skrobia modyfikowana fizycznie jako potencjalny prebiotyk

Transkrypt

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2008 z. 530: 405-418
SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE
JAKO POTENCJALNY PREBIOTYK
Joanna Le Thanh, Aneta Burchardt, Joanna Menclewicz, Anna Sip,
GraŜyna Lewandowicz
Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii śywności,
Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu
Wstęp
WaŜnym czynnikiem bezpośrednio zaleŜnym od zachowań konsumenta, tj. jego
warunków ekonomicznych, upodobań i nawyków Ŝywieniowych, jest rodzaj stosowanej
diety. Jej skład decyduje o właściwościach składników, które docierają do jelita
grubego. Wiele produktów Ŝywnościowych zawiera składniki, które nie są trawione w
górnej części przewodu pokarmowego (na odcinku Ŝołądek - jelito cienkie). Przykładem
takich składników jest skrobia oporna, nieskrobiowe polisacharydy (błonnik
pokarmowy) oraz oligosacharydy [FOOKS i in. 1999; LESZCZYŃSKI 2004]. Składniki, które
w postaci niestrawionej docierają do jelita grubego mogą być metabolizowane przez
mikroflorę jelitową i niejednokrotnie stymulować jej rozwój. Źródłem składników
wykorzystywanych przez bakterie jelitowe jest wiele produktów dietetycznych [GIDLEY i
in. 1995; LEWANDOWICZ, SORAL-ŚMIETANA 2004].
Na skład mikroflory jelitowej moŜna oddziaływać nie tylko za pośrednictwem
diety ale równieŜ poprzez stosowanie preparatów probiotycznych zawierających
wyselekcjonowane szczepy bakterii Lactobacillus czy Bifidobacterium. Powszechnie
wiadomo, Ŝe dodatek drobnoustrojów probiotycznych do diety wywiera korzystny
wpływ na zdrowie, przede wszystkim z uwagi na ich zdolność do antagonistycznego
działania na drobnoustroje chorobotwórcze oraz bakterie gnilne. Liczebność
korzystnych bakterii w produktach spoŜywczych podczas ich przechowywania, a
następnie podczas pasaŜu jelitowego obniŜa się. Z tego teŜ względu bakterie
probiotyczne często nie są w stanie utrzymać przewagi populacyjnej w przewodzie
pokarmowym. W związku z tym w ostatnich latach uwaga naukowców koncentruje się
na identyfikacji, a takŜe opracowywaniu funkcjonalnych składników Ŝywności, za
pośrednictwem których moŜna by manipulować składem mikroflory jelitowej w taki
sposób by korzystnie oddziaływała ona na nasze zdrowie. Modyfikacja składu
mikroflory jelitowej jest zatem moŜliwa zarówno poprzez doustne podanie Ŝywych
drobnoustrojów w postaci preparatów probiotycznych lub Ŝywności probiotycznej oraz
za pośrednictwem Ŝywności zawierającej nietrawione w przewodzie pokarmowym
składniki, które selektywnie stymulują wzrost i/lub aktywność określonych grup
drobnoustrojów.
Pierwotnie błonnik zawarty w ścianach komórkowych roślin uwaŜany był za
główne źródło materiału opornego na hydrolizę enzymatyczną (trawienie), jednakŜe
niedawno okazało się, Ŝe równieŜ oligosacharydy, jak i „oporne” frakcje skrobi,
406
J. Le Thanh i inni
stanowią interesujące źródło węglowodanów wykorzystywanych przez mikroorganizmy
w jelicie grubym [ASP 1996; LESZCZYŃSKI 2004]. Wśród tego typu produktów szczególne
miejsce zajmują substancje o działaniu prebiotycznym, takie jak polisacharydy
nieskrobiowe, a takŜe tzw. „resistant starch” czyli skrobia oporna na enzymy
amylolityczne. Substancje te nie są trawione przez enzymy amylolityczne w przewodzie
pokarmowym człowieka, natomiast stanowią źródło węglowodanów dla mikroflory
jelitowej. W wyniku zachodzących tam procesów fermentacyjnych tworzą się
krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe uczestniczące w formowaniu nabłonka jelitowego
i wykazujące udowodnione działanie antykancerogenne [BROUNS i in. 2002]. Prebiotyki
stymulują zatem rozwój probiotyków. Prebiotyki w sposób pośredni wpływają więc na
skład mikroflory jelitowej, motorykę jelit, gospodarkę mineralną, syntezę witamin z
grupy B oraz poziom cholesterolu i syntezy triglicerydów. Są pomocne w profilaktyce
nowotworów, a takŜe mogą zmniejszać ryzyko powstawania wielu chorób
cywilizacyjnych takich jak: osteoporoza (poprzez poprawę wchłaniania wapnia),
otyłość (obniŜenie indeksu glikemicznego), wrzodziejące zapalenie jelita grubego,
zaparcia, czy choroba wieńcowa [GIBSON 2004]. Pomimo szeregu dostępnych
komercyjnie preparatów prebiotycznych i coraz większej ilości informacji na temat
mikroflory jelitowej, wiedza dotycząca przemian jakim zarówno w warunkach in vitro
jak i in vivo ulegają prebiotyki jest nadal niewielka. Pierwszą próbę opracowania
ilościowej, a tym samym porównywalnej, metody oceny przebiegu fermentacji
substancji prebiotycznych w warunkach in vitro opracowali Palframan i wsp., którzy
wprowadzili pojęcie indeksu prebiotycznego PI [VULEVIC i in. 2004]. Do wyznaczenia PI
zaproponowali równanie, określające zmiany liczebności populacji kluczowych grup
bakterii bytujących w jelicie grubym (Bifidobacterium, Lactobacillus, Clostridium oraz
Bacteroides) [VULEVIC i in. 2004]. Częściej jednak badania nad prebiotykami dotyczą
określenia ich wpływu na liczebność wybranego szczepu bakterii probiotycznych np.
Bifidobacterium [SORAL-ŚMIETANA i in. 2005] lub Lactobacillus [LIBUDZISZ 2006]. W
badaniach tych ocenia się takŜe ilość powstających krótkołańcuchowych kwasów
tłuszczowych oraz tempo asymilacji substratu i na ich podstawie określa się tzw. efekt
prebiotyczny [SORAL-ŚMIETANA i in. 2005; LIBUDZISZ 2006].
Ze względu na właściwości fizykochemiczne skrobi oraz jej znaczenie w Ŝywieniu człowieka, ogromne nadzieje wiąŜe się z produktami jej modyfikacji jako
produktami dietetycznymi [LE THANH, LEWANDOWICZ 2007]. W szczególności duŜe
oczekiwania istnieją w odniesieniu do procesów modyfikacji fizycznej, które
w odróŜnieniu od sposobów polegających na reakcjach chemicznych nie budzą zastrzeŜeń z punktu widzenia Ŝywieniowego. W Katedrze Biotechnologii i Mikrobiologii
śywności Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu opracowano metodę otrzymywania
skrobi o podwyŜszonej oporności na enzymy amylolityczne na drodze
wysokociśnieniowej homogenizacji kleiku [GRAJEK i in. 2004]. Metodą tą moŜna
otrzymać produkt o strawności obniŜonej do 50%.
Celem niniejszej pracy było ustalenie czy skrobia modyfikowana fizycznie
otrzymana w wyniku wysokociśnieniowej homogenizacji kleików skrobiowych jest
metabolizowana przez probiotyczne szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus. Uzyskanie tych informacji moŜe w przyszłości doprowadzić do opracowania na ich bazie
preparatów prebiotycznych i/lub gotowych symbiotyków.
Materiały i metody
Materiał badawczy stanowiła skrobia ziemniaczana modyfikowana fizycznie
otrzymana na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji kleiku skrobiowego [GRAJEK i
SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE ...
407
in. 2004]. Do celów porównawczych zastosowano takŜe maltodekstrynę niskoscukrzoną
(DE = 4,9) pochodzącą z Przedsiębiorstwa Przemysłu Ziemniaczanego w Łobzie oraz
skrobię ziemniaczaną natywną wyprodukowaną przez WWPZ w Luboniu.
Masę cząsteczkową skrobi ziemniaczanej, maltodekstryny N oraz homogenizatu
oznaczano techniką GFC (ang. Gel Filtration Chromatography). UŜyto trzech
sprzęŜonych szeregowo kolumn UltrahydrogelTM (Waters). Analizy wykonano aparatem
firmy Waters (Alliance HPLC System 2695) z detektorem refraktometrycznym (RI)
Waters 2414. Dane przetwarzano za pomocą oprogramowania Empower Pro w opcji
GPC. Analizę chromatograficzną prowadzono w następujących warunkach: temperatura
injektora 25°C, temperatura kolumn 40°C, temperatura celi pomiarowej 35°C, przepływ
rozpuszczalnika (woda dejonizowana) 0,700 ml/min. Krzywą kalibracyjną otrzymano
przy uŜyciu standardów mas cząsteczkowych dekstranu (Polymer Standards ServiceUSA, Inc.).
Badaniom poddano probiotyczne szczepy bakterii Lactobacillus acidophilus, L.
casei, L. plantarum oraz L. ramnosus. Wszystkie badane bakterie pochodziły z kolekcji
czystych kultur Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii śywności Uniwersytetu
Przyrodniczego w Poznaniu.
Hodowle probiotycznych bakterii Lactobacillus prowadzono bez regulacji pH w
temperaturze 37°C w płynnym podłoŜu MRS (standardowym podłoŜu dla bakterii z
rodzaju Lactobacillus) oraz w zmodyfikowanych podłoŜach MRS. Modyfikacja podłoŜa
MRS polegała na usunięciu z niego glukozy i zastąpieniu jej równowaŜną ilością maltodekstryny, naturalnej skrobi ziemniaczanej lub skrobi modyfikowanej fizycznie
(homogenizatu). Sterylizację podłoŜy prowadzono po dodaniu do nich alternatywnych
w stosunku do glukozy źródeł węgla. W trakcie hodowli, w określonych interwałach
czasowych, oznaczano liczebność komórek Lactobacillus metodą rozcieńczeń
dziesiętnych i wyraŜano ją w jtk/ml. Wszystkie oznaczenia wykonywano w trzech
powtórzeniach. Na podstawie otrzymanych danych określano maksymalną liczbę
komórek badanych bakterii, obliczano ilość podziałów, czas generacji, maksymalną
szybkość wzrostu (częstość podziałów) oraz czas trwania fazy wykładniczej. Hodowlę
kontrolną (klasyczne podłoŜe MRS) prowadzono przez 50 godz., natomiast hodowle
testowe (zmodyfikowane podłoŜa MRS) przez 75 godz. Czas hodowli testowych
wydłuŜono o 50% by dokładnie prześledzić sposób oddziaływania zastosowanych
źródeł węgla na ich przebieg.
Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych SCFA oznaczono wykorzystując technikę wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC. Oznaczenia
wykonano na chromatografie cieczowym Merck-Hitachi L-7250, wyposaŜonym w
kolumnę Amnimex HPX-87H 300 x 7,8mm oraz prekolumnę i detektor
refraktometryczny typ DAD MERCK-HITACHI L-7455. Jako eluent stosowano 0,005M
H2SO4, przy przepływie 0,6 ml⋅min-1. Próby sączono przez sączki 0,45 µm (Milipore) i
nanoszono na kolumnę w ilości 30 µl. Identyfikacji jakościowej oraz ilościowej
dokonano metodą standardu zewnętrznego z wykorzystaniem powierzchni pików
(pomiar i integracja komputerowa).
Wyniki i dyskusja
Skrobia modyfikowana fizycznie na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji
kleiku skrobiowego wykazuje obniŜoną do 50% strawność czyli zaledwie połowa
skrobi ulega hydrolizie do glukozy po 16-tu godzinach inkubacji w obecności αamylazy trzustkowej i glukoamylazy. Pod względem strukturalnym preparat ten w
niewielkim stopniu róŜni się od naturalnej skrobi ziemniaczanej, a najpowaŜniejszą
408
J. Le Thanh i inni
zmianą jaką powoduje zastosowany sposób obróbki jest częściowa degradacja
makrocząsteczek tego polisacharydu (rys. 1). Na wykresie obrazującym rozkład mas
cząsteczkowych naturalnej skrobi ziemniaczanej moŜna zaobserwować ostry pik
amylopektyny dla czasu retencji 16,6 min, oraz trzy szerokie piki (czas retencji 22,5;
24,9; 30,7 min) odpowiadające amylozie (rys. 1). Handlowa maltodekstryna
niskoscukrzona DE = 4,9 (co odpowiada stopniowi polimeryzacji DP ≅ 20) wykazuje
duŜy szeroki pik z dwoma maksimami dla czasów retencji 40,5 i 36,2 min
odpowiadający dominującej frakcji niskocząsteczkowej, oraz mały pik dla czasu
retencji 17,9 min, wskazujący na obecność w produkcie niewielkiej ilości relatywnie
wysokocząsteczkowej frakcji polisacharydowej. W odróŜnieniu od pozostałych
zastosowanych wielkocząsteczkowych źródeł węgla, homogenizat skrobiowy wykazuje
trimodalny rozkład mas cząsteczkowych. Najbogatszą frakcję stanowi niezdegradowana
amylopektyna, ponadto występują frakcje odpowiadające zdegradowa.ym cząsteczkom
skrobiowym. Charakterystyczny jest fakt, iŜ pik amylopektyny homogenizatu występuje
przy nieco niŜszym czasie retencji (16,4 min) niŜ pik amylopektyny naturalnej skrobi
ziemniaczanej (16,7 min). PowyŜsza obserwacja wskazuje, iŜ proces
wysokociśnieniowej homogenizacji spowodował nie tylko degradację makrocząsteczek
skrobiowych, ale równieŜ pewną zmianę konformacyjną frakcji amylopektyny
poprawiającą termodynamiczną zgodność polimer-rozpuszczalnik w układzie
homogenizat-woda co w konsekwencji przesunęło pik GPC w kierunku niŜszych
czasów retencji.
Rys. 1.
Fig. 1.
Rozkład mas cząsteczkowych określony metodą filtracji Ŝelowej (GPC), 1 - skrobia,
2- homogenizat skrobi, 3 - maltodekstryna N
Molecular mass distribution determined by the gel permeation chromatography
method (GPC), 1 - starch, 2 - homogenised starch, 3 - maltodextrin N
Zastąpienie glukozy w poŜywce MRS poliglukanami skrobiowymi o róŜnej masie
cząsteczkowej czyli: maltodesktryną, naturalną skrobią ziemniaczaną oraz skrobią
modyfikowaną fizycznie wpłynęło na przebieg hodowli badanych bakterii z rodzaju
Lactobacillus (tab. 1). W trakcie fazy wzrostu wykładniczego składniki odŜywcze w
komercyjnych podłoŜach hodowlanych występują zwykle w nadmiarze dlatego
szybkość wzrostu bakterii jest największa, a zarazem maksymalna i charakterystyczna
dla poszczególnych gatunków. Zdolność bakterii do wzrostu zaleŜy jednak nie tylko od
indywidualnych właściwości bakterii ale w duŜej mierze jest uzaleŜniona od
stosowanego substratu [VULEVIC i in. 2004]. Jak wynika z danych zamieszczonych w
tabeli 1, w przypadku hodowli prowadzonych na podłoŜu z glukozą maksymalna
liczebność komórek wykazywała niewielkie zróŜnicowanie gatunkowe i wynosiła dla L.
acidophilus 9,8⋅108 jtk⋅ml-1, dla L. casei 9,0⋅108 jtk⋅ml-1 oraz dla L. plantarum i L.
ramnosus 2,0⋅109 jtk⋅ml-1. Maltodekstryna, która charakteryzowała się stopniem
polimeryzacji DP ≅ 20 była równieŜ źródłem węgla bardzo efektywnie
wykorzystywanym przez bakterie z rodzaju Lactobacillus. UmoŜliwiła ona wszystkim
409
badanym bakteriom intensywny wzrost, jednak maksymalna gęstość ich populacji była
się nieco niŜsza od otrzymywanej w podłoŜu z glukozą. Wzrost bakterii z rodzaju
Lactobacillus w pozostałych podłoŜach był słabszy niŜ w kontroli glukozowej, co
moŜna tłumaczyć bardziej skomplikowaną strukturą wchodzących w ich skład
substratów. Ze względu na to, iŜ pozostałymi źródłami węgla były cukry złoŜone,
badane bakterie, do ich rozkładu musiały uruchomić syntezę specyficznych enzymów.
To z kolei powodowało stopniową zmianę ich metabolizmu. Zmiana ta wpłynęła na
obniŜenie liczebności komórek oraz na wydłuŜenie niektórych faz wzrostu - głównie
fazy wykładniczego wzrostu (tab. 1). W przypadku skrobi ziemniaczanej czas trwania
fazy wykładniczej wydłuŜył się do 13 godz. dla Lactobacillus acidophilus (tab. 1),
natomiast dla pozostałych bakterii aŜ do 24 godz. (tab. 1). Maksymalna liczebność
komórek wszystkich badanych lactobacillusów w podłoŜu ze skrobią ziemniaczaną była
niŜsza niŜ w podłoŜu z glukozą i wynosiła średnio 8,2⋅108 jtk⋅ml-1 (tab. 1). Wyjątek
stanowiły bakterie Lactobacillus plantarum, których populacja w podłoŜu ze skrobią
ziemniaczaną osiągnęła liczebność porównywalną do klasycznego podłoŜa MRS
(tab. 1). Gęstość komórek w podłoŜu z homogenizatem była natomiast zbliŜona do
wartości uzyskiwanych dla skrobi natywnej, co moŜe być spowodowane zbliŜoną masą
cząsteczkową obu związków. Na uwagę zasługuje równieŜ fakt, Ŝe czas trwania fazy
wykładniczej wszystkich badanych probiotycznych szczepów Lactobacillus na
podłoŜach z homogenizatem był dwu- trzykrotnie krótszy niŜ na podłoŜach ze skrobią
natywną.
Tabela 1; Table 1
Parametry wzrostu bakterii z rodzaju Lactobacillus w klasycznym podłoŜu MRS
z glukozą oraz w zmodyfikowanych podłoŜach MRS
Parameters of Lactobacillus growth
in classic as well as modified MRS broth
Wyszczególnienie; Specification
Glukoza
Glucose
Maltodekstryna
Maltodextrin
Skrobia
Potato
starch
Homogenizat
skrobi
Homogenised
starch
1
2
3
4
5
8,99
8,6
7,97
7,85
10
8
13
8
Lactobacillus acidophilus
Log maksymalnej liczebności komórek (jtk⋅ml-1)
The log of maximum cells viability (cfu⋅ml-1)
Czas trwania fazy wykładniczej - t (godz.)
Time of exponential phase - t (h)
2
3
4
5
Liczba podziałów (pokoleń) - n
Number of generations - n
1
9,9
4,8
3,7
2,7
Maksymalna właściwa szybkość wzrostu - v (godz.)
Maximum specific growth rate - v (h)
1,0
0,6
0,3
0,3
Czas generacji - g (godz.)
Generation time - g (h)
1,0
1,7
3,3
3,3
8,82
8,58
7,74
7,39
10
13
24
8
5,14
6,5
4,5
4,9
Lactobacillus casei
J. Le Thanh i inni
410
0,5
0,5
0,2
0,6
2,0
2,0
5
1,7
9,15
8,99
9,16
8,75
13
8
24
8
10,5
4,8
9,4
6,4
0,8
0,6
0,4
0,8
1,2
1,6
2,5
1,25
9,13
8,83
7,95
7,86
10
5
24
8
5,8
6,9
4,3
3,4
Maximum specific growth rate (h)
0,6
1,4
0,2
0,4
1,6
0,7
5,6
2,5
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus ramnosus
Wytwarzanie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) jest typową
cechą fizjologiczną bakterii z rodzaju Lactobacillus i jedną z przyczyn korzystnego
oddziaływania tych mikroorganizmów na organizm człowieka. W związku z tym, Ŝe
krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe wytwarzane podczas fermentacji wywierają
pozytywny wpływ na organizm ludzki podwyŜszone stęŜenia tych kwasów w jelicie
grubym są uznawane za poŜądane. Wszystkie kwasy tłuszczowe wytwarzane przez
Lactobacillus obniŜają pH jelit powodując tym samym zmniejszenie ilości
niekorzystnej dla nas mikroflory. SCFA mogą takŜe stymulować rozwój nabłonka
jelitowego (kwas masłowy), a nawet wpływać korzystnie na rozwój hepatocytów
(głównie kwas propionowy) [LIBUDZISZ 2006]. Jak wykazały przeprowadzone badania
ilość kwasów wydzielanych przez cztery probiotyczne szczepy bakterii Lactobacillus
zaleŜała od rodzaju źródła węgla obecnego w podłoŜu. Na rysunku 2 przedstawiono
profil zmian stęŜenia najwaŜniejszych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w
hodowli bakterii Lactobacillus acidophilus na podłoŜu zawierającym glukozę jako
źródło węgla. Rysunek ten obrazuje sposób w jaki bakterie Lactobacillus wytwarzały
krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe w sytuacji gdy zapewniono im optymalne warunki
wzrostu. Fermentacja glukozy, będącej preferowanym źródłem węgla przez bakterie,
dała stosunkowo wysoką produkcję kwasu mlekowego. Jego stęŜenie w 50 godz.
hodowli oscylowało w granicach 25 g⋅dm-3. Drugim, pod względem ilościowym,
metabolitem wydzielanym podczas fermentacji do podłoŜa był kwas octowy. Jego ilość
rosła stopniowo do wartości 5 g⋅dm-3. W mniejszych ilościach wytwarzane były inne
SCFA. Maksymalne stęŜenie kwasu propionowego w podłoŜu hodowlanym
411
zarejestrowano w 50 godz. hodowli. Wynosiło ono 1,7 g⋅dm-3. Kwas masłowy był
natomiast wydzielany w śladowych ilościach. Produkcja wszystkich SCFA zaczynała
się około 6 godziny hodowli, czyli mniej więcej w połowie fazy wzrostu
wykładniczego. Analizując dane zamieszczone na rysunku 2 stwierdzono równieŜ, Ŝe
przez cały czas trwania hodowli bakterie Lactobacillus nie utylizowały
krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych.
-- kwas mlekowy; lactic acid
-- kwas propionowy; propionic acid
-- kwas octowy; acetic acid
-×- kwas masłowy; butyric acid
Rys. 2.Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas hodowli Lactobacillus
acidophilus w poŜywce zawierającej glukozę jako źródło węgla
Fig. 2.
The short chain fatty acids concentration during Lactobacillus acidophilus growth in
the medium with glucose as a carbon source
Zastosowanie do hodowli L. acidophillus podłoŜa z maltodekstryną zamiast
glukozy obniŜyło produkcję wszystkich SCFA (rys. 3). Maksymalne uzyskane stęŜenie
kwasu mlekowego wynosiło 8,44 g⋅dm-3, kwasu octowego 3,79 g⋅dm-3, natomiast kwasu
propionowego 1,03 g⋅dm-3. Jedynie kwas masłowy podczas hodowli na podłoŜu z
maltodekstryną był produkowany w porównywalnych ilościach jak w trakcie hodowli
kontrolnych (podłoŜa z glukozą). W podłoŜu MRS zmodyfikowanym maltodekstryną L.
acidophillus potrzebowały jednocześnie znacznie więcej czasu na wykorzystanie
substratu stąd teŜ produkcja SCFA zaczynała się znacznie później w porównaniu z
hodowlami kontrolnymi.
J. Le Thanh i inni
412
Rys. 3.
Fig. 3.
Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas hodowli Lactobacillus acidophilus w poŜywce zawierającej maltodekstrynę jako źródło węgla
the medium with maltodekstrin as a carbon source
Zastosowanie naturalnej skrobi ziemniaczanej jako źródła węgla spowodowało
zmianę proporcji ilościowych wytwarzanych krótkołańcuchowych kwasów
tłuszczowych w porównaniu z kontrolą glukozową (rys. 4). W trakcie hodowli na
podłoŜu ze skrobią ziemniaczaną L. acidophillus produkowały najwięcej kwasu
octowego. Kolejnym pod względem ilości wytwarzanym SCFA był kwas mlekowy, a
następnie kolejno kwas propionowy i masłowy.
Poziom produkcji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w podłoŜu
zawierającym homogenizat róŜnił się wyraźnie od stwierdzonego w pozostałych typach
podłoŜy (rys. 5). Największe zmiany nastąpiły w produkcji kwasu mlekowego, mniejsze
natomiast w produkcji kwasu octowego oraz propionowego. Bakterie L. acidophilus
hodowane w podłoŜu z homogenizatem, podobnie jak w podłoŜu ze skrobią,
produkowały, więcej kwasu octowego niŜ kwasu mlekowego. Podobne wyniki uzyskała
WRONKOWSKA i in. [2006], w badaniach 24-godzinnej fermentacji róŜnych substratów
skrobiowych z udziałem wybranych szczepów Bifidobacterium, gdzie w przypadku
próby kontrolnej, czyli podłoŜa z glukozą głównym metabolitem fermentacji był kwas
mlekowy, a fermentacja pozostałych substratów (tj. skrobi natywnych i skrobi
modyfikowanych, opornych na enzymy amylolityczne) dała wysokie stęŜenia kwasu
octowego [WRONKOWSKA i in. 2006].
413
Rys. 4.Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas hodowli Lactobacillus
acidophilus w poŜywce zawierającej skrobię jako źródło węgla
Fig. 4.
the medium with potato starch as a carbon source
Rys. 5.
Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas hodowli Lactobacillus acidophilus w poŜywce zawierającej homogenizat skrobi jako źródło węgla
Fig. 5.
The short chain fatty acids during Lactobacillus acidophilus growth in the medium
with homogenized starch as a carbon source
W badaniach VULEVIC’A i in. [2004] zaobserwowano wyŜszą produkcję kwasu octowego
niŜ mlekowego przy zastosowaniu jako źródła węgla zamiast glukozy trans-galaktooligosacharydów, frukto-oligosacharydów, sacharozy, czy teŜ gumy guar [VULEVIC i in.
2004]. Kwas octowy, który okazał się być głównym metabolitem fermentacji natywnej
skrobi ziemniaczanej oraz skrobi modyfikowanej fizycznie prowadzonej przez
probiotyczne szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus jest związkiem wykazującym
silną antagonistyczną aktywność względem wielu bakterii, droŜdŜy i pleśni. Ponadto
ustalono, Ŝe jest absorbowany z jelita grubego i stanowi zapasowe źródło energii dla
tkanek [WRONKOWSKA i in. 2006].
J. Le Thanh i inni
414
Proces produkcji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych przez pozostałe
badane szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus miał podobny przebieg jak
w przypadku L. acidophilus. Ponadto charakter zmian wywołanych obecnością róŜnych
źródeł węgla w podłoŜu był analogiczny (tab. 2).
Tabela 2; Table 2
Ilości krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych wytworzonych
przez bakterie z rodzaju Lactobacillus w klasycznym podłoŜu MRS
z glukozą oraz podłoŜach zmodyfikowanych po 50 godz. fermentacji
Production of short chain fatty acids by Lactobacillus in classic
as well as modified MRS broth after 50h fermentation
Źródło węgla w podłoŜu
Carbon source
StęŜenie kwasu w podłoŜu po 50 godz. fermentacji
Concentration of acids in broth after 50 h fermentation
(g⋅dm-3)
mlekowy
lactic
octowy
acetic
propionowy
propionic
masłowy
butyric
L. acidophilus
Glukoza; Glucose
24,71
5,12
1,66
0,02
Maltodekstryna; Maltodextrin
7,98
3,69
1,00
0,09
Skrobia; Starch
1,46
3,33
1,08
0,09
Homogenizat skrobi; Homogenised starch
1,19
3,32
0,91
0,03
L. casei
Glukoza; Glucose
26,47
5,15
1,69
-
8,54
2,15
1,02
0,06
Skrobia; Starch
1,67
2,65
1,02
0,12
1,05
2,69
0,85
0,05
Glukoza; Glucose
14,89
2,56
0,73
0,05
19,40
2,80
0,81
0,06
Skrobia; Starch
10,67
4,41
1,33
0,06
0,59
4,03
1,50
0,01
L. plantarum
L. ramnosus
Glukoza; Glucose
15,08
1,97
0,99
0,05
9,80
2,55
0,86
0,06
Skrobia; Starch
0,87
2,15
0,59
0,03
1,07
3,60
1,07
0,05
Podsumowanie
Skrobia modyfikowana fizycznie na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji
kleiku skrobiowego wykazuje obniŜoną do 50% strawność in vitro. Zastosowany
sposób obróbki powoduje częściową degradację makrocząsteczek tego polisacharydu
oraz zmianę konformacyjną frakcji amylopektyny poprawiającą termodynamiczną
zgodność polimer-rozpuszczalnik w układzie polimer-woda. Zastąpienie glukozy w
podłoŜu MRS skrobią modyfikowaną fizycznie zmienia przebieg hodowli czterech
badanych probiotycznych szczepów bakterii Lactobacillus. UŜycie jako źródła węgla
maltodekstryny, nie wpływa w wyraźny sposób na intensywność wzrostu Ŝadnego z
badanych szczepów. Podczas hodowli w podłoŜu ze skrobią ziemniaczaną natywną
415
następuje natomiast obniŜenie liczebności komórek oraz wydłuŜenie fazy wzrostu
wykładniczego w stosunku do pozostałych testowanych w pracy źródeł węgla. W
przypadku zastosowania podłoŜa ze skrobią modyfikowaną fizycznie zaobserwowano
niŜszą liczebność komórek wszystkich Lactobacillus, w porównaniu do uzyskiwanej w
podłoŜu z formą natywną skrobi. Maksymalna szybkość wzrostu komórek była jednak
porównywalna w obu podłoŜach. Zastosowanie wysokocząsteczkowych źródeł węgla,
takich jak naturalna skrobia ziemniaczana oraz skrobia modyfikowana na drodze
wysokociśnieniowej homogenizacji wyraźnie obniŜyło produkcję kwasu mlekowego
oraz zmieniło proporcje ilościowe pomiędzy pozostałymi SCFA wytwarzanymi przez
Lactobacillus. W podłoŜach ze skrobią modyfikowaną fizycznie kwas octowy był
głównym produktem fermentacji. Skrobia modyfikowana fizycznie na drodze
wysokociśnieniowej homogenizacji powodowała podobne zmiany metabolizmu bakterii
probiotycznych jak znane substancje o charakterze prebiotycznym, tj. trans-galakto-oligosacharydy, frukto-oligosacharydy oraz preparaty skrobi opornej.
Literatura
ASP, N-G. 1996. Dietary carbohydrates: classification by chemistry and physiology.
Food Chem. 57(1): 9-14.
BROUNS F., KETTLITZ B., ARRIGONI E. 2002. Resistant starch and the butyrate revolution”. Trends in Food Sci. and Techn. 13(8): 251-261.
FOOKS L.J., FULLER R., GIBSON G.R. 1999. Prebiotics, probiotics and human gut
microbiology. Intern. Dairy J. 9: 53-61.
GIBSON G.R. 2004. Prebiotics. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology
18(2): 287-298.
GIDLEY M.J., COOKE D., DARKE A.H., HOFFMANN R.A., RUSSELL A.L., GREENWELL P. 1995.
Molecular order and structure in enzyme-resistant retrograded starch. Carbohydrate
Polymers 28(1): 23-31.
GRAJEK W., JANKOWSKI T., LEWANDOWICZ G. 2004. Sposób otrzymywania produktu
skrobiowego o podwyŜszonej odporności na enzymy amylolityczne. Zgłoszenie patentowe RP nr P. 368472 z dnia 8 czerwca 2004.
LE THANH J., LEWANDOWICZ G. 2007. Dietetyczne produkty skrobiowe. Przem. SpoŜ.
61(8): 54-58; 88.
LESZCZYŃSKI W. 2004. Resistant starch - classification, structure, production. Polish J.
of Food and Nutrition Sci. 13/54(1): 37-50.
LEWANDOWICZ G. SORAL-ŚMIETANA M. 2004. Starch modification by iterated syneresis.
Carbohydrate Polymers 56(4): 403-413.
LIBUDZISZ Z. 2006. Mikroflora przewodu pokarmowego człowieka i jej wpływ na organizm, w: Mikroorganizmy w Ŝywności i Ŝywieniu. Wydawn. AR w Poznaniu: 31-41.
VULEVIC J., RASTALL R.A., GIBSON G.R. 2004. Developing a quantitative approach for
determining the in vitro prebiotic potential of dietary oligosaccharides. FEMS Microbiology Letters 236: 153-159.
SORAL-ŚMIETANA M., WRONKOWSKA M., BIEDRZYCKA E., BIELECKA M., OCICKA K. 2005.
Native and physically-modified starches-utilization of resistant starch by Bifidobacteria
(In Vitro). Polish J. of Food and Nutrition Sci. 14(55): 3.273-279.
WRONKOWSKA M., SORAL-ŚMIETANA M., KRUPA U., BIEDRZYCKA E. 2006. In vitro fermentation of new modified starch preparations - changes of microstructure and bac-
416
J. Le Thanh i inni
terial end-products. Enzyme and Microbial Techn. 40: 93-99.
Słowa kluczowe:
skrobia, prebiotyk,
tłuszczowe
Lactobacillus,
krótkołańcuchowe
kwasy
Streszczenie
śywność funkcjonalna czyli produkty spoŜywcze wykazujące pozytywny (ponad
efekt odŜywczy) wpływ na organizm człowieka budzą coraz większe zainteresowanie,
zarówno konsumentów, jak i technologów Ŝywności. Szczególną rolę odgrywają
wchodzące często w jej skład substancje o charakterze prebiotycznym, tj. niestrawne
węglowodany, które selektywnie stymulują wzrost i/lub aktywność jednego lub kilku
szczepów bakterii probiotycznych (Bifidobacterium, Lactobacillus) obecnych w jelicie
grubym. Przykładem produktów będących źródłem substancji prebiotycznych są
produkty skrobiowe zawierające tzw. skrobię oporną. Wcześniejsze prace wykonane w
Katedrze Biotechnologii i Mikrobiologii śywności Uniwersytetu Przyrodniczego w
Poznaniu wykazały, Ŝe skrobia modyfikowana fizycznie na drodze wysokociśnieniowej
homogenizacji kleiku wykazuje strawność in vitro rzędu 50%. Celem pracy była ocena
prebiotycznych właściwości skrobi modyfikowanej fizycznie otrzymanej na drodze
wysokociśnieniowej homogenizacji kleików skrobiowych poprzez określenie zdolności
mikroorganizmów z rodzaju Lactobacillus do wykorzystywania jej jako źródła węgla.
Cztery probiotyczne szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus (L. acidophilus, L.
casei, L. plantarum, L. ramnosus) hodowano w podłoŜach MRS zawierających jako
źródło węgla zamiennie: glukozę, maltodekstrynę niskoscukrzoną, skrobię
ziemniaczaną natywną, oraz skrobię modyfikowaną fizycznie na drodze homogenizacji
wysokociśnieniowej. Zakres badań obejmował określanie intensywności wzrostu
badanych mikroorganizmów oraz poziomu produkcji krótkołańcuchowych kwasów
tłuszczowych metodą HPLC. Oznaczono ponadto rozkład mas cząsteczkowych
wszystkich badanych preparatów skrobiowych.
Stwierdzono, Ŝe wysokociśnieniowa homogenizacja kleiku powoduje częściową
degradację makrocząsteczek skrobi oraz zmianę konformacyjną frakcji amylopektyny
poprawiającą termodynamiczną zgodność polimer-rozpuszczalnik w układzie polimerwoda. Wprowadzenie skrobi modyfikowanej fizycznie do podłoŜa MRS zamiast
glukozy powodowało zmianę przebiegu hodowli wszystkich badanych szczepów
Lactobacillus. UŜycie jako źródła węgla maltodekstryny zamiast glukozy nie wpłynęło
zarówno na maksymalną szybkość wzrostu jak i na liczebność komórek Lactobacillus.
Hodowlana w podłoŜu ze skrobią ziemniaczaną natywną charakteryzowała się niŜszą
intensywnością wzrostu badanych bakterii oraz najdłuŜszym czasem trwania fazy
wzrostu wykładniczego w odniesieniu do pozostałych źródeł węgla. W przypadku
zastosowania podłoŜa ze skrobią modyfikowaną fizycznie jako źródłem węgla,
maksymalna liczebność komórek Lactobacillus była niŜsza od uzyskiwanej w
podłoŜach z formą natywną skrobi, natomiast szybkość wzrostu komórek była
porównywalna dla obu substratów. Zastosowanie wysokocząsteczkowych źródeł węgla,
takich jak naturalna skrobia ziemniaczana oraz skrobia modyfikowana na drodze
wysokociśnieniowej homogenizacji powodowało intensywniejszą produkcję kwasu
octowego niŜ mlekowego. Skrobia modyfikowana fizycznie na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji wywołuje podobne zmiany metabolizmu bakterii
probiotycznych jak znane substancje o charakterze prebiotycznym, tj. trans-galaktooligosacharydy, frukto-oligosacharydy oraz preparaty skrobi opornej.
417
PHYSICALLY MODIFIED STARCH AS A POTENTIAL PREBIOTIC
Joanna Le Thanh, Aneta Burchardt, Joanna Menclewicz,
Anna Sip, GraŜyna Lewandowicz
Department of Biotechnology and Food Microbiology,
University of Life Sciences, Poznań
Key words:
starch, prebiotic, Lactobacillus, short chain fatty acids
Summary
The identification and development of food ingredients that beneficially affect
human organism have attracted much interest recently. Prebiotics i.e. nondigestible
carbohydrates that selectively stimulate the growth and/or activity of one, or a limited
number of probiotic bacteria (e.g. Bifidobacterium, Lactobacillus) present in the colon
seem to be especially important. Several starch products, particularly the so called
resistant starch, are recommended earlier as the health beneficial food ingredients. The
earlier researches performed in the Department of Biotechnology and Food
Microbiology of Poznań University of Life Sciences demonstrated that the process of
high-pressure homogenization of starch pastes led to obtain a product characterised by
the in vitro digestibility of about 50%. The aim of the work was to evaluate the prebiotic
potential of this type of physically modified starch.
In order to estimate the prebiotic potential of physically modified starch, the
growth of four probiotic species of Lactobacillus (L. acidophilus, L. casei, L.
plantarum, & L. ramnosus) was investigated. Maltodextrin (DE = 4.9), native potato
starch, as well as the homogenised starch were applied as the alternative (instead of
glucose) carbon source in the MRS fermentation broth. Moreover, the short chain fatty
acids (SCFA) production was determined. Molecular mass distribution of all starch
preparations was also analysed.
It was found that a high pressure homogenisation of starch pastes resulted in
partial degradation of macromolecules of this polysaccharide, as well as in conformational change which improved the thermodynamic compatibility in polymer-water
system. The application of physically modified starch as a carbon source in the modified
MRS broth affected the growth of all Lactobacilli strains not only in comparison to
glucose, but also to maltodextrin and native starch. The application of maltodextrin as a
carbon source resulted neither in the decrease of the maximal growth rate, nor the
maximum cell vialibility.
In the case of the Lactobacilus culture on the MRS broth containing native potato
starch, the lowering of maximum cell population, the longest duration of exponential
growth phase in comparison to other carbon source as well as the decrease of maximal
growth rate were observed. If modified starch is used as an alternative carbon source,
the decrease of maximum cell population in comparison to native starch is observed, but
the maximal growth rate was the same. The application of high molecular weight carbon
sources i.e. native potato starch and starch modified physically by a high pressure
homogenisation causes more effective production of acetic rather than lactic acid.
Physically modified starch applied as a carbon source in the MRS broth caused
similar changes in the metabolism of Lactobacillus probiotic strains as popular prebiotic
substances i.e. trans-galacto-oligosaccharides, fructo- oligosaccharides and resistant
starch preparations.
418
J. Le Thanh i inni
Mgr Joanna Le Thanh
Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii śywności
Uniwersytet Przyrodniczy
ul. Wojska Polskiego 48
60-627 POZNAŃ
e-mail: maithanh@up,poznan.pl

skrobia modyfikowana fizycznie jako potencjalny prebiotyk

Transkrypt

Podobne dokumenty

Osłonka Derma x 10 sasz - Apteka Internetowa Tanie

Compliflora femina x 10 kaps - Tanie

Latopic x 30 sasz - Apteka Internetowa Tanie

Ulotka LacidoForte do ściągnięcia.

Acidophilus 250 vkapsułek

SANPROBI Super Formula

Konferencja naukowo

ProBacti dziecko jest połączeniem probiotyku i