Zmiany elektroencefalograficzne po uszkodzeniach
Transkrypt
Zmiany elektroencefalograficzne po uszkodzeniach
P R A C A OR YGIN A L NA ISSN 1641–6007 Sen 2001, Tom 1, Nr 1, 13–31 SEN Zmiany elektroencefalograficzne po uszk odzeniach bocznego podwzgórza uszkodzeniach u szczura Electroencephalography in the rat with lesions of the lateral hypothalamus Jolanta Orzeł-Gryglewska Katedra Fizjologii Zwierząt Uniwersytetu Gdańskiego n Abstract EEG after lateral hypothalamic lesions in the rat Introduction. Bilateral electrolytic lesions of the lateral hypothalamus (LH) in the rat results in sleeplessness. The study was aimed to analyze a possible anatomical substrate of the LH hyposomnia within the hypothalamus. Material and methods. In a group of electrolytically lesioned LH rats the intensity of sleep disturbances was confronted with the localization and the extend of destruction of LH area and with topography of known fiber systems of the medial forebrain bundle (MFB). Selective destruction of LH cell bodies by means of bilateral ibotenic acid (IBO) injections (0.3 mg/ /side) and transient inhibition of LH neurons by bilateral microinjections of muscimol (MSC) (0, 25, 50 and 100 ng/side) were performed in separate experiments to evaluate a possible involvement of LH neuronal pericaria as an anatomical substrate of hyposomnia. Waking and sleep were monitored by EEG recorded from the hippocampal and cortical electrodes (one-hour morning sessions in LH and IBO group and 6-hour daily session in MSC group). Percentage amounts of waking, SWS and PS as well as the number and duration of episodes of particular EEG patterns and a latency to fall asleep were calculated in each record. Adres do korespondencji: Katedra Fizjologii Zwierząt Uniwersytetu Gdańskiego ul. Kładki 24 80-822 Gdańsk tel.: (0 58) 301 22 41 wew. 369 faks: (0 58) 301 40 85 Results. It was found that pronounced hyposomnia can follow lesions of LH/MFB area at every level of its antero-posterior axis, from the preoptic area up to the posterior hypothalamus. The most effective lesions transsected projections descending from the preoptic/anterior hypothalamic area (supposedly GABA-ergic projections from the anterior hypothalamus to the posterior hypothalamic and brainstem waking-promoting centers), olfactory structures, ventral striatum and the central amygdaloid nucleus as well as fibers connecting LH with the brainstem reticular formation. No marked effect of IBO lesions on waking-sleep relationship was found. On the other hand, MSC injections caused a dose-dependent increase in waking time, most pronounced at a dose of 50 ng. This effect was blocked by bicuculline. Conclusions. The obtained results suggest that the damage to the intrahypothalamic neurons is not responsible for LH hyposomnia and indicate involvement of fiber system(s) rather than a localized group of neuronal pericaria. Moreover this data give evidence for an involvement of GABA-ergic transmission in the hypothalamus in waking-sleep regulation. Key words: lateral hypothalamus, EEG, sleep regulation www.sen.viamedica.pl 13 SEN 2001, Tom 1, Nr 1 n Wstęp Udział podwzgórza w systemie struktur organizujących cykl snu i czuwania Sen i czuwanie kontrolowane są przez złożony system regulacyjny obejmujący szereg struktur ośrodkowego układu nerwowego. Szczególną rolę w tym systemie odgrywa podwzgórze. Obecnie pojawia się coraz więcej dowodów potwierdzających klasyczną koncepcję Nauty [1] według której w obrębie podwzgórza istnieją dwa ośrodki neuronalne zaangażowane w regulację cyklu senczuwanie: okolica przedwzrokowa/przednie podwzgórze (POAH, preoptic/anterior hypothalamic area) oraz okolica tylnego podwzgórza (PH, posterior hypothalamic area). Pozostają one ze sobą w relacji ujemnego sprzężenia zwrotnego i wywierają wpływ zarówno na wyżej, jak i niżej leżące okolice mózgu, otrzymując jednocześnie zwrotną impulsację z tych struktur [2]. W POAH i w całym podstawnym przodomózgowiu (istota bezimienna, brzuszne pallidum, ramię poziome pęczka przekątnego Broca) zidentyfikowano neurony selektywnie aktywne we śnie wolnofalowym [2]. Obustronne mechaniczne [1], elektrolityczne [4] lub cytotoksyczne [5] zniszczenie tej okolicy powoduje drastyczną redukcję ilości snu wolnofalowego (SWS, slow wave sleep) i snu paradoksalnego (PS) u szczurów i kotów. Elektryczna i chemiczna stymulacja tych struktur wywołuje synchronizację korową i sen behawioralny [6–8]. Ponadto, po długim epizodzie snu wolnofalowego wzrasta ekspresja protoonkogenu c-fos w brzuszno-bocznej okolicy przedwzrokowej, co tłumaczy się wzmożoną aktywnością neuronów tej okolicy, wywołaną samym faktem snu (a nie potrzebą snu) [9]. Przednie podwzgórze jest jednocześnie głównym termoczułym obszarem mózgu ssaków odpowiedzialnym za mechanizm rozpraszania ciepła [10]. Jego uszkodzenie powoduje wzrost temperatury ciała, a stymulacja elektryczna wywołuje wegetatywne i behawioralne reakcje chłodzenia. W opinii Mc Gintego i Szymusiaka [11] zaburzenia snu wywołane przez uszkodzenia okolicy przedniego podwzgórza i podstawnego przodomózgowia mogą być wtórne do zaburzeń termoregulacyjnych powstałych na skutek uszkodzenia. Dostarczono wielu dowodów doświadczalnych na poparcie tej tezy. Wykazano, że w SWS wzrasta aktywność ciepłoczułych neuronów POAH i pęczka przekątnego Broca, natomiast wrażliwe na zimno neurony tych okolic są aktywniejsze w czasie czuwania [12]. Stwierdzono, że ogrzewanie POAH powoduje podczas czuwania zmniejszenie spontanicznych wyładowań neuronów termowrażliwych PH, które w SWS wykazują istotnie niższą aktywność niż podczas czuwania [13]. Również termoczułe neurony podstawnego przodomózgowia na ogrzewanie POAH reagują wzrostem lub zmniejszeniem wyładowań, przy czym większość komó- 14 rek hamowanych w wyniku ogrzewania POAH w warunkach kontrolnych wyładowuje się częściej podczas czuwania niż w SWS [14]. Wykazano, że wzrost temperatury otoczenia i ciała powodują wzrost SWS [15], natomiast supresja PS występująca po podaniu atropiny nie zachodzi przy wzroście temperatury otoczenia [16]. Insomnia, która powstaje po zniszczeniu POAH, cofa się po umieszczeniu zwierzęcia w ciepłym pomieszczeniu [17], zaś lokalne ogrzewanie POAH powoduje sen u zwierząt doświadczalnych [18], a w zapisie EEG powoduje zwiększenie mocy fal delta w czasie SWS [19]. Możliwe więc, że ciepłoczułe elementy przyśrodkowego POAH działają torująco zarówno na mechanizmy ośrodkowe promujące sen, jak i regulujące utratę ciepła. Jednocześnie istnieje wiele wątpliwości dotyczących bezpośredniego związku funkcjonalnego mechanizmów snu i termoregulacji. Chociaż występują one w jednym obszarze anatomicznym, to okazało się, że można je rozdzielić, stosując odpowiednie zabiegi eksperymentalne. Na przykład iniekcje soli fizjologicznej lub samo wprowadzenie igły iniekcyjnej do POAH powoduje ośrodkową hipertermię bez wpływu na cykl sen-czuwanie [20]. Podobny efekt występuje w wyniku niewielkich uszkodzeń POAH. W adrenergiczną regulację temperatury ciała na poziomie POAH zaangażowane są receptory a1, podczas gdy w regulacji snu i czuwania uczestniczą receptory a2 i b [8]. Innym mechanizmem wpływu POAH na cykl sen-czuwanie może być bezpośrednie oddziaływanie tej okolicy na struktury/ośrodki desynchronizacji pnia mózgu zarówno na poziomie układu siatkowatego śródmózgowia, wzgórza, jak i tylnego podwzgórza. W wielu doświadczeniach stwierdzono, że elektryczna stymulacja POAH i jego okolic hamuje wyładowania w neuronach śródmózgowia, aktywnych podczas czuwania i snu paradoksalnego. Wiele neuronów POAH, wykazujących swoisty wzrost aktywności we śnie, można aktywować antydromowo z tworu siatkowatego śródmózgowia. Całe podstawne przodomózgowie zawiera neurony GABA-ergiczne [21], mogące hamować czynność śródmózgowia. Neurony śródmózgowia, znajdujące się pod wpływem POAH i struktur okolicznych, same wysyłają projekcje do wzgórza i w ten sposób regulują aktywność projekcji wzgórzowo-korowych [2]. Ewentualny toniczny wpływ hamujący POAH na tak zwany „ośrodek desynchronizacji” w tylnym podwzgórzu/przednim śródmózgowiu wydają się potwierdzać wyniki badań, w których udało się znieść insomnię po lezjach POAH przez obniżenie aktywności neuronów tylnopodwzgórzowych za pomocą bezpośredniej iniekcji muscimolu [22]. Stymulacja POAH i okolicy pęczka przekątnego Broca wywołuje potencjał IPSP (inhibitory postsynaptic potentials) w okolicy guzowej i suteczkowej tylnego podwzgórza, który można zablokować podaniem bikukuliny i pikrotoksyny [23]. www.sen.viamedica.pl Jolanta Orzeł-Gryglewska, EEG po uszkodzeniach podwzgórza u szczura Oprócz udowodnionego udziału POAH w procesach synchronizacyjnych istnieją też dane wskazujące na związki neuronów tej okolicy z mechanizmami snu paradoksalnego. Lokalne ogrzewanie bądź oziębianie podwzgórza wpływa nie tylko na ilość SWS, ale i PS [18]. W POAH szczurów znaleziono neurony selektywnie aktywne w PS [23] oraz populację neuronów podwzgórzowych, które podczas snu paradoksalnego zmniejszają swoje wyładowania [24] i wrażliwość na temperaturę [25]. Nie wiadomo jednak, czy zmiany aktywności tych komórek wpływają na mechanizmy wykonawcze PS, czy też są wtórne w stosunku do spadku wydzielania noradrenaliny i serotoniny w trakcie snu paradoksalnego [8]. O ile okolica POAH wywiera znamienny wpływ na procesy synchronizacji EEG, to od czasu znanych obserwacji klinicznych von Economo [26] nad encephalitis letargica wiadomo, że okolica tylnego podwzgórza odgrywa ważną rolę w aktywacji korowej i procesach desynchronizacyjnych. Późniejsze, szeroko zakrojone badania przy zastosowaniu transsekcji mózgu i zlokalizowanych uszkodzeń mózgu u kotów, szczurów i małp, potwierdziły wpływ tylnego podwzgórza na desynchronizację EEG i wzbudzenie behawioralne. Jest to zrozumiałe, ponieważ część tylna guzowa i suteczkowata podwzgórza mają topograficznie zorganizowane projekcje do wszystkich okolic kory [27]. W PH zlokalizowano populację neuronów „aktywnych w czuwaniu” [28]. Pewne wątpliwości w stosunku do istotnego znaczenia „ośrodka podwzgórzowego” powstały z chwilą pojawienia się możliwości wybiórczego zniszczenia ciał neuronalnych (w przeciwieństwie do włókien nerwowych) zlokalizowanych w tej okolicy. Po iniekcji kwasu ibotenowego do części guzowej i tylnej podwzgórza u kotów obserwowano bowiem tylko krótkotrwałą (ok. 2 dni) hipersomnię [29, 30]. Jednakże iniekcje muscimolu, traktowanego jako silny inhibitor wszelkiej aktywności neuronalnej, do przedniej i środkowej części tylnego podwzgórza powodowały u kotów długotrwały sen zarejestrowany zarówno w zapisach EEG, jak i określony na podstawie przejawów behawioralnych [31]. Insomnię wywołaną cytotoksyczną lezją POAH lub podaniem inhibitora syntezy serotoniny można odwrócić mikroiniekcją muscimolu do PH [22, 31]. Tylne podwzgórze wpływa również pobudzająco na mechanizmy termogenezy, co w cyklu snu i czuwania objawia się wzrostem temperatury mózgu podczas epizodów PS [32]. W ostatnim 10-leciu zwrócono uwagę na neurony histaminergiczne tylnego podwzgórza jako potencjalne źródło wzbudzenia korowego. Od dawna wiadomo, że leki przeciwhistaminowe mają działanie sedatywne. Również w doświadczeniach przeprowadzonych na zwierzętach stwierdzono, że systemowe lub domózgowe podawanie środków histaminergicznych wywołuje stan wzbudzenia, a przeciwhistaminowych — senność; efekt ten SEN zależy od receptorów H1 [33]. Jednocześnie okazało się, że w ośrodkowym układzie nerwowym neurony histaminergiczne są obecne wyłącznie w tylnym podwzgórzu, w miejscu lokalizacji „ośrodka desynchronizacji” [33]. U szczura i kota największe zagęszczenie tych neuronów znajduje się w brzuszno-bocznym tylnym podwzgórzu (jądro guzowo-suteczkowe i okolica około- i nadsuteczkowa). Pochodzą z nich długie i rozgałęzione wstępujące i zstępujące projekcje do wielu okolic starej i nowej kory, POAH, nowego prążkowia (neostriatum), grzbietowego jądra szwu, pasma samotnego i rdzenia kręgowego [33, 34]. Obecnie sugeruje się, że właśnie neurony histaminowe są anatomicznym substratem wpływu tylnego podwzgórza na mechanizm czuwania i wpływ ten może się realizować na wielu poziomach układu siatkowatego pnia mózgu [34]. Okolice PH mogą wpływać również na występowanie rytmu theta w zapisie EEG (szczególnie w odprowadzeniach hipokampalnych), powstającego podczas aktywnych ruchów zwierzęcia lub podczas PS [35]. W PH znaleziono neurony wyładowujące z częstotliwością właściwą dla rytmu theta [36], niezależnie od wpływu przegrody [37] lub ośrodków nakrywki i mostu [38], co stało się podstawą przypuszczeń [39], że tylne podwzgórze, a zwłaszcza jądro nadsuteczkowate (nucleus supramamillaris), jest fundamentalnym programatorem częstotliwości tego rytmu, chociaż jego działanie podczas czuwania i PS modulują różne struktury (jądro przednie siatkowate mostu i jądro konarowo-mostowe) [38]. Okolice przedniego i tylnego podwzgórza pozostają we wzajemnej relacji ujemnego sprzężenia zwrotnego. Lokalne ogrzewanie POAH zmniejsza aktywność neuronów bocznego PH [13], a insomnię przedniopodwzgórzową można przerwać przez domózgową iniekcję muscimolu do podwzgórza brzuszno-bocznego tylnego [22]. Zapoczątkowanie snu może być więc rezultatem zablokowania funkcjonalnego PH przez przyśrodkowo-podstawne pole przedwzrokowe [1, 22]. Badania Sherina i wsp. [9] dostarczyły ostatnio anatomicznego dowodu istnienia bezpośrednich aksonalnych połączeń neuronów POAH aktywnych we śnie z histaminergicznymi komórkami jądra guzowo-suteczkowatego podwzgórza. Nie jest jeszcze pewne, który z systemów mediatorowych uczestniczy w kontroli tylnego podwzgórza przez pole przedwzrokowe, ale wiele dowodów wskazuje, że istotne znaczenie dla tej regulacji ma kwas g-aminomasłowy (GABA). U szczurów znaleziono monosynaptyczne połączenia GABA-ergiczne POAH z PH [40]. Nitz i Siegel [41] stwierdzili w tylnym podwzgórzu wzrost stężenia GABA w płynie pozakomórkowym w czasie snu. Iniekcje muscimolu (agonisty GABA) do PH przywracają sen po doświadczalnej insomnii [22, 31], a u kotów stwierdzono wiele GABAimmunoreaktywnych komórek w przednim podwzgórzu i gęste unerwienie GABA-ergiczne tylnego podwzgórza www.sen.viamedica.pl 15 SEN 2001, Tom 1, Nr 1 [42]. Zauważono zmniejszenie ilości SWS po lokalnej iniekcji histaminy do POAH, działającej przez aktywację receptora H2 [20]. Znaczne projekcje z neuronów histaminowych PH do POAH wskazują, że histaminoergiczne i histaminoceptywne neurony tylnego podwzgórza odgrywają istotną rolę w indukcji i utrzymaniu czuwania, działając na struktury POAH [20, 34]. Jednak niezależnie od hamującego wpływu PH na POAH uważa się powszechnie, że to połączenia tylnego podwzgórza ze śródmózgowiowym układem siatkowatym [34, 43] są źródłem tonicznego oddziaływania na neurony pnia mózgu, włączone w utrzymywanie aktywacji wzgórzowo-korowej [44]. n Założenia i cel pracy Drogi komunikacji między omawianymi funkcjonalnie różnymi częściami podwzgórza są właściwie nieznane. Z anatomicznego punktu widzenia prawdopodobnie boczne podwzgórze (LH, lateral hypothalamus) mogłoby pełnić funkcję takiego kanału komunikacyjnego. Jest ono częścią pętli zwrotnych połączeń między okolicami limbicznymi przodomózgowia i śródmózgowia, a także miejscem przebiegu jednego z głównych systemów integracyjnych mózgu — pęczka przyśrodkowego przodomózgowia. Pęczek ten zawiera obukierunkowe włókna łączące ze sobą struktury korowe i podkorowe (głównie limbiczne) przodomózgowia, poszczególne jądra podwzgórza oraz jądra limbiczne nakrywki śródmózgowia [45], a także liczne projekcje podwzgórza do pnia mózgu. Boczne podwzgórze jest relatywnie ubogie w komórki, jednak prawdopodobnie większość składowych pęczka przyśrodkowego przodomózgowia, jeżeli nie wszystkie, wchodzi w kontakt z neuronami bocznopodwzgórzowymi [46]. Uszkodzenia LH, poza dobrze opisanymi objawami depresji behawioralnej, łącznie z całkowitą afagią i adipsją [48], powodują również zaburzenia cyklu sen-czuwanie. Duże lezje elektrolityczne, niszczące całkowicie lub prawie całkowicie tę okolicę, przy jednoczesnym zajęciu okolicznych struktur, wywołują trwałą synchronizację korową, której nie przerywa nawet aktywność ruchowa zwierzęcia [47–49]. Tym zaburzeniom najczęściej towarzyszy somnolencja. Lezje bardziej ograniczone mogą powodować odmienne skutki — nasilenie procesów desynchronizacyjnych [49–51], które zaobserwowano również w przebiegu zdrowienia po dużych lezjach LH [52]. Celem podjętej pracy było bliższe poznanie roli LH w regulacji cyklu sen-czuwanie, przez zbadanie zmian elektroencefalograficznego obrazu snu i czuwania po ograniczonych uszkodzeniach lub okresowej inaktywacji różnych okolic tej struktury, zlokalizowanych wzdłuż osi przednio-tylnej mózgu pomiędzy przednim a tylnym podwzgórzem. Badania te są rozwinięciem wcześniejszych doniesień z pracowni autorki [50, 51], w których opisano wzrost ilości czuwania i spadek ilości snu po ograniczonych lezjach elektrolitycznych LH. Szczególną 16 uwagę poświęcono zbadaniu zależności między lokalizacją uszkodzenia a rodzajem i nasileniem zmian elektroencefalograficznych w przebiegu snu i czuwania (doświadczenie I). Relatywny udział neuronów i włókien badanej okolicy można rozróżnić, stosując bezpośrednie iniekcje neurotoksyny, wybiórczo niszczącej ciała neuronów i oszczędzającej aksony przechodzące przez miejsce iniekcji. Stosunkowo skutecznym środkiem o zminimalizowanych skutkach ubocznych, takich jak napady epileptyczne lub uszkodzenia w miejscach odległych od iniekcji, jest kwas ibotenowy [53]. Innym środkiem farmakologicznym mogącym naśladować okresową lezję chemiczną, a pod pewnymi względami lepszym od neurotoksyn, jest muscimol — neuronalny inhibitor hiperpolaryzujący błony komórkowe poprzez zwiększenie dokomórkowego prądu chlorkowego. Jest on agonistą receptorów GABA A, ale działa dłużej od endogennego GABA, nie wpływa na włókna przechodzące przez miejsce iniekcji, a skutki jego działania są odwracalne. Środek ten zastosowali Lin i wsp. [31] w badaniach przeprowadzonych na kotach, aby ocenić wpływ inaktywacji różnych okolic podwzgórza na cykl sen-czuwanie. W niniejszej pracy posłużono się metodą lezji cytotoksycznych (ibotenowych) (doświadczenie II) oraz okresowej inaktywacji neuronów LH (dopodwzgórzowa iniekcja muscimolu) (doświadczenie III) w celu poznania relatywnego udziału ciał komórkowych i włókien pęczka przyśrodkowego przodomózgowia w mechanizmie hiposomnii bocznopodwzgórzowej. Są to pierwsze tego rodzaju badania dotyczące udziału LH w regulacji cyklu sen-czuwanie u szczura. Jak już wspomniano, uszkodzenia bocznopodwzgórzowe łączą się ze znacznymi zaburzeniami behawioralnymi, między innymi całkowitą afagią i adipsją, areaktywnością na bodźce i somnolencją, co mimo sztucznego karmienia i nawadniania w krótkim czasie prowadzi do znacznego wyniszczenia zwierzęcia. Zwierzęta takie są mało odporne na wszelkiego rodzaju obciążenia i dlatego istotne jest w doświadczeniach chronicznych związanych z codziennym niepokojeniem zwierzęcia zastosowanie takiej procedury, która pozwalałaby utrzymać je przy życiu w stosunkowo dobrej kondycji przez możliwie najdłuższy czas. Jak wykazały wcześniejsze badania wykonane w pracowni autorki [54], całodobowe zapisy EEG w celu zdiagnozowania obecności zaburzeń snu u szczurów bocznopodwzgórzowych, można zastąpić analizą jednogodzinnych próbek EEG, pobranych w jasnej fazie cyklu okołodobowego. Procentowy rozkład czasu czuwania, SWS i PS w próbkach pobranych w godzinach przedpołudniowych jest zbliżony do analogicznego rozkładu w zapisach 12-godzinnych, a także w zapisach 24-godzinnych po uszkodzeniu LH [52]. Dlatego w niniejszej pracy, poświęconej analizie anatomicznej www.sen.viamedica.pl Jolanta Orzeł-Gryglewska, EEG po uszkodzeniach podwzgórza u szczura zmian cyklu sen-czuwanie po uszkodzeniach LH, zastosowano oszczędzającą szczury doświadczalne metodę „próbkowania” EEG. Przez okres 2 tygodni po elektrolitycznym i cytotoksycznym uszkodzeniu LH w jednogodzinnych próbkach zapisów dziennego EEG sumowano ilość czuwania, SWS i PS oraz porównywano z zapisami kontrolnymi. Po iniekcji muscimolu badano rozkład snu i czuwania przez 6 godzin, czyli przez cały potencjalny okres działania tego środka. n Materiał i metody Zwierzęta Badania przeprowadzono na 60 szczurach, samcach szczepu Wistar (masa ciała w dniu operacji: 244–384 g). U 31 zwierząt wykonano obustronną elektrolityczną lezję LH, natomiast 11 szczurów poddano lezji pozornej. Obustronną dopodwzgórzową iniekcję kwasu ibotenowego otrzymało 10 szczurów, zaś 8 szczurów — obustronną iniekcję muscimolu. Podczas całego cyklu doświadczalnego zwierzęta przebywały w oddzielnych klatkach, w warunkach sztucznego oświetlenia (12:12 h) i otrzymywały standardowy pokarm dla szczurów oraz wodę. Operacja U każdego szczura implantowano w dootrzewnowej narkozie nembutalowej w dawce 50 mg/kg obustronnie elektrody rejestrujące EEG okolicy potylicznej kory mózgowej (śrubki jubilerskie wkręcone w powierzchnię czaszki) i jednobiegunowe elektrody rejestrujące zapis EEG z okolicy hipokampa (drut ze stali nierdzewnej o średnicy 0,2 mm, izolowany na całej długości za wyjątkiem płasko ściętego końca), a także elektrodę rejestrującą EMG mięśni karku, elektrodę odniesienia, przeprowadzoną pod skórą na kościach czaszki w okolicy opuszki węchowej oraz elektrodę stanowiącą uziemienie. Ponadto, u 42 szczurów implantowano obustronne elektrody uszkadzające (drut ze stali nierdzewnej o średnicy 0,3 mm, izolowany na całej długości za wyjątkiem płasko ściętego końca) w różnych punktach przednio-tylnej osi LH, a u 18 zwierząt obustronne kaniule (igły iniekcyjne o długości 15 mm i średnicy 0,6 mm) w guzowej części LH. Przyjęto następujące koordynaty stereotaktyczne: elektrody rejestrujące czynność hipokampa: 2,4–3,8 mm do tyłu od bregmy, 2,4–3,0 mm na boki od linii szwu strzałkowego, 2,5– –4,0 mm w dół od powierzchni czaszki; elektrody rejestrujące czynność kory mózgowej: 6,0–7,0 mm do tyłu od bregmy, 2,5–3,5 mm na boki od linii szwu strzałkowego, 1,0 mm w dół od powierzchni czaszki; elektrody uszkadzające w obrębie LH: 1,2–4,5 mm do tyłu od bregmy, 1,0– –2,0 mm na boki od linii szwu strzałkowego, 7,7–9,0 mm w dół od powierzchni czaszki; kaniule iniekcyjne: 2,8 mm do tyłu od bregmy, 2,0 mm na boki od linii szwu strzałkowego, 8,0 mm w dół od powierzchni czaszki. SEN Rejestracje EEG Pierwszy tydzień po operacji był okresem adaptacji do warunków doświadczalnych. Szczury przebywały przez 2 godziny dziennie o tej samej porze w klatkach rejestracyjnych (260 x 260 x 400 mm) umieszczonych w pomieszczeniu o ograniczonym dopływie dźwięków i kontrolowanej temperaturze i poddawano je procedurze podłączenia do aparatury. Następnie przez 3 kolejne dni prowadzono rejestracje kontrolne EEG, na podstawie których oceniano późniejsze zmiany po lezjach. Zapisy kontrolne przed lezją cytotoksyczną wykonano po iniekcji rozpuszczalnika (bufor fosforanowy). Zapis EEG rejestrowano na 16-kanałowym elektroencefalografie firmy Medicor (szybkość przesuwu papieru 7,5 mm/s, filtry górnoprzepustowe 0,3 Hz dla odprowadzeń EEG i 0,03 Hz dla odprowadzeń z mięśni oraz filtry dolnoprzepustowe — 30 Hz). Zachowanie zwierząt obserwowano przez kamerę połączoną z monitorem, a obserwacje odnotowywano w odpowiednich miejscach zapisu EEG. Zapis EEG rejestrowano po lezjach elektrolitycznych, zawsze w tych samych godzinach przedpołudniowych, w 5–7 dniach pierwszego tygodnia i 2–3 wybranych dniach drugiego tygodnia po uszkodzeniu. Po iniekcji kwasu ibotenowego prowadzono badania codziennie przez 14 dni. Po iniekcjach muscimolu EEG rejestrowano jednorazowo po każdej dawce, przez 6 godzin (10.00– –16.00), a pomiędzy iniekcjami kolejnych dawek stosowano tygodniowe przerwy. Lezje elektrolityczne i iniekcje domózgowe Po kontrolnych rejestracjach EEG u 31 szczurów wykonano (w lekkiej narkozie eterowej) elektrolityczne lezje LH prądem anodowym o natężeniu 1–2 mA i czasie trwania 15–20 sekund. Lezji pozornej poddano 11 zwierząt (identyczne postępowanie chirurgiczne i doświadczalne za wyjątkiem elektrolizy tkanki mózgowej). W drugiej grupie podawano szczurom (n = 6) obustronnie do guzowej części LH najpierw 0,5 ml buforu fosforanowego (pH 7,4) (iniekcja kontrolna), a po okresie 3 dni rejestracji kontrolnych — kwas ibotenowy (Ibotenic acid, RBI, 3 mg/0,5 ml) (n = 10), rozpuszczony w buforze fosforanowym. Użyto strzykawki Hamiltona, połączonej z wykalibrowanym kataterem, zakończonym wewnętrzną kaniulą iniekcyjną (igła iniekcyjna o długości 15,4 mm i średnicy zewnętrznej 0,3 mm). Kaniulę tę umieszczano wewnątrz chronicznie implantowanej kaniuli prowadzącej. Czas trwania iniekcji wynosił około 1 minuty. Kaniulę wraz z całym zestawem odłączano po upływie kolejnej minuty od zakończenia iniekcji. W czasie trwania całego zabiegu szczur znajdował się pod wpływem narkozy ketaminowej (50 mg/kg). Muscimol (Muscimol Hbr, RBI) podawano według identycznej jak poprzednio procedury w dawkach 0 ng (Aqua pro iniectione, Polfa), 25 ng, 50 ng i 100 ng (n = 8). www.sen.viamedica.pl 17 SEN 2001, Tom 1, Nr 1 U 5 szczurów dawkę 25 ng muscimolu poprzedzono domózgową iniekcją 50 ng bikukuliny (Bicucculline methiodide, Sigma). Odstęp między iniekcjami wynosił 10– –15 minut. Weryfikacja histologiczna Po zakończeniu doświadczeń szczury usypiano nembutalem i przez lewą komorę serca wykonywano perfuzję kolejno solą fizjologiczną oraz 10-procentowym roztworem formaliny. Mózgi wyjmowano z czaszki i umieszczano w 10-procentowym roztworze formaliny. Po utrwaleniu cięto je mikrotomem mrożeniowym na skrawki grubości 75 mm i barwiono standardową metodą Nissla przy użyciu fioletu krezylowego. Lokalizację i wielkość uszkodzeń oraz miejsca iniekcji porównywano z tablicami w atlasie mózgu szczura Paxinosa i Watsona [56]. Do przedniej części podwzgórza zaliczono skrawki o koordynatach od –0,80 do –2,12 mm do tyłu od bregmy, do części guzowej skrawki od –2,30 do –3,30 mm do tyłu od bregmy, a do części tylnej skrawki od –3,60 do –4,52 mm do tyłu od bregmy. Obszar uszkodzeń cytotoksycznych (ibotenowych) LH oceniano na podstawie degeneracji neuronów i występowania gliozy, natomiast miejsce iniekcji muscimolu przez lokalizację śladu zakończenia kaniuli iniekcyjnej. Opracowanie wyników i analiza statystyczna Zapisy EEG oceniano wzrokowo i mierzono czas trwania epizodów czuwania, snu wolnofalowego i paradoksalnego, które następnie sumowano, by otrzymać całkowity czas ich trwania w okresie rejestracji. Wyróżniono 4 typy zapisu EEG: 1) desynchronizację EEG w korze, połączoną z szybką aktywnością hipokampa, gdy czuwający szczur pozostawał w bezruchu lub wykonywał ruchy automatyczne, na przykład czyszczenie ciała (W); 2) desynchronizację korową z jednoczesnym rytmem theta w hipokampie w czasie wykonywania przez szczura ruchów typu dowolnego, na przykład eksploracyjnych (WT); 3) wysoko amplitudową, nieregularną aktywność w korze i hipokampie charakterystyczną dla snu wolnofalowego (SWS) u szczura; 4) rytm theta w hipokampie oraz korze, któremu towarzyszył spadek napięcia mięśni karku cechujący sen paradoksalny (PS). Sumując oba (wymienione w punkcie 1 i 2) rodzaje aktywności występujące w czuwaniu, otrzymano całkowity czas czuwania. Relatywny czas trwania poszczególnych typów aktywności EEG przedstawiono w procentach całkowitego czasu rejestracji. Analizowano również liczbę i czas trwania epizodów W, WT, SWS, PS oraz latencję SWS i latencję PS w kolejnych sesjach doświadczalnych. Statystyczne opracowanie wyników przeprowadzono za pomocą analizy wariancji (ANOVA). W analizie 2-czynnikowej badano wpływ lezji lub iniekcji oraz cza- 18 su, jaki upłynął od manipulacji doświadczalnej, na procentowy rozkład snu i czuwania, liczbę oraz czas trwania epizodów snu i czuwania, a także latencję snu. Porównania postwariancyjne wykonano za pomocą testu Tukeya (p £ 0,05). Przed lezją porównano grupy doświadczalną i kontrolną, stosując 1-czynnikową analizę wariancji. n Wyniki Zmiany wzorca EEG po elektrolitycznych lezjach bocznego podwzgórza Przed lezją średni procentowy rozkład wzorców aktywności EEG w analizowanych próbkach był następujący — czuwanie: 44,1 ± 1,9%; SWS: 45,5 ± 1,5%; PS: 10,4 ± 0,7% i nie różnił się istotnie (1-czynnikowa analiza wariancji) od analogicznych wartości w grupie kontrolnej poddanej lezji pozornej — czuwanie: 49,8 ± 3,3%; SWS: 42,1 ± 2,6%; PS: 8,1 ± 0,9%. W grupie doświadczalnej lezje powodowały wzrost czasu czuwania (głównie kosztem SWS). Wyniki po lezji były uśredniane w okresach tygodniowych (ryc. 1A). Rozkład czasu snu i czuwania w grupie doświadczalnej w 1. i 2. tygodniu po lezji był następujący — czuwanie: 61,7 ± 2,0 i 56,0 ± ± 3,2%; SWS: 31,2 ± 1,6 i 36,0 ± 2,7%; PS: 7,1 ± 0,5 i 8,1 ± 0,7%. W 2-czynnikowej analizie wariancji (grupa x czas po lezji) stwierdzono istotną zależność czasu czuwania od przynależności do grupy (F(1,450) = 8,86; p < 0,01) i SWS (F(1,450) = 14,15; p < 0,0001). Dla PS nie było takiej zależności (F(1,450) = 0,34, p < 0,6). Stwierdzono istotną zależność badanych parametrów od czasu (w tygodniach), jaki upłynął od lezji (czuwanie, F(2,450) = 11,43, p < 0,0001; SWS, F(2,450) = 11,66, p < 0,0001; PS, F(2,450) = 6,06, p < 0,002). Stwierdzono interakcję „grupa x czas” (czuwanie, F(2,450) = 7,14, p < 0,001; SWS, F(2,450) = 7,23, p < 0,001; PS, F(2,450) = 3,97, p < 0,02). W teście Tukeya zaobserwowano istotny wzrost czasu czuwania i istotne zmniejszenie ilości SWS w stosunku do wartości wyjściowych w obu tygodniach po lezji. Zmniejszenie ilości PS było istotne tylko w 1. tygodniu po lezji (ryc. 1A). Analogiczna analiza wyników otrzymanych w grupie poddanej lezji pozornej nie wykazała żadnych istotnych zmian. Uszkodzenie LH spowodowało istotny wzrost liczby epizodów czuwania z rytmem theta w 1. tygodniu po lezji i zmniejszenie liczby epizodów snu wolnofalowego oraz paradoksalnego w 1. i 2. tygodniu po lezji (ryc. 1B). Taki efekt nie wystąpił w grupie poddanej lezji pozornej. Przed lezją elektrolityczną średnia liczba epizodów poszczególnych wzorców aktywności EEG w analizowanych próbkach wynosiła — W: 38,3 ± 1,2; WT: 17,6 ± 1,1; SWS: 25,9 ± 0,9; PS: 4,8 ± 0,3, i nie różniła się istotnie (1-czynnikowa analiza wariancji) od liczby epizodów W i WT w grupie kontrolnej poddanej lezji pozornej (W: 38,5 ± www.sen.viamedica.pl Jolanta Orzeł-Gryglewska, EEG po uszkodzeniach podwzgórza u szczura 70 Lezje elektrolityczne * 60 Czas rejestracji (%) Lezje pozorne * 40 * x * 30 20 0 1 tydz. 1 tydz. 60 40 0 40 1800 35 1600 x * x * * 15 1 tydz. 2 tydz. WT K 1 tydz. 2 tydz. PS SWS x * 1400 1200 1000 800 x * * 600 10 400 5 0 K W D. 2000 20 x * PS SWS 45 25 * 80 2 tydz. Latencja snu [s] Liczba epizodów K 2 tydz. Czuwanie 30 Lezje pozorne 20 * K Lezje elektrolityczne 100 50 10 B. C. 120 x Czas trwania epizodu [s] A. SEN K * * 1 tydz. 2 tydz. W WT 200 K SWS 1 tydz. 0 2 tydz. PS K 1 tydz. 2 tydz. SWS K 1 tydz. 2 tydz. PS Tygodnie po lezji Rycina 1. Wpływ lezji elektrolitycznych bocznego podwzgórza na elektroencefalograficzny obraz snu i czuwania; A. Procentowy rozkład snu i czuwania w całkowitym czasie rejestracji; B. Liczba epizodów poszczególnych typów aktywności EEG; C. Czas trwania epizodów poszczególnych typów aktywności EEG; D. Latencja snu wolnofalowego i paradoksalnego; * — istotność różnic w porównaniu z kontrolą przed lezją; x — istotność różnic w porównaniu z grupą kontrolną (z lezją pozorną) (test Tukeya, p £ 0,05); W — spokojne czuwanie; WT — czuwanie z rytmem theta; SWS — sen wolnofalowy (slow wave sleep); PS — sen paradoksalny; K — kontrola przed lezją ± 1,7; WT: 18,1 ± 1,4), natomiast między grupami występowały pewne różnice w liczbie epizodów SWS (F(1,122) = 6,23, p < 0,02) i PS (F(1,122) = 5,25, p < 0,05) (grupa kontrolna — SWS: 21,9 ± 1,1; PS: 3,7 ± 0,3). Po lezji elektrolitycznej liczba epizodów snu i czuwania w 1. i 2. tygodniu była następująca — W: 39,9 ± 1,4 i 35,1 ± 1,9; WT: 25,8 ± 1,5 i 21,8 ± 2,2; SWS: 18,5 ± 1,0 i 17,3 ± 1,4; PS: 3,0 ± 0,2 i 3,6 ± 0,4. W 2-czynnikowej analizie wariancji (grupa x czas po lezji) stwierdzono istotną zależność liczby epizodów WT od przynależności do grupy, F(1,450) = 5,94; p < 0,02. Efekt tygodnia po lezji był istotny dla WT, (F(2,450) = 6,34, p < 0,002), SWS, (F(2,450) = 13,42, p < 0,0001), i PS, (F(2,450) = 9,13, p < 0,0001). Stwierdzono interakcję „grupa x czas” dla liczby epizodów SWS, F(2,450) = 5,56, p < 0,005 i PS, F(2,450) = 4,97, p < 0,01). W teście Tukeya wzrost liczby epizodów WT w stosunku do wartości wyjściowych był istotny w 1. tygodniu, a zmniejszenie liczby epizodów SWS i PS — w obu tygodniach po lezji (ryc. 1B). Po lezjach LH nastąpił istotny wzrost czasu trwania epizodów WT w 1. tygodniu po lezji i wydłużenie epizodów SWS w 2. tygodniu po lezji (ryc. 1C). Przed lezją średni czas trwania epizodów poszczególnych typów wzorców aktywności EEG w analizowanych próbkach był następujący — W: 34,7 ± 2,4 s; WT: 19,3 ± 0,8 s; SWS: 68,5 ± 2,8 s; PS: 74,9 ± 4,3 s, i nie różnił się istotnie (1-czynnikowa analiza wariancji) od analogicznych wartości w grupie kontrolnej poddanej lezji pozornej (W: 39,6 ± 1,9 s; WT: 17,2 ± 1,2 s; SWS: 77,8 ± 6,8 s; PS: 77,5 ± 7,8 s). Długości epizodów snu i czuwania w gru- www.sen.viamedica.pl 19 SEN 2001, Tom 1, Nr 1 pie doświadczalnej w 1. i 2. tygodniu po lezji były następujące — W: 50,0 ± 5,3 i 56,3 ± 9,9 s; WT: 28,7 ± 2,3 i 25,5 ± 3,2 s; SWS: 66,3 ± 3,9 i 91,1 ± 11,9 s; PS: 65,1 ± ± 4,7 i 73,3 ± 6,8 s. W 2-czynnikowej analizie wariancji (grupa x czas po lezji) stwierdzono istotną zależność czasu trwania epizodów WT od przynależności do grupy (F(1,450) = 16,07; p < 0,0001). Zależność od okresu (w tygodniach), jaki upłynął od lezji stwierdzana była dla czasu trwania epizodów WT, F(2,450) = 3,78, p < 0,05 i SWS, F(2,450) = 3,43, p < 0,05. W teście Tukeya wydłużenie epizodów WT w 1. tygodniu i wydłużenie epizodów SWS w 2. tygodniu po lezji elektrolitycznej było istotne w porównaniu z wartościami wyjściowymi (ryc. 1C). Latencję SWS i PS w kolejnych dniach po lezji elektrolitycznej i pozornej przedstawiono na rycinie 1D. Uszkodzenie LH spowodowało wzrost latencji snu wolnofalowego oraz paradoksalnego, efekt taki nie wystąpił natomiast w grupie zwierząt poddanych lezji pozornej. Stwierdzono istotną statystycznie zależność latencji SWS od przynależności do grupy (F(1,435) = 15,03, p £ 0,0001) oraz wpływ tygodnia po lezji na wartość latencji SWS: F(2,435) = 5,07; p £ 0,01 i PS: F(2,440) = 3,54; p £ 0,05. Interakcję „grupa x czas” stwierdzono dla latencji PS (F(2,440) = 7,35, p £ 0,01). Postwariancyjny test Tukeya (p £ 0,05) wykazał istotny wzrost latencji SWS w 1. i 2. tygodniu po lezji (odpowiednio 622,4 ± 73,4 i 704,1 ± ± 141,6 s) w porównaniu z grupą kontrolną (274,0 ± ± 52,9 s). Natomiast latencja PS okazała się istotnie dłuższa tylko w 1. tygodniu po lezji (1787,0 ± 107,7 s) w porównaniu z grupą kontrolną (1097,6 ± 100,9 s). Zwierzęta w grupie doświadczalnej różniły się stopniem hiposomnii. Rycina 2 przedstawia zmiany procentowego udziału czuwania po lezji u wszystkich badanych zwierząt. Dane z kolejnych dni rejestracji uśredniono w tygodniowych przedziałach i przedstawiono jako procentową zmianę w stosunku do wartości kontrolnych. Po lezji u większości szczurów zaobserwowano wzrost czasu czuwania. U połowy zwierząt (n = 15) średni wzrost czasu czuwania przekraczał 20%, sięgając nawet 52,5%, u 5 szczurów wyniósł 10–19%, a u 11 nie przekraczał ± 10% w 1. tygodniu po lezji. W 2. tygodniu ponad 20-procentowy wzrost czasu czuwania wystąpił u 7 zwierząt. W grupie kontrolnej średnia zmiana czasu czuwania wynosiła –2,4 ± 4,3% w 1. i 2,5 ± 4,3% w 2. tygodniu po lezji, choć indywidualne fluktuacje w poszczególnych dniach doświadczenia mogły osiągać –23,3% i 19,0%. Anatomiczna weryfikacja uszkodzeń elektrolitycznych Wszystkie zwierzęta miały uszkodzenia w okolicy bocznego podwzgórza — pęczka przyśrodkowego przodomózgowia. Lezje można było zlokalizować na jednym z trzech poziomów w wymiarze przednio-tylnym podwzgórza (przednim podwzgórzu z okolicą przedwzro- 20 kową, części guzowej podwzgórza i tylnym podwzgórzu) lub na granicy dwóch z wymienionych stref. Mogły one zachodzić na struktury sąsiadujące z bocznym podwzgórzem: torebkę wewnętrzną, warstwę niepewną, brzuszne jądra wzgórza, przyśrodkową okolicę przedwzrokową, kolumny sklepienia i pola Forela. Na podstawie intensywności hiposomnii (ryc. 2) szczury podzielono na dwie grupy: w pierwszej znalazły się zwierzęta, u których wzrost czuwania był większy niż 20%, w drugiej te, u których zmiany ilości czuwania nie przekroczyły fluktuacji zanotowanych w grupie kontrolnej. Największy wzrost czasu czuwania z jednoczesną redukcją snu towarzyszył lezjom zlokalizowanym w części przedniej i guzowej LH, często na granicy obu stref. Efektywne lezje mogły też znajdować się całkowicie w tylnym podwzgórzu. Rycina 3 przedstawia przykładowe lokalizacje lezji u zwierząt wykazujących największe zaburzenia. Na rycinie 4A przedstawiono sumarycznie rozkład uszkodzeń w wymiarze przednio-tylnym bocznego podwzgórza u szczurów z grupy wykazującej największe wydłużenie czasu czuwania. Jak widać, lezje zlokalizowane w każdej z wyróżnionych stref podwzgórza od okolicy przedwzrokowej do granicy ze śródmózgowiem mogły powodować znaczną hiposomnię. Lokalizacja uszkodzeń u zwierząt, u których po lezji wystąpiły zmiany ilości czuwania poniżej 20% w stosunku do wartości przedlezyjnej zasadniczo się nie różniła. Lezje te były rozproszone w całym wymiarze przednio-tylnym LH, jednak zwykle były małe lub jednostronne. W celu określenia roli różnych systemów włókien pęczka przyśrodkowego przodomózgowia w powstawaniu insomnii bocznopodwzgórzowej powierzchnię każdego czołowego przekroju LH podzielono szacunkowo na kwadranty (górny boczny, górny przyśrodkowy, dolny boczny i dolny przyśrodkowy (ryc. 4B), a następnie określono rozmiar uszkodzeń poszczególnych kwadrantów u wszystkich zwierząt. U 9 szczurów uszkodzenia obejmowały do 100% czołowych przekrojów lewego i prawego LH, u 7 zwierząt stwierdzono uszkodzenie około 75% powierzchni przekroju LH, u 11 zwierząt — średnio 50% powierzchni przekroju, a u 4 zwierząt uszkodzenia LH wynosiły około 25%. Niektóre lezje były asymetryczne w wymiarze przednio-tylnym lub w wielkości powierzchni przekroju uszkodzenia. U 9 spośród 15 szczurów, u których wystąpiły duże zaburzenia, lezje uszkadzały 75–100% czołowego przekroju LH. W dalszym etapie badań oceniano częstość uszkodzeń poszczególnych kwadrantów w grupie zwierząt o dużych (wzrost czuwania powyżej 20% kontroli) i małych (analogiczny wzrost poniżej 20%) zaburzeniach. W tym celu zliczono liczbę uszkodzonych kwadrantów przy tych samych koordynatach stereotaktycznych (wymiar przednio-tylny) według atlasu Paxinosa i Watsona [56]. www.sen.viamedica.pl Jolanta Orzeł-Gryglewska, EEG po uszkodzeniach podwzgórza u szczura SEN Grupa doœwiadczalna 60 Zmiana iloœci czuwania (%) 50 40 30 20 10 0 –10 –20 b2 3j 2j 45 26 a7 5 a6 a9 42 8 9 29 48 8j 46 7 28 4j 7j 6j 16 44 b9 10 5j c0 25 32 b1 43 Numer szczura Grupa kontrolna 30 Zmiana iloœci czuwania(%) 20 10 0 –10 –20 –30 115 117 102 101 105 113 110 114 118 116 103 Numer szczura 1. tydzieñ po lezji 2. tydzieñ po lezji Rycina 2. Zmiany ilości czuwania w 1. i 2. tygodniu po lezji elektrolitycznej (góra) i pozornej (dół) bocznego podwzgórza u poszczególnych osobników. U części zwierząt rejestracje EEG przeprowadzono tylko w 1. tygodniu po lezji www.sen.viamedica.pl 21 22 www.sen.viamedica.pl 0,8 mm 1,3 mm 1,8 mm 2,3 mm 2,8 mm Czêæ guzowa podwzgórza 3,3 mm 3,8mm Tylne podwzgórze 4,3 mm które naniesiono na tablice z atlasu mózgu szczura Paxinosa i Watsona (1986) Rycina 3. Przykładowe lokalizacje najbardziej efektywnych uszkodzeń elektrolitycznych powodujących wzrost czuwania o ponad 20% wartości kontrolnych. Pola zakreskowane oznaczają miejsca lezji, 26 45 2j 3j b2 AP Nr szczura Okolica przedwzrokowa i przednie podwzgórze SEN 2001, Tom 1, Nr 1 Jolanta Orzeł-Gryglewska, EEG po uszkodzeniach podwzgórza u szczura SEN A. Numer szczura Czêœæ guzowa podwzgórza Okolica przedwzrokowa i przednie podwzgórze Tylne podwzgórze b2 3j 2j 45 26 a7 5 a6 a9 42 8 9 29 48 8j AP: B. –0,80 –0,92 –1,30 –1,40 –1,80 Czêœæ przednia –2,12 –2,30 –2,56 –2,80 Czêœæ guzowa –3,14 –3,30 –3,60 –3,80 –4,16 –4,30 –4,52 Czêœæ tylna Rycina 4. Rozkład uszkodzeń w wymiarze przednio-tylnym (A) i czołowym (B) bocznego podwzgórza u szczurów wykazujących po lezji elektrolitycznej największy wzrost czasu czuwania. Efektywne lezje mogły wystąpić w każdej z wyróżnionych stref bocznego podwzgórza od okolicy przedwzrokowej do granicy ze śródmózgowiem; AP — wymiar przednio-tylny w odniesieniu do bregmy według atlasu mózgu szczura Paxinosa i Watsona (1986). Zacieniowane pola na rycinie B oznaczają kwadranty lewego bocznego podwzgórza (górny boczny, górny przyśrodkowy, dolny boczny i dolny przyśrodkowy) o istotnie większej częstości uszkodzeń w grupie szczurów o dużym wzroście czasu czuwania W analizie wariancji ze zmienną niezależną, czyli wymiar przednio-tylny podwzgórza i nasilenie zaburzeń, stwierdzono, że w obu grupach najwięcej uszkodzeń wystąpiło w przednim LH, jednak uszkodzenia tej okolicy w grupie o dużym wzroście czuwania były liczniejsze (F(5,218) = 49,45; p £ 0,0001). W grupie ze znacznym wzrostem czasu czuwania częstość uszkodzeń była niejednakowa w poszczególnych kwadrantach (F(3,100) = = 3,37; p £ 0,05) i stwierdzono interakcję kwadrant ¥ ¥ odległość przednio-tylna od bregmy (F(6,100) = 2,91; p £ 0,02). W grupie szczurów o niewielkich zaburzeniach takie zależności nie występowały. W grupie o dużym wzroście czuwania częściej niż w grupie, w której nastąpiły mniejsze zmiany, uszkodzeniu ulegał kwadrant górny boczny (p £ 0,01) i dolny boczny (p £ 0,02) w podwzgórzu przednim, kwadrant górny boczny (p £ 0,005) w podwzgórzu guzowym oraz kwadrant dolny boczny (p £ 0,001) i dolny przyśrodkowy (p £ 0,01) w podwzgórzu tylnym (ryc. 4B). Okolice te odpowiadają strefom pęczka przyśrodkowego przodomózgowia według atlasu Nieuwenhuysa i wsp. [45] oraz Veeninga i wsp. [57] oznaczonym jako: a, a1, e i d (przednie podwzgórze), e, e1 i e2 (podwzgórze guzowe) i a, d i g (podwzgórze tylne). Wpływ cytotoksycznych lezji bocznego podwzgórza na elektroencefalograficzny wzorzec snu i czuwania Procentowy rozkład czuwania, snu wolnofalowego i snu paradoksalnego w kolejnych tygodniach po podaniu kwasu ibotenowego przedstawiono na rycinie 5A. Jednoczynnikowa analiza wariancji z faktorem „iniekcja” (bufor/kwas ibotenowy) wykazała brak wpływu na procentowy rozkład czuwania, SWS i PS (czuwanie: F(1,99) = 1,19, p £ 0,3; SWS: F(1,99) = 1,53, p £ 0,2; PS: F(1,99) = 0,03, p £ 0,9). Jednoczynnikowa analiza wa- www.sen.viamedica.pl 23 SEN 2001, Tom 1, Nr 1 A. B. Lezje cytotoksyczne 60 –1,80 mm 50 Czas rejestracji (%) Bregma 40 –2,12 mm 30 –2,30 mm 20 –2,56 mm 10 0 –2,80 mm K 1. tydzieñ Czuwanie SWS 2. tydzieñ PS –3,14 mm Tygodnie po lezji Rycina 5. Efekty iniekcji kwasu ibotenowego do okolicy bocznego podwzgórza; A. Procentowy rozkład snu i czuwania w 1. i 2. tygodniu po lezji cytotoksycznej w zestawieniu z efektem kontrolnej iniekcji buforu fosforanowego (K); B. Łączna lokalizacja uszkodzeń mózgowych w grupie zwierząt po lezji cytotoksycznej bocznego podwzgórza, naniesiona na tablice mózgu szczura według atlasu Paxinosa i Watsona (1986) riancji dla czynnika czasu (dnia) po iniekcji cytotoksycznej nie wykazała zmian w procentowym rozkładzie czuwania, SWS i PS (czuwanie: F(10,90) = 1,14, p £ 0,4; SWS: F(10,90) = 1,10, p £ 0,4; PS: F(10,90) = 1,21, p £ 0,3). Po pogrupowaniu wyników w tygodniowych przedziałach czasowych analiza wariancji również nie wykazała istotnych zmian (czuwanie: F(2,98) = 1,02, p £ 0,4; SWS: F(2,98) = 1,67, p £ 0,2; PS: F(2,98) = 0,17, p £ 0,8). Jedynym istotnym efektem iniekcji kwasu ibotenowego był niewielki wzrost czasu czuwania z rytmem theta (WT) w 2. tygodniu po lezji oraz zwiększenie liczby epizodów WT i skrócenie epizodów spokojnego czuwania w całym okresie po lezji. W weryfikacji histologicznej stwierdzono zmiany degeneracyjne i obecność gliozy w przedniej i guzowej części LH, które często zajmowały różne części okolicznych struktur (warstwa niepewna, brzuszne jądra wzgórza). W miejscu iniekcji występowały ślady ciemno zabarwionej tkanki nekrotycznej lub małe jamy. Lezje były usytuowane na ogół symetrycznie w obu półkulach, bocznie w stosunku do torebki wewnętrznej. Lokalizację uszkodzeń mózgowych sumarycznie dla wszystkich osobników pokazano na rycinie 5B. Wpływ mikroiniekcji muscimolu do bocznego podwzgórza na wzorzec snu i czuwania w zapisie EEG Obustronne iniekcje muscimolu do LH spowodowały wzrost czasu czuwania przy jednoczesnym zmniejszeniu czasu SWS i PS. Efekt ten zależał od wielkości daw- 24 ki muscimolu. Dwuczynnikowa analiza wariancji wykazała istotny wzrost czasu czuwania w zależności od dawki (F(3,198) = 11,40; p £ 0,001) i godziny po iniekcji (F(5,168) = 30,13; p £ 0,001). Istotna statystycznie okazała się interakcja „dawka ¥ godzina rejestracji” (F(15,168) = 2,88; p £ 0,001). Zmniejszenie czasu SWS również istotnie zależało od dawki (F(3,168) = 7,98; p £ 0,001) i godziny po iniekcji (F(5,168) = 20,76; p £ 0,001). Istotna była interakcja „dawka ¥ godzina” (F(15,168) = 2,54; p £ 0,002). Zmniejszenie czasu PS było istotnie zależne od dawki muscimolu (F(3,168) = = 7,25; p £ 0,001) i od godziny po iniekcji (F(5,168) = = 22,19; p £ 0,001), nieistotna zaś była interakcja „dawka ¥ godzina”. Na rycinie 6 przedstawiono procentowe zmiany czasu czuwania w kolejnych godzinach po iniekcji muscimolu. Po iniekcji kontrolnej 0 ng w 1. godzinie obserwowano wysoki poziom czuwania (64,1 ± 3,0%), związany z pobudzającym efektem procedury iniekcyjnej, który w następnych godzinach osiągnął (z pewną zmiennością) prawie 2-krotnie niższy poziom. Najbardziej efektywna okazała się dawka 50 ng muscimolu. Wzrost czuwania obserwowano przez 4 godziny po iniekcji, w ciągu 3 pierwszych godzin był on istotny statystycznie. Wzrostowi ilości czuwania towarzyszyło zmniejszenie ilości SWS, które było istotne w 1., 2., i 3., godzinie po iniekcji dawki 50 ng oraz w 2. godzinie po dawkach 25 i 100 ng muscimolu. Istotnemu zmniejszeniu uległa również ilość PS w okresie pierwszych 3 godzin po iniekcji 50 ng i w 1. godzinie po 100 ng muscimolu (ryc. 6). www.sen.viamedica.pl Jolanta Orzeł-Gryglewska, EEG po uszkodzeniach podwzgórza u szczura Czuwanie 100 Wpływ muscimolu blokowała uprzednio podana bikukulina (50 ng bikukuliny przy 25 ng muscimolu). W żadnym przypadku efekt łącznego podania agonisty i antagonisty receptorów GABAA nie był istotnie różny od efektu kontrolnej iniekcji wody (ryc. 6). Wzrost czasu czuwania wynikał ze znacznego, zależnego od dawki (F(3,168) = 7,34, p £ 0,001) i czasu po iniekcji (F(5,168) = 16,56, p £ 0,001); „dawka x czas”: F(15,168) = 2,21, p £ 0,01) wydłużenia epizodów W, istotnego dla dawki 50 ng muscimolu (test Tukeya). Dwuczynnikowa analiza wariancji wykazała również istotny wpływ dawki muscimolu na liczbę epizodów SWS (F(3,168) = 5,33, p £ 0,002) i PS (F(3,168) = 8,23, p £ £ 0,001) oraz na czas trwania epizodów PS (F(3,168) = = 12,04, p £ 0,001). Efekt godziny po iniekcji był istotny dla liczby epizodów W (F(5,168) = 2,67, p£0,05), SWS (F(5,168) = 7,04, p £ 0,001) i PS (F(5,168) = 21,14, p £ £ 0,001) oraz dla czasu trwania epizodów PS (F(5,168) = = 15,27, p £ 0,001). Zmniejszenie liczby epizodów SWS i PS oraz skrócenie epizodów PS było istotne po iniekcji 50 ng muscimolu. Latencję snu analizowano tylko w zależności od dawki i okazała się ona istotnie dłuższa (F(3,28) = 5,23, p £ 0,005) jedynie dla PS po dawce 50 ng muscimolu. W weryfikacji histologicznej stwierdzono, że u większości zwierząt miejsce iniekcji muscimolu znajdowało się w przedniej oraz w guzowej części LH. W polu dyfuzji muscimolu (promień ok. 1 mm od końca kaniuli) oprócz obszaru bocznego podwzgórza mogła znajdować się warstwa niepewna, brzuszne jądra wzgórza i przyśrodkowa część istoty bezimiennej. * 80 * * * * 60 40 20 0 Sen wolnofalowy 60 40 * * * 20 * * 0 Sen paradoksalny 20 SEN n Dyskusja Wyniki uzyskane w tej pracy można podsumować następująco: 10 0 0 ** * 1 2 * 3 4 5 6 Godziny po iniekcji 0 ng 25 ng 50 ng 100 ng MB Rycina 6. Procentowe zmiany snu i czuwania w kolejnych godzinach po iniekcjach różnych dawek muscimolu do bocznego podwzgórza; MB — dawka 50 ng bikukuliny i 25 ng muscimolu; * — istotność różnic (test Tukeya, p £ 0,05) w stosunku do kontroli (dawka 0 ng) 1. Obustronne, elektrolityczne uszkodzenia okolicy bocznego podwzgórza/pęczka przyśrodkowego przodomózgowia, na każdym poziomie jej osi przedniotylnej, od okolicy przedwzrokowej do tylnego podwzgórza powodowały zwiększenie czasu czuwania i zmniejszenie czasu SWS i PS (hiposomnia). Wzrost czasu czuwania wynikał ze wzrostu liczby epizodów WT w hipokampie, jak również z wydłużenia czasu trwania epizodów W i WT. Zmniejszenie czasu snu (SWS i PS) wynikało ze zmniejszonej liczby epizodów snu. Wydłużeniu uległa także latencja SWS i PS. Chociaż efektywne uszkodzenia występowały najczęściej w przednim podwzgórzu, to znaczna hiposomnia ujawniła się również po lezjach usytuowanych w guzowym i tylnym LH. 2. Cytotoksyczna destrukcja ciał neuronalnych w LH (głównie w części guzowej) nie zmieniała zależności sen-czuwanie i w tym aspekcie były one różne od efektów elektrolitycznych lezji tej samej okolicy. www.sen.viamedica.pl 25 SEN 2001, Tom 1, Nr 1 3. Obustronne iniekcje muscimolu powodowały dawkozależną, blokowaną bikukuliną, 3–4-godzinną hiposomnię, podobną do efektów lezji elektrolitycznej tej okolicy. Wzrost ilości czuwania wynikał z wydłużenia epizodów W, a zmniejszenie czasu SWS powstało na skutek spadku liczby epizodów SWS. Zmniejszenie ilości PS wynikało ze zmniejszenia częstości epizodów oraz ich skrócenia. Wzrosła również latencja PS. W doświadczeniach I i II analizowano jednogodzinne próbki EEG szczurów pobrane między 3. a 6. godziną jasnego, nieaktywnego [58] okresu cyklu dobowego. Przy doborze pory dnia i czasu trwania pobranych próbek zapisu kierowano się doniesieniami, w których stwierdzono, że zaburzenia snu po lezjach LH [54], deprywacji cholinowej [59] lub zmianie temperatury otoczenia [60] występowały u szczura jedynie w okresie jasnym cyklu okołodobowego. Próbki jedno- i 12-godzinnego dziennego zapisu EEG w zakresie procentowego rozkładu snu i czuwania wykazują podobieństwo zarówno w warunkach kontrolnych, jak i po lezjach LH [55]. Procentowy rozkład snu i czuwania w zanotowanych przez autorkę jednogodzinnych rejestracjach kontrolnych jest prawie identyczny z 12-godzinnym rozkładem snu i czuwania w fazie jasnej, opisanym przez Li i Satinoff [58]. W poprzednich pracach jednogodzinne próbki zapisu okazały się reprezentatywne dla dziennej fazy cyklu sen-czuwanie szczura [47, 49, 50, 54] i wystarczające dla diagnozowania obecności hiposomnii bocznopodwzgórzowej [55]. Stwierdzone w niniejszej pracy zaburzenia cyklu senczuwanie polegały na zwiększeniu ilości czuwania (aktywności desynchronizacyjnej) przy jednoczesnej redukcji snu wolnofalowego i paradoksalnego. Pierwsze doniesienia na temat hiposomnii bocznopodwzgórzowej dotyczyły okresu zdrowienia po dużych uszkodzeniach elektrolitycznych [52]. Następnie w pracowni autorki [47, 49, 50, 54, 55] opisano hiposomnię w ostrym okresie po ograniczonych lezjach LH, a niniejsza praca jest rozwinięciem tych badań. Zanim ukazały się powyższe publikacje, panowało przekonanie, ugruntowane między innymi przez De Rycka i Teitelbauma [48], że uszkodzenia LH powodują trwałą synchronizację korową przebiegającą z lub bez behawioralnych objawów somnolencji. Trojniar i wsp. [49] wykazali, że taka hipersynchronizacja korowa dotyczy tylko dużych uszkodzeń, obejmujących także okoliczne struktury. Lezje małe lub średnich rozmiarów nie powodują zmian w obrazie aktywności elektrycznej kory, lecz redukują ilość snu oraz powodują wzrost ilości hipokampalnego rytmu theta w okresie czuwania i zmniejszenie częstotliwości tego rytmu [54]. Zatem relacje ilościowe między snem a czuwaniem są bardzo wrażliwe na uszkodzenia LH i pojawiają się już po relatywnie małych lezjach, natomiast zaburzenia desynchronizacji korowej występują dopiero po dużych uszkodzeniach niszczących znaczne obszary międzymózgowia. 26 Zmiany ilości snu i czuwania mogą wystąpić [11] na skutek uszkodzeń podwzgórzowych ośrodków termoregulacyjnych [10], zwłaszcza jeśli lezje zlokalizowane są w przednim podwzgórzu. Stwierdzono jednak, że LH nie jest niezbędne do integracji behawioralnych odpowiedzi termoregulacyjnych [61], a stosowane w pracowni autorki lezje bocznopodwzgórzowe nie powodowały zaburzeń temperatury ciała [54]. Ponieważ w niniejszej pracy niektóre z wykonanych lezji uszkadzały również przednie podwzgórze, mogły się one przyczynić do powstania zaburzeń termoregulacji. Zaburzeń tych nie można uznać jednak za przyczynę przedstawionych tu zmian ilości czuwania i snu, gdyż lezje usytuowane w guzowym i tylnym podwzgórzu wywoływały podobne efekty. Cytotoksyczne uszkodzenia okolicy guzowej LH nie powodowały istotnych zmian relacji ilościowych między snem a czuwaniem. Skutki lezji cytotoksycznych różniły się więc zdecydowanie od efektów lezji elektrolitycznych, mimo że lokalizacja uszkodzeń ibotenowych przynajmniej częściowo pokrywała się z lokalizacją najbardziej efektywnych lezji elektrolitycznych. Udział neuronów LH w powstawaniu hiposomnii po elektrolitycznych uszkodzeniach tej struktury jest więc wątpliwy. Raczej należy sądzić, że to przerwanie pewnych systemów włókien tworzących pęczek przyśrodkowy przodomózgowia, który na poziomie podwzgórza przebiega przez jego boczną okolicę, jest odpowiedzialne za ten efekt, tym bardziej, że hiposomnię stwierdzono po zniszczeniu LH na każdym poziomie jego wymiaru przednio-tylnego. Analiza elektrolitycznych uszkodzeń kwadrantów przekroju czołowego LH wykazała związek nasilenia zmian EEG z destrukcją bocznej części pęczka przyśrodkowego przodomózgowia w podwzgórzu przednim, grzbietowobocznej części w podwzgórzu guzowym i brzusznej części w podwzgórzu tylnym. Pęczek przyśrodkowy przodomózgowia zawiera około 50 wstępujących bądź zstępujących systemów włókien i około 13 różnych układów transmiterowych [45]. Trudno więc dokładnie określić, które z jego włókien mogą brać udział w procesie regulacji snu i czuwania. Najbardziej efektywne uszkodzenia obejmowały okolice odpowiadające strefom pęczka przyśrodkowego przodomózgowia według atlasu Nieuwenhuysa i wsp. [45] oznaczonym następująco: a, a1, e i d (przednie podwzgórze), e, e1 i e2 (podwzgórze guzowe) i a, d i g (tylne podwzgórze). Z dotychczasowych doniesień wynika [57], że strefa a zawiera głównie włókna zstępujące z części wielkokomórkowej okolicy przedwzrokowej i z drogi węchowej. Sektory d i e obejmują włókna eferentne z ciała migdałowatego i kory gruszkowatej, z jądra półleżącego i kompleksu jądro ogoniaste-skorupa oraz z kory czołowej. Brzuszna połowa pęczka przyśrodkowego przodomózgowia (odpowiadająca strefom a, d i g) prowadzi większość obustronnych włókien łączących przednie i tylne podwzgórze. www.sen.viamedica.pl Jolanta Orzeł-Gryglewska, EEG po uszkodzeniach podwzgórza u szczura Spośród specyficznych dróg, które mogły ulec uszkodzeniu przy efektywnych lezjach, na uwagę zasługują drogi serotonergiczne biegnące przez LH, ponieważ ich rolę w synchronizacji korowej i wpływie na pojawienie się snu (promowanie snu) dowiedziono w wielu doświadczeniach [62, 63]. Włókna serotoninowe rozpoczynają się w komórkach zlokalizowanych w jądrach szwu. Biegną one w przeważającej większości ipsilateralnie, jako zwarty pęczek, początkowo przez brzuszne pole nakrywkowe śródmózgowia, a od poziomu tylnej części LH jako brzuszna składowa pęczka przyśrodkowego przodomózgowia [64], w sektorach a, d i g według atlasu Nieuwenhuysa i wsp. [45]. W części guzowej podwzgórza włókna te mają częściowo przebieg pozapęczkowy (strefy a, a1, d, e, e1, e2 oraz f1), w części przedniej zajmują boczną część LH (sektory a, a1, c, c1), a na poziomie skrzyżowania wzrokowego skupiają się w brzusznie położony zwarty pęczek (a, a1). Niewątpliwie część tych włókien uległa uszkodzeniu przy lezjach elektrolitycznych, ponieważ w istotnie częściej uszkadzanych kwadrantach LH znajdują się między innymi sektory a i a1 podwzgórza przedniego, e, e1, i e2 podwzgórza guzowego oraz a i d podwzgórza tylnego. Uważa się jednak [65], że wstępujące projekcje serotonergiczne nie mają bezpośredniego znaczenia w kontrolowaniu snu, ponieważ neurotoksyczne lezje jąder szwu nie zaburzały wzorca SWS. Godne uwagi, z punktu widzenia wyników uzyskanych w niniejszej pracy, jest założenie przyjęte po raz pierwszy przez Nautę [1] i potwierdzone w badaniach Sallanona i wsp. [22], że regulacja cyklu sen-czuwanie może się odbywać przez zwrotne hamujące połączenia pomiędzy POAH (wywołującym SWS) i utrzymującym stan czuwania tylnym podwzgórzem. Mogą one przebiegać przez obszar LH, a ich zniszczenie w wyniku elektrokoagulacji znosiłoby hamujący wpływ POAH na tylne podwzgórze i powodowało przewagę stanu czuwania. Jak sugerują uzyskane przez autorkę wyniki, mimo wzajemnych zwrotnych wpływów przedniego i tylnego podwzgórza relacja w kierunku od POAH do PH wydaje się istotniejsza dla utrzymania równowagi między snem a czuwaniem niż relacja o kierunku przeciwnym. Przerwanie ciągłości pęczka przyśrodkowego przodomózgowia na którymkolwiek jego poziomie spowodowało bowiem takie same efekty jak uszkodzenie POAH, najprawdopodobniej na skutek zniesienia wpływów hamujących z POAH nie tylko na PH, ale i na układ siatkowaty śródmózgowia [2, 66] oraz na cholinergiczny kompleks LDTg/PPTg [67]. Chociaż po lezji LH zniszczeniu ulega prawdopodobnie również promująca czuwanie droga z PH do POAH, to pozostają nietknięte aktywujące połączenia PH z układem siatkowatym śródmózgowia [43], który, jak dobrze wiadomo, stanowi jeden z podstawowych elementów systemu struktur związanych z utrzymywaniem stanu czuwania i ma wstępujący przebieg pozapodwzgórzowy. SEN Niewiele dotąd wiadomo o podłożu mediatorowym przypuszczalnych obustronnych połączeń między POAH a PH biegnących przez LH. Istnieją dowody, że połączenia wstępujące mogą być histaminergiczne. Włókna takie, biorące prawdopodobnie udział w procesie wzbudzenia, mogą wysyłać również projekcje do innych okolic mózgu [31]. Według Lina i wsp. [20] histaminergiczne neurony w PH poprzez receptory H1 aktywują sąsiadujące z nimi histaminoceptywne komórki o nieznanym transmiterze. Te komórki z kolei bezpośrednio lub pośrednio (przez istotę bezimienną i cholinergiczne neurony wielkokomórkowe podstawnego przodomózgowia) aktywują neurony korowe i wywołują czuwanie oraz desynchronizację EEG. Histaminergiczne komórki PH, poprzez swoje projekcje do POAH, mogą wpływać hamująco na przedniopodwzgórzowe ośrodki indukujące sen, co jest realizowane poprzez receptory H1 lub H2 w zależności od mikroobwodów nerwowych w obrębie POAH. Tak więc zaproponowany przez Nautę [1] hipotetyczny obwód wzajemnych zwrotnych wpływów podwzgórzowych ośrodków snu i czuwania (w jego części wstępującej) mógłby być przynajmniej w części histaminergiczny. Analiza przebiegu wstępujących włókien histaminergicznych [68] wykazuje jednak, że projekcje te w większości przechodzą przez przyśrodkową część podwzgórza, a tylko nieznaczna część tych włókien wchodzi w skład pęczka przyśrodkowego przodomózgowia. Wydaje się więc, że w niniejszej pracy, w większości przypadków lezje nie naruszały systemu histaminergicznego i nie należy go brać pod uwagę w interpretacji przyczyn hiposomnii bocznopodwzgórzowej, zwłaszcza że po uszkodzeniach tego układu należałoby się raczej spodziewać hipersomnii. Wiele danych wskazuje na GABA-ergiczny charakter transmisji zstępującej między POAH a PH. Z wielkokomórkowego jądra przedwzrokowego, istoty bezimiennej oraz bocznej i przyśrodkowej okolicy przedwzrokowej, a także z przedniej części bocznego podwzgórza pochodzą GABA-ergiczne neurony okolicy POAH z bezpośrednimi projekcjami do bocznego PH [40]. Uszkodzenia przedniopodwzgórzowe w badaniu przeprowadzonym przez autorkę niszczyły z pewnością przynajmniej część tych komórek lub początkowe odcinki ich aksonów. W dalszym przebiegu projekcje te wykazują dyfuzyjny rozkład na poprzecznym przekroju pęczka przyśrodkowego przodomózgowia i dlatego musiały być w mniejszym lub większym stopniu uszkodzone przez wszystkie wykonane w czasie doświadczeń lezje. Stwierdzono, że komórki POAH o takich projekcjach są wysoce aktywne we śnie [9]. Natomiast podczas snu w PH znacznie zwiększa się wydzielanie GABA [41], co świadczy o udziale tego neuroprzekaźnika w okresowym hamowaniu aktywnych w czuwaniu neuronów tylnego podwzgórza. Iniekcje muscimolu do PH powodują u kotów sen, nawet po uprzednio wywołanej doświadczalnej insom- www.sen.viamedica.pl 27 SEN 2001, Tom 1, Nr 1 nii [22, 31]. W badaniach autorki po podaniu muscimolu do LH zanotowano wzrost czuwania przy jednoczesnej hiposomnii, który wystąpił w pierwszych godzinach po iniekcji. Bikukulina w większości przypadków znosiła objawy wywołane przez muscimol, co wskazuje, że obszar iniekcji zawiera GABA-ceptywne neurony, których inaktywacja powoduje wzrost czasu czuwania. Interpretacja zmian wzorca sen-czuwanie po iniekcji muscimolu wobec braku efektu kwasu ibotenowego podanego do analogicznych okolic LH jest utrudniona, ponieważ prawdopodobnie zniszczenie i okresowa inaktywacja neuronów danej okolicy powinny przynosić podobne rezultaty, zwłaszcza że u kilku zwierząt podawano w to samo miejsce najpierw muscimol, a potem kwas ibotenowy. U tych szczurów, podobnie jak w całej grupie doświadczalnej, efekty obu iniekcji były przeciwstawne, nie jest więc możliwe, by wynikały one z przypadkowych odchyleń implantowanych kaniul. Być może regulacja snu i czuwania na poziomie podwzgórza w równym stopniu zależy od wzajemnych zwrotnych wpływów POAH i PH, jak i od sieci neuronalnej bocznego i tylnego podwzgórza, zawierającej neurony o różnych mediatorach i receptorach i różnym stopniu wrażliwości na stosowane środki farmakologiczne. Wiadomo, że muscimol wiąże się z receptorami GABAA [69], natomiast kwas ibotenowy działa przez receptory aminokwasów pobudzających, na przykład receptor NMDA1 [70] i uszkadza w większym stopniu neurony cholinergiczne. Nie rozstrzygnięto, do jakiego stopnia różnice te mogą wpływać na obserwowane zmiany wzorca snu i czuwania. Inną przyczyną odmiennych efektów inaktywacji lub destrukcji neuronów LH może być różny czas obserwacji tych zmian. Pierwszej rejestracji po iniekcji kwasu ibotenowego dokonano 24 godziny po zabiegu, natomiast efekty działania muscimolu badano w czasie pierwszych 6 godzin po iniekcji. Wiadomo [70], że iniekcja kwasu ibotenowego do podstawnego przodomózgowia powoduje po przeminięciu narkozy około 6-godzinne zaburzenia postawy i lokomocji oraz pobudzenie ruchowe lub drgawki. Po tym okresie zaburzenia te trwale ustępują. Zatem w czasie degeneracji uszkodzonych neuronów pewne ich funkcje mogą przejmować inne elementy rozległego układu kontroli snu i czuwania. Na uwagę zasługuje fakt, że w pracach Jouveta dotyczących kotów również nie stwierdzono żadnych znaczących zmian cyklu sen-czuwanie po dopodwzgórzowych iniekcjach kwasu ibotenowego, podczas gdy muscimol podany do tej samej struktury wywoływał wyraźny efekt [22, 29– –31]. Być może na poziomie LH muscimol działa nie tylko na neurony, lecz także na hamujące synapsy GABA-ergiczne pochodzące z neuronów pozapodwzgórzowych. W warunkach naturalnych taka GABAA-ergiczna inhibicja LH może pochodzić z niespecyficznych jąder wzgórza [71] lub też z innych okolic. Synapsy o takim działaniu mogą się znajdować na aksonach GABA-ergicznych, łączących przed- 28 nie i tylne podwzgórze (będących podłożem wpływów hamujących POAH na neurony desynchronizujące w PH). Zwiększenie aktywności tych synaps po podaniu muscimolu może prowadzić więc do odhamowania tylnego podwzgórza i w rezultacie do wzrostu ilości czuwania. Weryfikacja histologiczna miejsca iniekcji muscimolu przeprowadzona w niniejszej pracy wykazała, że kaniule znajdowały się u większości zwierząt na granicy podwzgórza przedniego i guzowego. W przypadku takiej lokalizacji Lin i wsp. [31] zaobserwowali u kota hipersomnię. Aby wyjaśnić te odmienności, można brać pod uwagę różnice gatunkowe, zauważalne na przykład w lokalizacji i funkcjonowaniu cholinergicznych mechanizmów sterujących snem paradoksalnym [72]. Przykładowo wzrost ilości PS, następujący po iniekcji karbacholu do okolicy przedniego mostu u szczurów, przejawia się wzrostem liczby epizodów PS, natomiast u kotów wydłuża się czas trwania poszczególnych epizodów. Efekty inaktywacji LH u kota mogą być więc inne od efektów analogicznej inaktywacji u szczura. Zmiany dotyczące liczby i czasu trwania epizodów czuwania po lezjach wiązały się najczęściej z przesunięciem proporcji między W i WT (wzrost liczby epizodów WT kosztem czasu trwania epizodów W). Wyniki te są zgodne z doniesieniami Jurkowlaniec i wsp. [54], w których stwierdzono, że po uszkodzeniach bocznopodwzgórzowych, hipokampalny EEG szczura jest zdominowany przez rytm theta, który traci swój związek z behawiorem zwierzęcia, co może wskazywać, że przez LH biegnie system neuronalny, tłumiący synchroniczną aktywność hipokampa. Z analizy zmian liczby i czasu trwania epizodów snu wolnofalowego i paradoksalnego wynika, że lezje lub inaktywacja LH utrudniają rozpoczęcie epizodu SWS, o czym świadczy zmniejszenie się liczby jego epizodów przy braku istotnego wpływu na czas trwania pojedynczego epizodu. Zatem system utrzymywania rozpoczętego epizodu SWS po lezjach LH prawdopodobnie nie jest uszkodzony. Natomiast lezja lub iniekcja muscimolu do guzowej części LH zaburzają liczbę i czas trwania epizodów PS, co sugeruje, że został naruszony zarówno system inicjowania, jak i utrzymywania tej fazy snu [73]. Na zaburzenia w obrębie układów inicjujących sen wskazuje również wydłużenie latencji SWS i PS. Na uwagę zasługuje fakt, że lezje elektrolityczne i iniekcje muscimolu do LH powodują nie tylko zmiany proporcji między snem a czuwaniem, ale również zaburzają fazę snu paradoksalnego. W klasycznej neurofizjologii przyznawano podwzgórzu udział w regulacji SWS, zaś powstanie i utrzymanie fazy PS łączono przede wszystkim ze strukturami tyłomózgowia [72] oraz aktywującym układem siatkowatym [74]. Wyniki otrzymane w niniejszej pracy są zgodne z doniesieniami Lina i wsp. [31] oraz Denoyera i wsp. [30] wskazującymi, że za supresję PS może odpowiadać pewna populacja neuronów tylnego podwzgórza. Natomiast www.sen.viamedica.pl Jolanta Orzeł-Gryglewska, EEG po uszkodzeniach podwzgórza u szczura Sallanon i wsp. [22] uważają, że uszkodzenia przyśrodkowo-brzusznej części podwzgórza przedwzrokowego wpływają na zaburzenia snu paradoksalnego. Celem tej pracy było poznanie roli LH w systemie regulacji cyklu snu i czuwania poprzez charakterystykę zaburzeń tego cyklu po uszkodzeniach lub okresowej inaktywacji LH oraz analizę podłoża morfologicznego stwierdzonych zmian. Okazało się, że dominującym efektem uszkodzeń elektrolitycznych oraz aktywacji GABA-ergicznej (muscimol) tej okolicy jest hiposomnia. Bocznopodwzgórzowe zaburzenia snu zależą najprawdopodobniej od włókien pęczka przyśrodkowego przodomózgowia, ponieważ efekt hiposomnii był niezależny od miejsca przerwania tego pęczka i nie wystąpił po zniszczeniu cytotoksycznym ciał neuronalnych LH. Topografia najbardziej efektywnych uszkodzeń w korelacji z przebiegiem poznanych dotąd składowych pęczka przyśrodkowego przodomózgowia pozwala stwierdzić, że najistotniejsze mogą być zwrotne połączenia między POAH a PH, a w szczególności hamujące wpływy zstępujące z POAH do tylnego podwzgórza. Paradoksalny efekt muscimolu można ewentualnie tłumaczyć specyficzną budową wewnątrzpodwzgórzowych obwodów neuronalnych u szczura. SEN n Wnioski 1. Uzyskane wyniki wskazują, że boczne podwzgórze należy do układu czynnościowego, który wiąże się z regulacją cyklu snu i czuwania, gdyż naruszenie integralności tej struktury powoduje zaburzenia relacji sen-czuwanie w kierunku wzrostu ilości czuwania z towarzyszącym zmniejszeniem ilości snu wolnofalowego i paradoksalnego. 2. Lezje elektrolityczne bocznego podwzgórza wywołują hiposomnię. Efekt ten zależy prawdopodobnie od przerwania włókien pęczka przyśrodkowego przodomózgowia, przebiegającego przez boczne podwzgórze, ponieważ selektywna destrukcja ciał komórkowych tej okolicy nie wywołała zaburzeń relacji ilościowych między snem a czuwaniem, a wystąpienie hiposomnii nie zależało od poziomu przednio-tylnego przerwania pęczka. 3. Aktywacja elementów GABA-ergicznych bocznego podwzgórza wywołuje również hiposomnię, być może przez oddziaływanie na synapsy kontrolujące zwrotne połączenia między ośrodkami przedniego (wywoływanie snu wolnofalowego) i tylnego (desynchronizacja) podwzgórza. n Streszczenie Badanie EEG po uszkodzeniu bocznego podwzgórza u szczura Wstęp. Obustronne elektrolityczne uszkodzenia bocznego podwzgórza (LH) u szczura powodują znaczne zmniejszenie czasu snu. Celem pracy jest określenie anatomicznego podłoża hiposomnii bocznopodwzgórzowej. Materiał i metody. W grupie szczurów z elektrolitycznymi lezjami LH badano zależność pomiędzy nasileniem zaburzeń snu a rozległością uszkodzenia i jego lokalizacją (zwłaszcza w obrębie włókien pęczka przyśrodkowego przodomózgowia (MFB, medial forebrain bundle). W kolejnych doświadczeniach dokonano selektywnej destrukcji komórek bocznego podwzgórza poprzez obustronne iniekcje kwasu ibotenowego (IBO) w dawce 0,3 mg i okresowego zahamowania neuronów LH poprzez obustronne iniekcje muscimolu (MSC) w dawkach: 0, 25, 50 i 100 ng. Sen i czuwanie monitorowano za pomocą zapisu EEG z elektrod rejestrujących czynność hipokampa i kory mózgowej (jednogodzinne, poranne rejestracje w grupach LH i IB0 do 14 dnia po lezji; 6-godzinne, jednorazowe badania w grupie MSC). W każdym zapisie określano procentowy udział czuwania, snu wolnofalowego i paradoksalnego, liczbę i czas trwania epizodów poszczególnych typów aktywności EEG oraz latencję snu. Wyniki. Stwierdzono, że znaczna hiposomnia występuje wskutek uszkodzenia struktur LH/MFB na każdym poziomie jego osi przednio-tylnej, od okolicy przedwzrokowej do tylnego podwzgórza. Najbardziej efektywne uszkodzenia przerywały zstępujące projekcje z okolicy przedwzrokowej/przedniego podwzgórza (prawdopodobnie GABA-ergiczne projekcje z przedniego do tylnego podwzgórza i „ośrodków czuwania” pnia mózgu), struktur węchowych, brzusznego prążkowia, ciała migdałowatego, jak również włókna łączące LH z tworem siatkowatym pnia mózgu. Nie stwierdzono żadnej wyraźnej zależności pomiędzy uszkodzeniami wywołanymi przez IBO a rytmem snu i czuwania. Natomiast iniekcje MSC wywoływały zależne od dawki wydłużenie czasu czuwania, najbardziej nasilone przy dawce 50 ng. Zjawisko to było blokowane przez bikukulinę. Wnioski. Można sądzić, że bocznopodwzgórzowe zaburzenia snu wiążą się raczej z przerwaniem pewnego systemu(ów) włókien nerwowych przechodzących przez LH niż ze zniszczeniem zlokalizowanej grupy neuronów. Otrzymane wyniki wskazują także na zaangażowanie układu GABA-ergicznego w regulację cyklu sen-czuwanie. Słowa kluczowe: boczne podwzgórze, EEG, regulacja snu www.sen.viamedica.pl 29 SEN 2001, Tom 1, Nr 1 Piśmiennictwo 1. Nauta W.J.H. Hypothalamic regulation of sleep in rats: an experimental study. J. Neurophysiol. 1946; 9: 285–316. 2. Szymusiak R. McGinty D. Effects of basal forebrain stimulation on the waking discharge of neurons in the midbrain reticular formation of cats. Brain Res. 1989; 498: 355–359. 3. Szymusiak R. McGinty D. Sleep-related neuronal discharge in the basal forebrain of cats. Brain Res. 1986; 370: 82–92. 4. Mc Ginty D.J., Sterman M.B. Sleep suppression after basal forebrain lesions in the cat. Science 1968; 160: 1253–1255. 5. Szymusiak R. McGinty D. Sleep suppression following kainic acid-induced lesions of the basal forebrain. Exp. Neurol. 1986; 94: 598–614. 6. Sterman M.B., Clemente C.D. Forebrain inhibitory mechanisms: cortical synchronization induced by basal forebrain stimulation. Exp. Neurol. 1962; 6: 91–102. 7. Sterman M.B., Clemente C.D. Forebrain inhibitory mechanisms: sleep patterns induced by basal forebrain stimulation in the behaving cat. Exp. Neurol. 1962; 6: 103–117. 8. Mallick B.N., Alam M.N. Different types of norepinephrinergic receptors are involved in preoptic area mediated independent modulation of sleep-wakefulness and body temperature. Brain Res. 1992; 591: 8–19. 9. Sherin J.E., Shiromani P.J., McCarley R.W., Saper C.B. Activation of ventrolateral preoptic neurons during sleep. Science 1996; 271: 216–219. 10. Cooper K.E. Temperature regulation and the hypothalamus. Br. Med. Bull. 1966; 22: 238–242. 11. Mc Ginty D., Szymusiak R. Keeping cool: a hypothesis about the mechanisms and functions of slow wave sleep. Trends Neurosci. 1990; 13: 480–487. 12. Alam M.N., McGinty D., Szymusiak R. Thermosensitive neurons of the diagonal band in rats: relation to wakefulness and nonrapid eye movement sleep. Brain Res. 1997; 752: 81–89. 13. Krilowicz B.L., Szymusiak R., McGinty D. Regulation of posterior lateral hypothalamic arousal related neuronal discharge by preoptic anterior hypothalamic warming. Brain Res. 1994; 668: 30–38. 14. Alam M.N., Szymusiak R., McGinty D. Local preoptic/anterior hypothalamic warming alters spontaneous and evoked neuronal activity in the magno-cellular basal forebrain. Brain Res. 1995; 696: 221–230. 15. Morairty S.R., Szymusiak R., Thomson D., Mc Ginty D. Selective increases in non-rapid eye movement sleep following whole body heating in rats. Brain Res. 1993; 617: 10–16. 16. Szymusiak R., Danowski J., McGinty D. REM sleep-suppressing effects of atropine in cats vary with environmental temperature. Brain Res. 1994; 636: 115–118. 17. Szymusiak R., Danowski J., Mc Ginty D. Exposure to heat restores sleep in cats with preoptic/anterior hypothalamic cell loss. Brain Res. 1991; 541: 134–138. 18. Sakaguchi S., Glotzbach S.F., Heller H.C. Influence of hypothalamic and ambient temperatures on sleep in kangaroo rats. Am. J. Physiol. 1979; 237: R80–R88. 19. Mc Ginty D., Szymusiak R., Thomson D. Preoptic/anterior hypothalamic warming increases EEG delta frequency activity within non-rapid eye movement sleep. Brain Res. 1994; 667: 273–277. 20. Lin J.S., Sakai K., Jouvet M. Hypothalamo-preoptic histaminergic projections in sleep-wake control in the cat. Eur. J. Neurosci. 1994; 6: 618–625. 21. Fisher R.S., Buchwald N.A., Hull C.D., Levine M.S. GABAergic basal forebrain neurons project to neocortex: the localization of glutamic acid decarboxylase and choline acetyltransferase in feline corticopetal neurons. J. Comp. Neurol. 1988; 272: 489–502. 22. Sallanon M., Denoyer M., Kitahama K., Aubert C., Gay N., Jouvet M. Long-lasting insomnia induced by preoptic neuron lesions and its transient reversal by muscimol injection into the posterior hypothalamus in the cat. Neuroscience 1989; 32: 669–683. 30 23. Koyama Y., Hayaishi O. Firing of neurons in the preoptic/anterior hypothalamic areas in rat: its possible involvement in slow wave sleep and paradoxical sleep. Neurosci. Res. 1994; 19: 31–38. 23. Yang Q.Z., Hatton G.I. Excitatory and inhibitory inputs to histaminergic tuberomammillary nucleus (TM) neurons in rat. Soc. Neurosci. Abstr. 1994; 20: 150–155. 24. Glotzbach S.F., Cornett C.M., Heller H.C. Activity of suprachiasmatic and hypothalamic neurons during sleep and wakefulness in the rat. Brain Res. 1987; 419: 279–286. 25. Alam M.N., Mc Ginty D., Szymusiak R. Preoptic/anterior hypothalamic neurons: thermosensitivity in rapid eye movement sleep. Am. J. Physiol. 1995; 269: R1250–R1257. 26. Economo von C. Die Pathologie der Schlafes. W: Bethe A., Bergmann von G., Embden G., Ellinger A. red. Handbuch der normalen und pathologischen physiologie. Springe, Berlin 1926; 17: 591–610. 27. Saper C.B. Organization of cerebral cortical afferent systems in the rat. II. Hypothalamocortical projections. J. Comp. Neurol. 1985; 237: 21–46. 28. Sakai K., El Mansari M., Lin J.S., Zhang J.G., Vanni-Mercier G. The posterior hypothalamus in the regulation of wakefulness and paradoxical sleep. W: Mancia M., Marini G. red. The diencephalon and sleep. Raven Press, New York 1990; 171–198. 29. Sallanon M., Sakai K., Buda C., Puymartin M., Jouvet M. Increase of paradoxical sleep induced by microinjections of ibotenic acid into the ventrolateral part of the posterior hypothalamus in the cat. Arch. Ital. Biol. 1988; 126: 87–97. 30. Denoyer M., Sallanon M., Buda C., Kitahama K., Jouvet M. Neurotoxic lesion of the mesencephalic reticular formation and/or the posterior hypothalamus does not alter waking in the cat. Brain Res. 1991; 539: 287–303. 31. Lin J.S., Sakai K., Vanni-Mercier G., Jouvet M. A critical role of the posterior hypothalamus in the mechanisms of wakefulness determined by microinjection of muscimol in freely moving cats. Brain Res. 1989; 479: 225–240. 32. Denoyer M., Sallanon M., Buda C., Delhomme G., Dittmar A., Jouvet M. The posterior hypothalamus is responsible for the increase of brain temperature during paradoxical sleep. Exp. Brain Res. 1991; 84: 326–334. 33. Lin J.S., Sakai K., Jouvet M. Evidence for histaminergic arousal mechanisms in the hypothalamus of cat. Neuropharmacol. 1988; 27: 111–122. 34. Lin, J.S., Hou Y., Sakai K., Jouvet M. Histaminergic descending inputs to the mesopontine tegmentum and their role in the control of cortical activation and wakefulness in the cat. J. Neurosci. 1996; 16: 1523–1537. 35. Vanderwolf C.H. Hippocampal electrical activity and voluntary movement in the rat. Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1969; 26: 407–418. 36. Kocsis B., Vertes R.P. Characterization of neurons of the supramammillary nucleus and mammillary body that discharge rhythmically with the hippocampal theta rhythm in the rat. J. Neurosci. 1994; 14: 7040–7052. 37. Kirk I., McNaughton M. Supramammillary cell firing and hippocampal rhytmical slow activity. Neuroreport 1991; 2: 723–725. 38. Vertes R.P., Colom L.V., Fortin W.J., Bland B.H. Brainstem sites for the carbachol elicitation of the hippocampal theta rhythm in the rat. Exp. Brain Res. 1993; 96: 419–429. 39. Gottesmann C. The transition from slow-wave sleep to paradoxical sleep: evolving facts and concepts of the neurophysiological processes underlying the intermediate stage of sleep. Neurosci. Biobehav. Rev. 1996; 20: 367–387. 40. Gritti I., Mainville L., Jones B.E. Projections of GABAergic and cholinergic basal forebrain and GABAergic preoptic-anterior hypothalamic neurons to the posterior lateral hypothalamus of the rat. J. Comp. Neurol. 1994; 339: 251–268. 41. Nitz D., Siegel J.M. GABA release in posterior hypothalamus across sleep-wake cycle. Am. J. Physiol. 1996; 271: R1707–R1712. www.sen.viamedica.pl Jolanta Orzeł-Gryglewska, EEG po uszkodzeniach podwzgórza u szczura 42. Kitahama K., Sallanon M., Okamura H., Geffard M., Jouvet M. Cells presenting GABA immunoreactivity in the hypothalamus of the cat. C. R. Acad. Sci. III, 1989; 308: 507–511. 43. Vertes R.P., Crane A.M. Descending projections of the posterior nucleus of the hypothalamus: Phaseolus vulgaris leucoagglutinin analysis in the rat. J. Comp. Neurol. 1996; 374: 607–631. 44. Steriade M., McCarley R.W. Brainstem control of wakefulness and sleep. Plenum Press, New York, 1990, 15–21. 45. Nieuwenhuys R., Geeraedts L.M.C., Veening J.G. The medial forebrain bundle of the rat. General introduction. J. Comp. Neurol. 1982; 206: 49–81. 46. Barone F.C., Wayner M.J., Scharoun S.L., Guevara-Aguilar R., Agilar-Baturoni H.V. Afferent connections to the lateral hypothalamus: a horseradish peroxidase study in the rat. Brain Res. Bull. 1981; 7: 75–88. 47. Trojniar W. Analiza podłoża morfologicznego wybranych objawów zespołu bocznego podwzgórza u szczura. Wydawnictwo Uniwersytetu Gdańskiego, Gdańsk 1991. 48. DeRyck M., Teitelbaum P. Neocortical and hippocampal EEG in normal and lateral hypothalamic-damaged rats. Physiol. Behav. 1978; 20: 400–409. 49. Trojniar W., Jurkowlaniec E., Ozorowska T. Disturbances in sleep-waking pattern and cortical desynchronization after lateral hypothalamic damage: effect of the size of the lesion. Acta Neurobiol. Exp. 1990; 50: 81–91. 50. Trojniar W., Jurkowlaniec E., Orzeł-Gryglewska J., Tokarski J. The effect of lateral hypothalamic lesions on spontaneous EEG pattern in rats. Acta Neurobiol. Exp. 1987; 47: 27–43. 51. Trojniar W., Jurkowlaniec E., Tokarski J. Enhanced electroencephalographic waking coexists with behavioral somnolence in lateral hypothalamic rats. Neuroscience 1987; 22 (supl.) 493: 147. 52. Danguir J., Nicolaidis S. Cortical activity and sleep in the rat lateral hypothalamic syndrome. Brain Res., 1980; 185: 305–321. 53. Winn P., Stone T.W., Latimer M., Hastings M.H., Clark A.J. A comparison of excitotoxic lesions of the basal forebrain by kainate, quinolinate, ibotenate, N-methyl-D-aspartate or qusiqualate, and the effects on toxicity of 2-amino-5-phosphonovaleric and kynurenic acid in the rat. Br. J. Pharmacol. 1991; 102: 904–908. 54. Jurkowlaniec E., Trojniar W., Ozorowska T., Tokarski J. Differential effect of damage to the lateral hypothalamic area on hippocampal theta rhythm during waking and paradoxical sleep. Acta Neurobiol. Exp. 1989; 49: 153–169. 55. Jurkowlaniec E., Trojniar W., Tokarski J. Daily pattern of EEG activity in rats with lateral hypothalamic lesions. J. Physiol. Pharmacol. 1994; 45: 399–411. 56. Paxinos G., Watson Ch. The rat brain in stereotaxic coordinates. Academic Press Inc, San Diego, California 1986. 57. Veening J.G., Swanson L.W., Cowan W.M., Nieuwenhuys R., Geeraedts L.M.G. The medial forebrain bundle of the rat. II. An autoradiographic study of the topography of the major descending and ascending components. J. Comp. Neurol. 1982; 206: 82–108. SEN 58. Li H., Satinoff E. Changes in circadian rhythms of body temperature and sleep in old rats. Am. J. Physiol. 1995; 269: R208–R214. 59. Szymusiak R., Mc Ginty D., Fairchild M.D., Jenden D.J. Sleepwake disturbances in an animal model of chronic cholinergic insufficiency. Brain Res. 1993; 629: 141–145. 60. Gao, B., P. Franken, I. Tobler, A.A. Borbély. Effect of elevated ambient temperature on sleep, EEG spectra, and brain temperature in the rat. Am. J. Physiol. 1995; 268: R1365–R1373. 61. Refinetti R., Carlisle H.J. Effect of lateral hypothalamic lesions on thermoregulation in the rat. Physiol. Behav. 1986; 38: 219– –228. 62. Jouvet M. The role of monoamines and acetylocholine-containing neurons in the regulation of sleep-waking cycle. Ergeb. Physiol., Biol. Chem. Exp. Pharmacol. 1972; 64: 166–307. 63. Houdouin F., Cespuglio R., Jouvet M. Effects induced by the electrical stimulation of the nucleus raphe dorsalis upon hypothalamic release of 5-hydroxyindole compounds and sleep parameters in the rat. Brain Res. 1991; 565: 48–56. 64. Ungerstedt U. Stereotaxic mapping of the monoamine pathways in the rat brain. Acta Physiol. Scand. 1971; (supl.) 367: 1–48. 65. Vanderwolf C.H., Leung L.W.S., Baker G.B., Steward D.J. The role of serotonin in the control of cerebral activity: studies with intracerebral 5,7-dihydroxytryptamine. Brain Res. 1989; 504: 181–191. 66. Bremer F. Existence of mutual tonic inhibitory interaction between the preoptic hypnogenic structure and the midbrain reticular formation. Brain Res. 1975; 96: 71–75. 67. Webster H.H., Jones B.E. Neurotoxic lesions of the dorsolateral mesencephalic tegmentum cholinergic cell area in the cat: effects upon sleep-waking states. Brain Res. 1988; 458: 285–302. 68. Watanabe,T. Taguchi Y., Shiosaka S., Tanaka J., Kubota H., Terano Y., Tohyama M., Wada H. Distribution of the histaminergic neuron system in the central nervous system of rats: a fluorescent immunohistochemical analysis with histidine decarboxylase as a marker. Brain Res. 1984; 295: 13–25. 69. Bowery N.G., Price G.W., Hudson D.R., Hill D.P., Wilkin G.P., Turnbull M.J. GABA receptor multiplicity, visualization of different receptor types in the mammalian CSN. Neuropharmacol. 1984; 23: 219–231. 70. Winn P. Exicitotoxins as tools for producing brain lesions. Meth. Neurosci. 1991; 7: 16–27. 71. Barone F.C., Cheng J.T., Wayner M.J. GABA inhibition of lateral hypothalamic neurons: role of reticular thalamic afferents. Brain Res. Bull. 1994; 33: 699–708. 72. Gnadt J.W., Pegram G.V. Cholinergic brainstem mechanisms of REM sleep in the rat. Brain Res. 1986; 384: 29–41. 73. Gandolfo G., Gauthier P., Arnaud C., Gottesmann C. Influence of paradoxical sleep deprivation on the intermediate stage of sleep in the rat. Neurosci. Res. 1996; 25: 123–127. 74. Mc Ginty D.J. Somnolence, recovery and hyposomnia following ventromedial diencephalic lesions in the rat. Electroenceph. Clin. Neurophysiol. 1969; 26: 70–79. www.sen.viamedica.pl 31