Nr kat. IR616

FLEX
Monoclonal Mouse
Anti-Human
p53 Protein
Klon DO-7
Ready-to-Use
(Link)
Nr kat. IR616
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human p53 Protein, Ready-to-Use, (Link), jest przeznaczone do
stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciało barwi natywne i zmutowane białko p53
i jest uŜyteczne w identyfikacji akumulacji białka p53 w nowotworach ludzkich (1, 2, 3). Interpretacja kliniczna
wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich
prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby
pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Streszczenie
i informacje ogólne
p53 to fosfoproteina jądrowa o masie cząsteczkowej 53 kDa. Natywne białko p53 występuje w róŜnych komórkach
prawidłowych, ale ma bardzo krótki okres połowicznego rozpadu, dlatego występuje tylko w niewielkich ilościach (1)
poniŜej progu wykrywania metodami immunohistochemicznymi (4). Mutacja somatyczna genu p53 to zdarzenie
bardzo częste w rozwoju nowotworów ludzkich, a poniewaŜ zmutowane formy p53 są duŜo bardziej stabilne niŜ
formy natywne, zmutowane białko p53 gromadzi się w wysokich ilościach (1). Na przykład: akumulację p53
stwierdzono w 76% z 212 ludzkich zmian złośliwych, które obejmowały raki sutka, okręŜnicy i Ŝołądka, a takŜe
czerniaka, raka zarodkowego jądra, raka z komórek nabłonka przejściowego pęcherza moczowego, raka macicy i
mięsaki tkanek miękkich (5).
Natywne białko p53 działa jako czynnik transkrypcyjny, tj. jako modulator, który moŜe powodować aktywację i
dezaktywację istotnych genów. Białko stanowi równieŜ inhibitor replikacji DNA i jest molekułą kontrolną w postępie
cyklu Ŝycia komórki. Ponadto białko p53 jest zaangaŜowane w regulację apoptozy (2). W próbach transfekcji
natywne białko p53 wywiera na nowotwory działanie supresorowe, a zmutowane białko p53 działa jako dominujący
onkogen transformujący (1).
Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Dostarczany
odczynnik
Gotowe do uŜycia mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko
stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L.
Klon: DO-7 (1). Izotyp: IgG2b, kappa.
Immunogen
Rekombinowane ludzkie natywne białko p53 (1).
Swoistość
W teście Western blot lizatów linii komórkowej A431 ludzkiego raka sromu przeciwciało barwiło prąŜek 53 kDa, który
odpowiada zmutowanej postaci p53 obecnej w komórkach z linii A431. Epitop rozpoznany przez przeciwciało
znajduje się między aminokwasami 1 i 45 końca N, a takŜe prawdopodobnie między aminowaksami 37 i 45
ludzkiego białka p53 (1).
Analiza SDS-PAGE immunoprecypitatów wytwarzanych w reakcji przeciwciał z lizatami komórek z linii BT474 raka
sutka wykazuje reakcję z białkiem 53 kDa odpowiadającym p53 (1).
W badaniach immunohistochemicznych przeciwciało barwi zmutowane białko p53 w linii komórek A431 i natywne
białko p53 w linii komórek SVK14 (linia keratynocytów transformowanych SV40) (1).
Środki ostroŜności
1. Odczynniki przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. StęŜenie NaN3
występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3 z ołowiem lub
miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy
usuwaniu resztek odczynnika uŜywać duŜych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się
azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3. Podobnie jak w przypadku kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
4. NaleŜy stosować właściwe wyposaŜenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź
oczami.
5. Niewykorzystany odczynnik naleŜy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi.
(117354-002)
Dako Denmark A/S
IR616/PL/MNI/2009.12.04 s. 1/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na opakowaniu. JeŜeli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane na ulotce dołączanej do opakowania, UŜytkownik
powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Z tego
względu jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach
laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia
technicznego firmy Dako.
Przygotowanie
próbek i materiały
dodatkowe
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat.
PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje
się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH
(50x) (nr kat. K8000/K8004).
Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury
wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)
(nr kat. K8000/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone
zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania.
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisane dla skrawków
parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020).
Wykonanie odczynu
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Link) (nr kat. K8000). W systemie Autostainer Link
wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Zalecana objętość uŜytego odczynika to 1 x 200 µL lub
2 x 150 µL na preparat. Szczegółowe informacje dotyczące wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników
przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym
urządzeniu Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Wszystkie procedury
inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału oraz sposobów jego przygotowania i
powinny być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. JeŜeli patolog oceniający preparat Ŝyczy sobie
wybarwienia innym natęŜeniu, czasy inkubacji oraz uŜycie szablonów wizualizacji EnVision FLEX/EnVision
FLEX+ mogą zostać zmienione. W celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu, naleŜy
skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie
zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe — w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części
„Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Link)
(nr kat. K8008). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować okręŜnicę i
gruczolakoraka okręŜnicy, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać
odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to
FLEX Negative Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750).
Interpretacja odczynu
Komórki barwione przeciwciałem zwykle wykazują odczyn jądrowy, ale w niektórych przypadkach zgłaszano równieŜ
odczyn cytoplazmatyczny (6).
Charakterystyka
wydajnościowa
Tkanki prawidłowe: W przypadku międzybłonka prawidłowego i reaktywnego przeciwciało zabarwiło 0/40
przypadków, a 27 międzybłoniakach komórki prawidłowe np. fibroblasty i komórki śródbłonka nie dały odczynu (3).
W okręŜnicy tylko pojedyncze komórki łagodnie zmienionego nabłonka podstawnego wykazywały słaby lub
umiarkowany odczyn jądrowy.
Tkanki nieprawidłowe: W chłoniakach typu grudkowego wzrost akumulacji p53 zaobserwowano w centroblastach, w
których odczyn dodatni wykazywały następujące klasy zmian morfologicznych: klasa I (1/16), klasa ll (10/21) i klasa
III (6/6) (4). W międzybłoniakach przeciwciało barwiło 7/26 przypadków typu nabłonkowego (1 do 25% komórek
zabarwionych), 1/7 przypadków mieszanych (25 do 50% komórek zabarwionych) i 1/3 przypadków
mesenchymalnych (więcej niŜ 75% zabarwionych komórek) (3). W chłoniaku Hodgkina przeciwciało barwi 65% lub
więcej komórek (co oznacza obecność p53), a w chłoniakach innych niŜ Hodgkina przeciwciało barwi około 50%
komórek (2). Komórki nowotworowe raka gruczołowego okręŜnicy wykazują odczyn jądrowy w zakresie od
umiarkowanego do silnego.
Piśmiennictwo
1.
Vojtĕšek B, Bártek J, Midgley CA, Lane DP. An immunochemical analysis of the human nuclear phosphoprotein
p53. New monoclonal antibodies and epitope mapping using recombinant p53. J Immunol Methods 1992;
151:237–44.
2.
Nieder C, Petersen S, Petersen C, Thames HD. The challenge of p53 as prognostic and predictive factor in
Hodgkin’s or non-Hodgkin’s lymphoma (review). Ann Hematol 2001;80:2–8.
3.
Ramael M, Lemmens G, Eerdekens C, Buysse C, Deblier I, Jacobs W, et al. Immunoreactivity for p53 protein in
malignant mesothelioma and non-neoplastic mesothelium. J Pathol 1992; 168:371–5.
4.
Cooper K, Haffajee Z. bcl-2 and p53 protein expression in follicular lymphoma. J Pathol 1997; 182:307–10.
5.
Bártek J, Bártková J, Vojtĕšek B, Stašková Z, Lukáš J , Rejthar A, et al. Aberrant expression of the p53
oncoprotein is a common feature of a wide spectrum of human malignancies. Oncogene 1991; 6:1699–703.
6.
Kontogeorgos G, Kapranos N, Thodou E, Sambaziotis D, Tsagarakis S. Immunocytochemical accumulation of
(117354-002)
Dako Denmark A/S
IR616/PL/MNI/2009.12.04 s. 2/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
p53 in corticotroph adenomas: Relationship with heat shock proteins and apoptosis. Pituitary 1999; 1:207–12.
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
ZuŜyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Zawartość wystarcza na <n>
testów
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
(117354-002)
Dako Denmark A/S
IR616/PL/MNI/2009.12.04 s. 3/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17