NOVABEADS Oligo(dT)25 NANO PARTICLES

NOVABEADS Oligo(dT)25 NANO PARTICLES
NOVABEADS Oligo(dT)25 NANO PARTICLES
Nanocząstki magnetyczne opłaszczone Oligo(dT)
Nanoczastki magnetyczne NOVABEADS Oligo(dT)25 NANO PARTICLES zostały zaprojektowane
do szybkiej izolacji mRNA z całkowitego eukariotycznego RNA oraz z ekstraktów komórkowych,
tkanek zwierzęcych i roślinnych. Wyizolowany mRNA można wykorzystać w większości technik
biologii molekularnej takich jak:












reakcja RT-PCR
konstruowanie bibliotek cDNA
analizowanie aktywności nukleazy S1
ilościowa ocena mRNA techniką RPA (ang. Ribonuclease Protection Assay)
wyznaczanie miejsca startu transkrypcji (ang. primer extension)
hybrydyzacja Dot Blot i Slot Blot
translacja in vitro
analiza końców RNA techniką RACE (ang. Rapid Amplification of
3’ or 5’ cDNA Ends)
subtraktywna hybrydyzacja cDNA
analiza Northern Blot
klonowanie genów
analiza ekspresji genów.
Zaletą metody jest możliwość wykonania szybkiej izolacji w czasie 15 minut, bez konieczności
uprzedniej obróbki RNA oraz z pominięciem etapów oczyszczania próbki. Złoże magnetyczne
zawierające Oligo(dT)25 może zostać wykorzystane także do unieruchomienia mRNA i syntezy cDNA
na drodze odwrotnej transkrypcji. Ponadto silne kowalencyjne wiązanie pomiędzy Oligo(dT)25,
a kulkami magnetycznymi, umożliwia przeprowadzenie regeneracji złoża w celu jego powtórnego
wykorzystania.
1
:
Izolacja mRNA z wykorzystaniem NOVABEADS Oligo(dT)25 NANO PARTICLES opiera się
o zasadę wiązania pomiędzy ogonem poli(A) w sekwencji izolowanego mRNA z ogonami
Oligo(dT)25 znajdującymi się na powierzchni kulek magnetycznych. Po przyłączeniu się mRNA do
powierzchni złoża magnetycznego próbkę umieszcza się w statywie magnetycznym w celu
osadzenia złoża ze związanym mRNA na ścianie probówki. Supernatant zawierający niezwiązane
cząstki zostaje usunięty.
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
Zasada działania
NOVABEADS Oligo(dT)25 NANO PARTICLES
PROTOKÓŁ UŻYTKOWANIA
Płukanie złoża
1. Wymieszać złoże do momentu uzyskania czarno-brązowej zawiesiny. Przenieść 200 µl (1 mg)
złoża do nowej probówki.
2. Umieścić probówkę w statywie magnetycznym na 1–2 min, a po osadzeniu cząstek
magnetycznych na ściance probówki dokładnie usunąć supernatant.
3. Zdjąć probówkę ze statywu magnetycznego i wytrząsając
w 100 µl Binding Buffer. Inkubować 5 min w temp. pokojowej.
rozprowadzić
złoże
4. Umieścić probówkę w statywie magnetycznym i odczekać 1-2 min, a po osadzeniu cząstek
magnetycznych na ściance probówki usunąć supernatant.
5. Ponownie dodać 100 µl Binding Buffer i mieszając rozprowadzić złoże w buforze.
Tak przygotowane złoże zostawić w temp. pokojowej i rozpocząć przygotowywanie lizatu do
izolacji mRNA.
Przygotowanie lizatów do izolacji mRNA
Zalecane ilości materiału do przygotowania lizatu
Przygotowanie lizatów z tkanki zwierzęcej i tkanki roślinnej
1. Odważyć odpowiednią ilość tkanki. Nadmiar tkanki może zmniejszyć wydajność izolacji oraz
czystość uzyskanego mRNA.
2. Zamrożoną
w
ciekłym
azocie
tkankę
rozetrzeć
Nie można dopuścić do rozmrożenia materiału podczas rozcierania.
w
moździerzu.
3. Natychmiast przenieść roztartą tkankę do homogenizatora i dodać 1 mL Lysis/Binding Buffer.
Homogenizować około 1-2 min, do czasu całkowitego zlizowania się tkanki.
Szybkie przeprowadzenie lizy w Lysis/Binding Buffer zapobiega degradacji mRNA.
4. Próbkę wirować 30-60 sekund, po czym supernatant przenieść do nowej probówki, a osad
odrzucić.
5. Lizat jest gotowy do izolacji mRNA.
W przypadku późniejszej izolacji, lizat może zostać zamrożony w -80 °C.
Przygotowanie lizatu z hodowli komórkowych oraz zawiesiny komórek
1. Zawiesić komórki w buforze PBS 1x i wirować do momentu uzyskania osadu komórek.
2. Usunąć supernatant, a osad wykorzystać bezpośrednio do izolacji, bądź zamrozić w ciekłym
azocie lub -80 °C.
6
3. Do osadu komórek (1-4 x 10 komórek) dodać 1 mL Lysis/Binding Buffer i kilkukrotnie
przepipetować roztwór, aby dokładnie zlizować komórki.
2
:
ILOŚĆ
20-50 mg
100 mg
6
1-4 x 10 komórek
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
RODZAJ MATERIAŁU
tkanka zwierzęca
tkanka roślinna
hodowla komórkowa
NOVABEADS Oligo(dT)25 NANO PARTICLES
4. Należy zredukować lepkość roztworu poprzez dodatkowy etap cięcia DNA. W tym celu lizat
należy przepuścić trzykrotnie przez igłę 21G, za pomocą 1-2 mL strzykawki. Podczas etapu
cięcia może wytworzyć się piana, którą należy usunąć poprzez 30 sekundowe zwirowanie
próbki.
5. Lizat jest gotowy do izolacji mRNA.
W przypadku późniejszej izolacji, lizat może zostać zamrożony w - 80 °C.
Izolacja mRNA z surowego lizatu
1. Probówkę z przepłukanym uprzednio złożem wstawić do statywu magnetycznego, a po
osadzeniu cząstek magnetycznych na ściance probówki usunąć supernatant.
2. Do cząstek magnetycznych dodać całą objętość przygotowanego lizatu.
3. Całość wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3-5
W przypadku lepkich roztworów czas przyłączania mRNA do złoża można wydłużyć.
min.
4. Umieścić probówkę w statywie magnetycznym na 1–2 min, a po osadzeniu cząstek
magnetycznych na ściance probówki usunąć supernatant.
5. Przepłukać złoże, dodając do cząstek magnetycznych 1
Dokładnie wymieszać zawartość probówki (nie worteksować).
mL Washing Buffer A.
6. Umieścić probówkę w statywie magnetycznym na 1–2 min, a po osadzeniu cząstek
magnetycznych na ściance probówki usunąć supernatant.
8. Jeśli izolowany mRNA jest wykorzystywany np. do syntezy cDNA na stałym podłożu,
wówczas należy przeprowadzić dwa dodatkowe etapy płukania.
Pierwsze płukanie – 500 µl Washing Buffer B.
Drugie płukanie – 500 µl buforu enzymatycznego (stosowany w reakcjach enzymatycznych
downstream).
9. Jeśli izolowany mRNA będzie eluowany ze złoża, należy umieścić probówkę w statywie
magnetycznym, a po osadzeniu cząstek magnetycznych na ściance probówki bardzo
dokładnie usunąć supernatant (Washing Buffer B).
Następnie do złoża należy dodać 10-20 µl 10 mM Tris-HCl i inkubować 2 min
w temp. 75-80 °C. Umieścić probówkę w statywie magnetycznym, po czym natychmiast
przenieść supernatant zawierający mRNA do nowej, wolnej od RNaz probówki umieszczonej
w lodzie.
Oczyszczanie mRNA z preparatu całkowitego RNA
1. 75 µg całkowitego RNA rozpuścić w 100 µl wody DEPC lub 10 mM Tris-HCl pH 7.5.
2. Dodać 100 µl Binding Buffer i inkubować 2 min w temp. 65 °C. Po inkubacji natychmiast
umieścić probówkę w lodzie.
Jeśli końcowe stężenie RNA jest wyższe niż 75 mg/100 µl należy proporcjonalnie zwiększyć
objętość Binding Buffer.
3
:
Dokładne mieszanie złoża w Washing Buffer A i B pozwala usunąć zanieczyszczenia,
niespecyficznie wiążące się ze złożem.
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
7. Następnie przepłukać złoże dodając 1 mL Washing Buffer B. Dokładnie wymieszać zawartość
probówki (nie worteksować).
NOVABEADS Oligo(dT)25 NANO PARTICLES
3. Dodać 200 µl całkowitego RNA do 100 µl przepłukanego złoża magnetycznego. Na każde
75 µg RNA należy zastosować 1 mg złoża uprzednio przepłukanego i zawieszonego
w 100 µl Binding Buffer.
4. Całość wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej mieszając na mieszadle
magnetycznym przez 5 min.
5. Umieścić probówkę w statywie magnetycznym na 1–2 min, a po osadzeniu cząstek
magnetycznych na ściance probówki usunąć supernatant.
6. Złoże zawiesić w 200 µl Washing Buffer B poprzez kilkukrotne przepipetowanie roztworu.
7. Umieścić probówkę w statywie magnetycznym na 1–2 min, a po osadzeniu cząstek
magnetycznych na ściance probówki usunąć supernatant.
8. Powtórzyć etap płukania z punktów 6-7.
9. Jeśli elucja mRNA ze złoża nie jest wymagana, należy wykonać dodatkowe płukanie cząstek
magnetycznych z wykorzystaniem tego samego buforu, który jest stosowany w aplikacjach
downstream (tj. odwrotna transkrypcja, bufor do syntezy pierwszej nici - bez enzymu).
Następnie należy ponownie zawiesić kulki w odpowiedniej objętości tego buforu.
10. Jeśli elucja mRNA ze złoża jest wymagana, należy zawiesić złoże w 10-20 µl
10 mM Tris-HCl. Próby inkubować 2 min w 75-80 °C.
11. Umieścić probówkę w statywie magnetycznym, po czym natychmiast przenieść supernatant
zawierający mRNA do nowej, wolnej od RNaz probówki umieszczonej w lodzie.
Regeneracja złoża
1. Aby uniknąć przeniesienia mRNA pomiędzy próbkami koniecznie jest trzykrotne przepłukanie
złoża w 200 µl Reconditioning Solution.
W trakcie pierwszego płukania próbę należy inkubować 2 min w 65 °C.
2. Następnie należy przepłukać złoże w 200 µl Storage Buffer Oligo(dT) do momentu ustalenia
pH poniżej 8.0.
3. Złoże należy zawiesić w żądanej objętości Storage Buffer Oligo (dT).
Tak przygotowane złoże jest gotowe do izolacji mRNA. Złoże należy przechowywać w temp.
+ 2-8 °C. Nie należy worteksować złoża w wyjściowej zawiesinie!
Powtórne wykorzystanie złoża (ta sama próbka)
Powtórne wykorzystanie złoża do izolacji mRNA z tej samej próbki (bez regeneracji złoża)
umożliwia izolację większej ilości mRNA z tego samego preparatu całkowitego RNA.
1. Po elucji mRNA należy przepłukać złoże w 300 µl Lysis/Binding Buffer.
2. Następnie należy przenieść złoże do próbki i kontynuować izolację mRNA.
Izolacja może być powtarzana kilkukrotnie do momentu całkowitego wychwycenia mRNA
z badanej próbki.
4
:
Sekwencje oligo(dT)25 są kowalencyjnie związane z powierzchnią kulek, co umożliwia hybrydyzację,
a także regenerację złoża w celu jego wielokrotnego wykorzystania. Złoże po pierwszej regeneracji
może być wykorzystane jeszcze czterokrotnie.
Jeśli mRNA jest izolowany z tej samej próbki, złoże może być powtórnie wykorzystane bez
wcześniejszej regeneracji.
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
Regeneracja oraz powtórne wykorzystanie złoża
NOVABEADS Oligo(dT)25 NANO PARTICLES
WSKAZÓWKI TECHNICZNE
Przygotowanie mRNA do dalszych badań
W celu przeprowadzenia analizy Northern, mRNA może być eluowany bezpośrednio do buforu
obciążającego, zawierającego formamid, po czym może zostać nałożony na żel.
Jeśli mRNA ma zostać wykorzystany do analiz enzymatycznych (tj. synteza cDNA, translacja, RT-PCR
itd.), wówczas do końcowego etapu płukania oraz elucji nie należy dodawać detergentu. Reakcja
enzymatyczna nie zostanie zahamowana przez obecność złoża magnetycznego.
Możliwe jest konstruowanie bibliotek cDNA na stałym podłożu, specyficznych dla danego typu
komórek lub tkanek, bezpośrednio na powierzchni kulki. Kowalencyjnie znakowane sekwencje
Oligo(dT)25 mogą być wykorzystane zarówno do wychwytywania mRNA, a także jako starter do
reakcji odwrotnej transkrypcji, w celu syntezy pierwszej nici cDNA. To skutkuje powstaniem
biblioteki cDNA ze znakowaną kowalencyjnie pierwszą nicią cDNA.
Przed użyciem złoże należy wymieszać do momentu uzyskania homogennej zawiesiny.
Nie należy worteksować złoża!

Złoże należy przechowywać w postaci ciekłej zawiesiny.

Całkowite usunięcie z probówki resztek buforów w trakcie płukania jest niezmiernie ważne,
zwłaszcza podczas izolacji mRNA z preparatów o małych objętościach.

Podczas izolacji mRNA z komórek izolowanych za pomocą izolacji immunomagnetycznej (IMS),
przed nałożeniem specyficznego złoża magnetycznego należy się upewnić, że całe złoże
wykorzystane do IMS zostało usunięte.

Zaleca się wykorzystanie mRNA jako matrycy do RT-PCR bezpośrednio po izolacji.
Jeśli przechowywanie próbki jest konieczne, należy bezpośrednio po elucji zamrozić uzyskany
mRNA.

Inhibitory RNaz mogą zostać dodane na każdym etapie izolacji, jednakże nie jest to niezbędne.
W przypadku konieczności przechowywania mRNA należy dodać inhibitory RNaz podczas
elucji ze złoża.
Unikanie kontaminacji
Aby uzyskać wysokiej jakości eukariotyczny mRNA należy zminimalizować aktywność RNaz. Należy
przestrzegać środków ostrożności w celu zabezpieczenia próbki przed zanieczyszczeniem
rybonukleazami (nie dotykać próbek bez rękawiczek, używać rękawiczek pozbawionych RNaz, przed
rozpoczęciem izolacji zakładać czyste rękawiczki).
5
:

Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
Zalecenia
NOVABEADS Oligo(dT)25 NANO PARTICLES
Roztwory
Z wody oraz wszystkich roztworów użytych do izolacji RNA należy usunąć RNazy
np. poprzez dodanie eteru dietylowego kwasu pirowęglowego (DEPC). Jeśli jest to możliwe, do
roztworów należy dodać 0.1% DEPC, inkubować w temp. 37 °C przez co najmniej 1 godzinę,
a następnie ogrzewać 15 min w temp. 100 °C w celu usunięcia resztek DEPC.
DEPC jest potencjalnym karcinogenem, więc należy zachować szczególną ostrożność pracując z tym
odczynnikiem.
Do buforów zawierających Tris-HCl NIE NALEŻY dodawać DEPC, ponieważ Tris inaktywuje DEPC.
Wówczas DEPC należy dodać do buforu przed dodaniem Tris-HCl i autoklawować. Następnie dodać
do buforu Tris-HCl i ponownie autoklawować bufor.
INFORMACJE OGÓLNE
Opis materiału
NOVABEADS Oligo(dT)25 NANO PARTICLES są jednolitym paramagnetycznym polimerem,
złożonym z kowalencyjnie sprzężonych z powierzchnią kulek magnetycznych, cząstek
z sekwencjami oligo(dT)25. Kulki są doprowadzone do postaci zawiesiny o stężeniu 100 mg/500 µl
w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7.5, zawierającym 0,02% NaN3, będącego
środkiem konserwującym.
Pojemność złoża magnetycznego
Jeśli to samo złoże jest powtórnie wykorzystywane dla tej samej próbki, całkowita pojemność 1 mL
złoża wynosi około 50 µg mRNA.
SKŁAD BUFORÓW
Bufory wykorzystane w tej metodzie są powszechnie wykorzystywane w oczyszczaniu mRNA.
Binding Buffer:
20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM EDTA
Lysis/Binding Buffer:
100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA
1% LiDS, 5 mM dithiothreitol (DTT).
Jeśli dojdzie do wytrącenia się któregoś z odczynników, bufor należy ogrzać do temperatury
pokojowej i wymieszać do momentu rozpuszczenia się osadu.
Washing Buffer A:
10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ,0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% LiDS
Washing Buffer B:
10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ,0.15 M LiCl, 1 mM EDTA
Reconditioning Solution:
0.1 M NaOH
Storage Buffer:
250 mM Tris-HCl,
0.02% NaN3
pH
7.5,
20
mM
EDTA,
0.1%
Tween-20,
6
:
Całkowita pojemność 1 mL złoża to około 10 µg mRNA.
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
Za pomocą 200 µl (1 mg) złoża magnetyczngo można wyizolować ponad 2 µg poli(A)-RNA. Ilość
wyizolowanego RNA zależy przede wszystkim od rodzaju tkanki, czy hodowli komórkowej, a także
od poziomu ekspresji mRNA w danym typie tkanek. Typowa komórka ssaków zawiera około
10-30 pg całkowitego RNA, z czego 1-5% to frakcja mRNA.
NOVABEADS Oligo(dT)25 NANO PARTICLES
Stabilność i przechowywanie
Zamknięty i przechowywany w 2-8 °C produkt jest stabilny do czasu upływu daty ważności podanej
na opakowaniu.
Produktu nie należy zamrażać.
Przed użyciem wszystkie odczynniki należy dokładnie wymieszać.
Złoża magnetycznego nie należy przechowywać w wodzie destylowanej.
Uwaga!
7
:
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań,
tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0 61 610 39 11, email: [email protected]
Produkt ten jest przeznaczony wyłącznie do badań laboratoryjnych (research use only).
Produkt zawiera 0.02% azydek sodu (NaN3), który może wchodzić w reakcję z miedzianą oraz
ołowianą kanalizacją.