia II stopnia
Biodegradacja związków organicznych przez mikroorganizmy
gdzie: cA i cB stanowią stężenia substancji w warstwach A i B,
K – współczynnik podziału
Można przyjąć, że w przybliżeniu współczynnik podziału jest równy stosunkowi rozpuszczalności danej substancji w obu
rozpuszczalnikach. Związki organiczne są zwykle lepiej rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych niż w wodzie i dlatego
mogą one być ekstrahowane z roztworów wodnych. Jeśli do roztworu wodnego doda się elektrolitu, np. chlorku sodu, to
rozpuszczalność substancji organicznej maleje, inaczej mówiąc, substancja ulega wysalaniu. Czynnik ten pomaga wyekstrahować
związek organiczny.
Stosowane techniki ekstrakcji próbek stałych cieczą dzielą się na trzy zasadnicze grupy:
- Techniki klasyczne, do których zaliczamy: ekstrakcję rozpuszczalnikiem z wytrząsaniem, ekstrakcję za pomocą strumienia
rozpuszczalnika, saponifikację, ekstrakcję w aparacie Soxhleta oraz homogenizację próbki z rozpuszczalnikiem;
- Nowoczesne techniki z wykorzystaniem dodatkowych czynników do wspomagania ekstrakcji (ultradźwięki czy promieniowanie
mikrofalowe). Do tej grupy technik ekstrakcji należy sonikacja, przyśpieszona ekstrakcja z pomocą rozpuszczalnika (ASE),
ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika pod zwiększonym ciśnieniem ((MPLE), ekstrakcja z pomocą rozpuszczalnika wspomagana
promieniowaniem mikrofalowym (MAE);
- Techniki, w których wykorzystuje się płyny w stanie nadkrytycznym (SFE).
Techniki klasyczne
Do ekstrakcji i rozdzielania warstw nie mieszających się ze sobą cieczy używa się rozdzielaczy. Rozdzielacz umieszcza się na
dogodnej wysokości w kółku na statywie. Przed użyciem zawsze należy sprawdzić, czy kran obraca się swobodnie. Wszystkie
szlifowane powierzchnie smaruje się bardzo cienką warstwą specjalnego smaru. Rozdzielacza nie można napełniać więcej niż do
ok. 3/4 wysokości. Należy sprawdzić, czy dolny kran jest zamknięty, a następnie wlewać, najlepiej przez lejek, roztwór wodny i
pierwszą część rozpuszczalnika. Podczas wytrząsania rozdzielacz trzyma się kranem do góry, przytrzymując kran jedną ręką, a korek
drugą. Natychmiast po odwróceniu rozdzielacza należy otworzyć kran w celu wyrównania ciśnienia i usunięcia powietrza. Po
krótkim czasie ostrożnego wytrząsania i kilkakrotnym otwarciu kranu należy wytrząsać energicznie przez 2-3 minut. Następnie
rozdzielacz należy umieścić ponownie w kółku i pozostawić, aż warstwy dokładnie się rozdzielą. Wtedy dolną warstwę wylewa się
po otwarciu dolnego kranu do kolby stożkowej. Do ekstrakcji roztworów wodnych używa się rozpuszczalników o mniejszej gęstości
(np. eter dietylowy) lub większej gęstości niż woda (np.
chloroform lub chlorek metylenu). W pierwszym
przypadku, po spuszczeniu warstwy dolnej (wodnej),
należy warstwę organiczną również wylać do kolby
stożkowej. Następnie warstwę wodną przenosi się
ponownie do rozdzielacza i ponownie ekstrahuje nową
porcją rozpuszczalnika. W przypadku
stosowania rozpuszczalnika „cięższego” od wody,
roztwór wodny pozostaje w rozdzielaczu i może być
wytrząsany z kolejnymi porcjami rozpuszczalnika. W
każdym przypadku należy upewnić się, czy warstwa
wodna znajduje się na górze, czy na dole rozdzielacza.
W tym celu należy zaznaczyć na rozdzielaczu granicę faz
(np. pisakiem), a następnie dodać nieco wody. Zwiększy
się wówczas oczywiście objętość warstwy wodnej.
Poniższe rysunki przedstawiają sposób poprawnego posługiwania się rozdzielaczem.
Po ekstrakcji roztwór organiczny jest nasycony wodą i należy go osuszyć. Do tego celu stosuje się różne sole
tworzące hydraty (np. siarczan(VI) magnezu, siarczan(VI) sodu, chlorek wapnia). Roztwór pozostawia się nad
środkiem suszącym przez ok. 20 min., mieszając od czasu do czasu. Następnie odsącza się środek suszący przez
fałdowany sączek i przemywa go małą ilością rozpuszczalnika. Z kolei usuwa się rozpuszczalnik, stosując
wyparkę obrotową, a pozostałość poddaje się destylacji lub krystalizacji.
Aparat Soxhleta składa się z trzech części, połączonych najczęściej za pomocą szlifów: kolby kulistej (1) ,
ekstraktora (2), i chłodnicy zwrotnej (3). Ekstrahowane ciało stałe umieszcza się w gilzie (4) wykonanej z grubej
bibuły, tkaniny bądź siatki z cienkiego drutu. W kolbie znajduje się lotny rozpuszczalnik, który wrze przy
podgrzewaniu kolby za pomocą płaszcza grzejnego (7), a jego pary rurką (5) przechodzą do chłodnicy zwrotnej.
Po skropleniu rozpuszczalnik gromadzi się w środkowej części aparatu (2), gdzie znajduje się gilza. Ciecz z
wyekstrahowaną substancją samoczynnie, poprzez zamknięcie syfonowe (6), przelewa się do kolby, skąd
rozpuszczalnik jest ponownie oddestylowywany. Dzięki zamkniętemu obiegowi i destylacji rozpuszczalnika
próbkę można ekstrahować wielokrotnie świeżymi porcjami, przy stosunkowo niewielkiej ilości użytego
medium ekstrahującego. Ekstrakcja w aparacie Soxhleta jest procesem dość powolnym, jednak nie wymaga
ciągłego nadzoru. Zastosowanie automatycznych zestawów do prowadzenia ekstrakcji przyśpiesza jej przebieg
oraz umożliwia zmniejszenie zużycia rozpuszczalników.
Wykonanie ćwiczenia
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
1.
2.
Biotechnologia stosowana - biotechnologia środowiska – studia II stopnia
Biodegradacja związków organicznych przez mikroorganizmy
Biodegradacja substancji tłuszczowych w zaolejonej ziemi bielącej (ZZB) z wykorzystaniem biopreparatów
1.1. Przygotować w kolbie stożkowej 600 cm3 pożywki PM o składzie:
MgSO4 x 7H2O
- 0,2 g
(NH4)2HPO4
- 1,0 g
K2HPO4
- 1,0 g
NaCl
- 5,0 g
1.2. Do trzech pojemników PCV wprowadzić po ok. 1-2 kg mieszaniny ZZB i trocin w proporcji 6:4
1.3. W 200 cm3 przygotowanej wcześniej pożywki PM rozpuścić dostarczone przez prowadzącego biopreparaty: A i B, w ilości
20g/200 cm3.
1.4. Do pierwszego pojemnika wprowadzić zawiesinę biopreparatu A, do drugiego zawiesinę biopreparatu B. Trzeci pojemnik
stanowi próbę kontrolną – wprowadzamy do niego pozostałą część pożywki (bez dodatku biopreparatów).
1.5. Zawartość wszystkich pojemników dokładnie mieszamy i oznaczamy w nich początkową zawartość substancji tłuszczowej
– metodą wagową poprzez ekstrakcję w aparacie Soxleta eterem etylowym;
1.6. Biodegradację prowadzimy przez okres 30 dni, w temperaturze pokojowej, co kilka dni mieszając i zwilżając zawartość
pojemników pożywką PM.
1.7. Po miesiącu powtarzamy oznaczenie dla każdego wariantu badawczego.
Ekstrakcja substancji tłuszczowych w aparacie Soxhleta
2.1. Odważyć 5 g odpadów z dokładnością do 0,01 mg. Przenieść odważoną próbkę do gilzy wykonanej a bibuły filtracyjnej,
od góry gilzę zamknąć watą i całość umieścić w nasadce ekstrakcyjnej.
2.2. Do wysuszonej kolby okrągło dennej o pojemności 250 cm3 wprowadzić kamyki wrzenie – kolbę zważyć z dokładnością
do 0,01mg,
2.3. Następnie kolbę umieścić na czaszy grzejnej, zamontować na niej nasadkę ekstrakcyjną. Do ekstraktora wlewać eter
naftowy tak długo, aż przeleje się do kolby. Następnie dodać jeszcze połowę tej ilości eteru. Do nasadki ekstraktora
podłączyć chłodnice zwrotną.
2.4. Włączyć przepływ wody chłodzącej i rozpocząć ogrzewanie. Utrzymywać stan łagodnego wrzenia (temperatura ok. 700C)
przez 1 godzinę (czas ekstrakcji).
2.5. Wyłączyć ogrzewanie. Odparowywać eter naftowy na wyparce rotacyjnej do objętości około 1-2 ml.
2.6. Usunąć rozpuszczalnik susząc kilkanaście minut pod wyciągiem, aż do zaniku zapachu eteru naftowego.
2.7. Kolbę wraz z ekstraktem zważyć i wyznaczyć masę wydzielonej substancji tłuszczowej. Zawartość tłuszczu podać w
procentach.
Obliczenie zawartości tłuszczu (X) w procentach:
𝑿=
(𝒌 − 𝒎)
∙ 𝟏𝟎𝟎
𝒄
gdzie:
k – masa kolby z tłuszczem po ekstrakcji i odparowaniu eteru [g]
m – masa kolby przed ekstrakcją [g]
c – masa odważki odpadów tłuszczowych [g]
3. Opracowanie wyników
Na podstawie oznaczeń zawartości tłuszczu przed i po biodegradacji określić aktywność biodegradacyjna zastosowanych
biopreparatów w stosunku do mikroflory autochtonicznej (próba kontrolna)
4. Literatura
- Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998
- Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna I i II tom; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
- Pn-76 R-64753; Oznaczanie zawartości tłuszczu surowego
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba