Wykłady 5 i 6 (2 strony) - Instytut Chemii Organicznej PAN

SPEKTROMETRIA MAS W CHEMII
ORGANICZNEJ, ANALITYCZNEJ
I BIOCHEMII
WYKŁADY 5 i 6
METODY JONIZACJI – CZĘŚĆ II
Witold Danikiewicz
Instytut Chemii Organicznej PAN, Warszawa
1
ELEKTROSPREJ
(ESI)
Electrospray Ionization
2
Nobel 2002
John B. Fenn
1917 - 2010
3
Źródło jonów ESI skonstruowane przez J. Fenna
M. Mann, S. Shen i J. B. Fenn
„Electrospray Mass Spectrometry” w:
Mass Spectrometry in the Biological
Sciences: A Tutorial, Ed. M. L. Gross,
Kluver Academic Publishers, Dordrecht
1992.
4
Źródło jonów ESI w spektrometrze Mariner
5
Mechanizm przechodzenia jonów do fazy gazowej
w technice ESI
ETAP 1
Tworzenie aerozolu podczas wypływu cieczy z kapilary w polu
elektrycznym
kapilara
gaz rozpylający
6
Mechanizm przechodzenia jonów do fazy gazowej
w technice ESI
ETAP 2 (powtarza się wielokrotnie)
Odparowanie rozpuszczalnika z kropli i jej rozerwanie
(„eksplozja kulombowska”) po przekroczeniu bariery Raleigha
+
+––––+
+
+ +– + +
+ –– – +
– +
+–
–
+ –– – –– +
++ + +
+
odparowanie
rozpuszczalnika
+++
+ –– –– +
+ –– – +
+ ++
+–
+–– –+
+
"eksplozja
kulombowska"
+
+––––+
+
po przekroczeniu
bariery Raleigha
+
+––––+
+
+
+––––+
+
7
Mechanizm przechodzenia jonów do fazy gazowej
w technice ESI
ETAP 3 – Wariant „desorpcja z kropli”
Desorpcja jonu z kropli do fazy gazowej w wyniku działania
pola elektrycznego
+++
+ –– –– +
+–– – +
+ ++
desorpcja jonu w wyniku
działania pola elektrycznego
(średnica kropli
ok. 10 nm)
+
++
+ –– – +
+–– –– +
+ ++
8
Mechanizm przechodzenia jonów do fazy gazowej
w technice ESI
ETAP 3 – Wariant „odparowanie do sucha”
W wyniku dalszego odparowywania rozpuszczalnika powstają
częściowo solwatowane jony naładowane wielokrotnie –
mechanizm ten dotyczy dużych, polarnych cząsteczek
+++
+ –– –– +
+–– – +
+ ++
dalsze odparowywanie rozpuszczalnika i podziały kropli
(średnica kropli
ok. 10 nm)
++
++
jon naładowany
wielokrotnie
++
–+
+–– –+
++
9
Schemat źródła jonów electrospray
w spektrometrach API 365 i API 3000
Gaz
rozpylający
(N2)
Dysza
Płytka
osłonowa
Ciśnienie
atmosferyczne
Kapilara
stalowa
Przechodzenie jonów
do fazy gazowej
Roztwór
próbki
Zbierak
Pierścień
Q0
~ 2 Torr
8 x 10-3 Torr
Pompa
wstępna
Pompa
turbomolekularna
Gaz osłonowy (N2)
10
Zasada działania źródła jonów typu
„TurboIonSpray”
11
Źródła jonów typu „TurboIonSpray” i „Turbo V”
12
Zasada działania źródła jonów typu
„MicroIonSpray”
13
Źródło jonów ESI firmy Agilent
14
Źródło jonów typu Z-SPRAY
15
Źródła jonów ESI - podsumowanie
Typ źródła
Przepływ próbki
TurboIonSpray, V-Spray
50 – 3000 µl/min
Electrospray lub IonSpray
1 – 50 µl/min
Microspray
50 – 1000 nl/min
Nanospray
1 – 100 nl/min
Podstawowa zasada: im mniejszy przepływ tym większa czułość.
16
Widma EI i ESI nadkaprylanu metylu
100
90
57
EI 70 eV
41
80
[M – O2CH3 ]+
70
60
O
127
55
O
O
50
40
CH3
M = 174
30
60
74
20
83
69
87 97
10
105
115
0
60
80
100
M/z
120
140
160
180
200
197.1
100
M+Na+
90
ESI w MeOH
80
% Intensity
40
70
M+H+
60
175.1
50
2M+Na+
40
371.2
30
20
10
192.2
213.1
166.1
0
150
279.2
200
250
M ass (m/z)
301.2
339.2
300
350
400
17
Widmo ESI związku o małej cząsteczce
(M = 397, MeOH, jony dodatnie)
2M + Na+
Spec #1[BP = 817.4, 2132]
817.3
100
Ph
90
80
60
O
M + Na+
M + H+
OH
420.2
398.2
Ph
O
818.4
M = 397
50
2132
O
N
70
% Intensity
% Intensity
43
40
M + K+
30
436.2
20
616.3
819.4
623.7
10
0
300
420
540
660
780
0
900
Mass (m/z)
18
Widma ESI w trybie jonów dodatnich i ujemnych pochodnej
binaftylu o masie 344 u, zawierającej grupy OH i COOH
Spec #1[BP = 201.0, 724]
? 201.0
100
90
COOH
724
ESI (+)
?
80
(OH) m
225.2
70
50
(OH) n
F
279.1
F
149.0
40
? F
?
301.1
30
239.2
205.1
Spec #1[BP = 343.1, 2675]
367.1
[2M +
20
0
100
155.1
241.2
240
F
391.3
485.8
380
711.2
90
712.2
80
579.3
520
0
800
660
343.1
100
Na+]+
2675
H+]–
[M –
ESI (-)
70
Mass (m/z)
60
% Intensity
10
50
40
30
344.1
20
10
345.1
187.0
0
100
240
380
520
Mass (m/z)
660
0
800
19
Widmo ESI peptydu o masie 2524,6 u
Spec /1:8[BP = 632.1, 2248]
632.1
100
2248
[M + 4H+]4+
842.51
90
842.85
80
∆M = 0,33
842.18
843.18
70
60
% Intensity
% Intensity
60
[M +
5H+]5+
n=3
843.53
50
[M + 3H+]3+
40
842.5
30
603.9
20
505.9
441.3
[M + 2H+]2+
660.4
10
880.5
0
400
840
1263.3
1280
1720
2160
0
2600
Mass (m/z)
ESI w MeOH
20
Widmo ESI peptydu o masie 3377 u
[M+4H+]4+
Spec /1:14[BP = 846.1, 396]
846.17
100
396.2
846.17
∆M ≈ 0,25 ⇒ n = 4
845.92
90
846.33
846.68
80
846.93
845.67
70
∆M
50
40
[M+3H+]3+
30
[M+5H+]5+
20
1127.88
Spec /1:14=>DECONV[BP = 3380.5, 571]
676.95
3380.64
571.1
100
3379.63
10
90
3381.68
0
500
740
980
1220
Mass (m/z)
80
1460
1700
70
3382.58
60
% Intensity
% Intensity
60
50
3378.64
40
3383.58
3384.48
3393.58
30
20
10
0
3367.0
3376.6
3386.2
3395.8
3405.4
3415.0
21
Mass (m/z)
WIDMO ESI PEPTYDU O MASIE 16952 Da
16952.20
Widmo po
dekonwolucji
m2
m1 = (M + n)/n
m1
m2 = (M + n + 1)/(n + 1)
n = (m2 – 1)/(m1 – m2)
M=
( m2 − 1)( m1 − 1)
m1 − m2
22
Widmo ESI(+) dimeru albuminy wołowej
23
Widmo ESI(-) syntetycznego oligonukleotydu
24
Widmo ESI kompleksu w MeOH – roztwór świeżo
przygotowany
Spec #1[BP = 309.2, 8991]
[L + H+]+
309.2
100
8991
[2L+Co2+]2+
L + CoCl2 w MeOH
337.7
90
80
[L+Co2++Cl-]+
70
% Intensity
402.1
[3L+Co2+]2+
60
491.8
50
[2L+Co2++Cl-]+
40
[L+Co2++MeOH]2+
710.3
30
199.6
20
404.1
183.5
10
0
712.3
232.6
249.6
100
645.9
617.4
280
460
[2L+2Co2++3Cl-]+
768.3
640
839.2
842.2
820
0
1000
M ass (m /z)
25
Widmo ESI kompleksu w MeOH –
– roztwór po 1 godzinie
[L + 2H+]2+
100
Spec #1[BP = 155.1, 4153]
155.1
4153
L + CoCl2 w MeOH
90
[L + H+]+
80
309.2
70
% Intensity
60
50
40
30
20
182.0
10
294.2
331.2
210.0
0
100
280
460
640
820
0
1000
Mass (m/z)
26
Widmo ESI kompleksów 18-C-6 z kationami litowców
349.2
M + Rb+
O
M + Cs+
O
O
397.2
O
O
O
M = 264
18-C-6 + NaCl + RbCl + CsCl
(1:1:1:1) w MeOH−H2O (7:3)
(bez K+ !)
351.2
M + K+
M + Na+
303.1
2M + Cs+
287.1
661.5
282.1
260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
m/z, amu
27
Widma ESI kompleksów eterów makrocyklicznych
z kationami litowców
M + Na+
O
313.3
O
O
O
NH
HN
O
OCH3
O
O
N
M = 290
O
Ligand + NaCl + KCl + RbCl + CsCl
(1:1:1:1:1) w MeOH−H2O (7:3)
M+
329.2
269.4
285.3
M+
O
Na+
O
625.5
O
N
K+
M + Rb+ M + Cs+
375.3
M + K+
M = 602
O
OCH3
423.1
M + Cs+
2M + Na+
377.3
527.4
Ligand + NaCl + KCl + RbCl + CsCl
(1:1:1:1:1) w MeOH−H2O (7:3)
735.3
603.5
641.4
M + Rb+
260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640
m/z, amu
2M + K+
687.2
2M + Rb+
689.2
2M + Na+
1227.7
1243.8
650
700
750
800
850
900
950
2M + Cs+
1289.7 1337.7
1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350
m/z, amu
28
Widmo ESI w MeOH związku o masie 451 Da
M + Na+
O
Spec /1:13[BP = 474.1, 3323]
474.1621
100
O
Ph
90
N
Tos
80
C26H29NO4S M = 451
70
2M + Na+
% Intensity
60
925.3404
50
40
30
[3M + Fe2+]2+
20
304.2566
704.7437
511.2571
10
294.0725
553.3115
0
250
400
550
700
850
1000
Mass (m/z)
29
Fragment widma ESI w MeOH związku o masie 451 Da
odpowiadający jonowi [3M + Fe2+]2+ oraz widmo
obliczone dla podanego wzoru
O
Spec /1:13[BP = 474.1, 3323]
704.74
100
% Intensity
90
80
70
Widmo
zmierzone
705.25
O
Ph
705.74
60
Tos
50
40
C26H29NO4S M = 451
706.25
30
706.75
20
10
0
N
703.74
703.0
704.25
707.25
704.2
705.4
706.6
707.8
709.0
707.8
709.0
ISO:C78H87N3O12S3Fe[BP = 704.7, 100]
704.74
100
90
% Intensity
80
705.24
Widmo
obliczone
70
705.74
60
50
40
706.24
30
20
10
0
703.0
703.74
706.74
704.24
704.2
707.24
705.4
706.6
Mass (m/z)
30
Widmo ESI w MeOH
estru metylowego N-FMOC-proliny
O
M+
100
Na+
N
3M + Ca2+
374.1
OCH3
546.7
90
547.2
O
O
3M + Fe2+
554.7
80
M = 351
70
555.2
3M +
60
Mg2+
547.7
555.7
539.7
50
539.2
40
30
725.3
M + H+
2M + Na+
352.2
20
546.7
554.7
10
539.7
0
300
400
500
600
700
800
31
JONIZACJA CHEMICZNA
POD CIŚNIENIEM
ATMOSFERYCZNYM
(APCI)
Atmospheric Pressure Chemical
Ionization
32
Jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym
(APCI)
33
Widmo APCI(-) digoksyny w układzie
MeOH/CHCl3
O
Molecular Weight = 780.9588
Exact Mass = 780.4296
Molecular Formula = C41H64O14
O
[M + Cl-]
OH
CH3
-Q1: 14.074 to 15.247 minfrom CH3ClDigoxin.wiff
CH3
Max. 2.6e6 cps.
815.6
2.6e6
CH3
O
OH
O
O O
O
2.0e6
OH
O
1.8e6
389.2 + 1 + 35 = 425.2
OH
519.3 + 1 + 35 = 555.3
HO
685.6
2.2e6
CH3
CH3
2.4e6
OH
1.6e6
555.2
1.4e6
817.6
1.2e6
649.4 + 1 + 35 = 685.4
780.4 + 35 = 815.4
687.6
425.2
1.0e6
8.0e5
557.6
6.0e5
427.5
4.0e5
2.0e5
211.3
295.6
0.0
200
250
300
389.6
350
407.7
400
519.6 537.7
450
500
550
600
m/z, amu
649.8 667.7
650
700
779.9 797.8
750
800
850
900
34
Cechy charakterystyczne metod ESI i APCI
zakres mas 10 – 100 000 (do 2000 dla APCI)
związki polarne (ESI) i niepolarne (APCI) wprowadzane w
roztworach lotnych rozpuszczalników
współpraca z analizatorami magnetycznymi, kwadrupolowymi,
pułapkami jonowymi i TOF: możliwość badania fragmentacji
wysokoenergetycznych i niskoenergetycznych oraz wykonywania
dokładnych pomiarów masy
możliwość bezpośredniej współpracy z HPLC
mała wrażliwość na zanieczyszczenia próbki
brak fragmentacji (ESI) lub niewielka fragmentacja (APCI) nawet
dla bardzo dużych cząsteczek
35
FOTOJONIZACJA
POD CIŚNIENIEM
ATMOSFERYCZNYM
(APPI)
Atmospheric Pressure Photoionization
36
Źródło jonów do APPI
37
Procesy jonizacji w metodzie APPI
38
Porównanie czułości metod APCI i APPI
39
Analiza HPLC-MS mieszaniny wielopierścieniowych
węglowodorów aromatycznych z detekcją APPI
Compound
Mass
Reversed
Phase
(pg on
column)
1 Naphthalene
128
1000
2 Acenaphthylene
152
4000
3 Acenaphthene
154
500
4 Fluorene
166
400
5 Phenanthrene
178
400
6 Anthracene
178
400
7 Fluoranthene
202
400
8 Pyrene
202
400
9 Benz(a)anthracene
228
100
10 Chrysene
228
100
11 Benzo(b)fluoranthene
252
400
12 Benzo(k)fluoranthene
252
400
13 Benzo(a)pyrene
252
40
14 Benzo(g,h,I)perylene
276
100
15 Indeno(1,2,3,c,d)pyrene
276
100
16 Dibenz(a,h)anthracene
278
100
40
DESORPCYJNA JONIZACJA
LASEROWA WSPOMAGANA
MATRYCĄ
(MALDI)
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization
41
Nobel 2002
Koichi Tanaka
ur. 1959 r.
42
Jedno z pierwszych widm MALDI-TOF –
- za to Koichi Tanaka otrzymał Nagrodę Nobla
„Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry„
K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida, T. Matsuo;
Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 151–153.
43
Spektrometr MALDI – TOF
(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization –
– Time Of Flight)
Zależność czasu przelotu
jonu od jego masy
mv 2
2eV
⇒v=
eV =
m
2
Laser
wiązka światła lasera
t=
wiązka jonów
V
droga wiązki jonów = l
Próbka na blaszce
stalowej
Detektor
l
=
v
l
l
=
⋅ m
2eV
2eV
m
m=
2eV 2
⋅t
l2
Znaczenie symboli:
m – masa jonu (kg)
e – ładunek elementarny (C)
V – napięcie przyspieszające (V)
v – prędkość liniowa jonu (m/s)
t – czas przelotu jonu (s)
l – droga wiązki jonów (m)
44
Mechanizm jonizacji w technice MALDI
Impuls laserowy trafia w
powierzchnię próbki (a)
przekazując jej energię, która
powoduje stopienie i
odparowanie cząsteczek
obojętnych i jonów z małego
obszaru próbki (b). Po kilku
nanosekundach cząsteczki
obojętne zostają odpompowane,
a cząstki naładowane (jony) są
wciągane polem elektrycznym
do analizatora spektrometru
masowego (c).
45
Matryce stosowane w technice MALDI
46
Widmo MALDI-TOF β-galaktozydazy
M+H+ 116 336 Da
47
Widmo MALDI-TOF białka (M = 149 190 Da)
48
Widma MALDI-TOF zarejestrowane przy użyciu
lasera podczerwonego i nadfioletowego
49
Widma ESI i MALDI polistyrenu z dodatkiem CF3COOAg
ESI
CH
CH2
n
MALDI
50
Cechy charakterystyczne metody MALDI
zakres mas 100 – 1 000 000
związki polarne, stałe lub nielotne ciecze
mała wrażliwość na zanieczyszczenia próbki
MALDI współpracuje praktycznie tylko z analizatorami TOF
umiarkowana rozdzielczość (w najnowszych spektrometrach
wysoka)
możliwość analizy powierzchni i jej obrazowania
metody badania fragmentacji ciągle wymagają dopracowania
możliwość pełnej automatyzacji wprowadzania próbek i
rejestrowania widm
51
Desorption-Ionization Mass
Spectrometry on Porous
Silicon
(DIOS)
52
Matryce krzemowe stosowane w technice DIOS
53
Widma zarejestrowane
metodą DIOS
a, The DIOS mass spectrum of a mixture of five
peptides (2 pmol each).
b, The DIOS mass spectrum of a mixture of three
small molecules, including caffeine (m/z 196), an
antiviral drug WIN (m/z 357) and reserpine (m/z 609)
(1 pmol each).
c, The DIOS mass spectrum of 10 pmol N-octyl β-Dglucopyranoside (m/z 293) and its sodium adduct ion
(m/z 315). The sodium ion (m/z 23) itself was also
detected.
Desorption–ionization mass spectrometry on
porous silicon; Jing Wei, Jillian M. Buriak
& Gary Siuzdak, Nature, 399 (1999) 243-246.
54
Widma zarejestrowane metodą DIOS
Figure 4. DIOS mass spectra of des-argbradykinin using small quantities of sample
and in the presence of salt. a–d, DIOS mass
spectra with:
a, 7 fmol;
b, 700 attmol;
c, 2 pmol in the presence of a 2M NaCl;
d, 2 pmol in a saturated solution of K3PO4
buffer solution.
All spectra shown were generated from an ntype mesoporous silicon surface modified with
an ethyl phenyl termination; they are the
average of 128 shots with a nitrogen laser
(337 nm) at an intensity, typical of MALDI
experiments, of 2 to 50 mJ per pulse.
Desorption–ionization mass spectrometry on
porous silicon; Jing Wei, Jillian M. Buriak
& Gary Siuzdak, Nature, 399 (1999) 243-246.
55
Surface-Enhanced Laser
Desorption/Ionization
(SELDI)
56
Matryca ProteinChip®
57
Widmo SELDI-TOF mieszaniny peptydów
Fig. 2. SELDI-TOF MS spectra of glucocerebrosidase after tryptic digestion. Positive-ion mass
spectra of peptide products resulting from on-chip tryptic digestion of glucocerebrosidase, as
analyzed by SELDI-TOF MS. The mass/charge (m/z) values of all detected species are shown.
Emilia Caputo, Ramy Moharram, and Brian M. Martin, Analytical Biochemistry 321 (2003) 116–124
58