Biodegradacja odpadów tłuszczowych

Kierunek Biotechnologia – Biotechnologia w utylizacji odpadów stałych od 2014
Biodegradacja odpadów tłuszczowych
Tłuszcze - pochodne wyższych kwasów tłuszczowych, najczęściej ich estry z alkoholami jedno- i wielowodorowymi. Dzielą się
na:
1
tłuszcze proste, zbudowane tylko z alkoholu i kwasów tłuszczowych:
1.1
tłuszcze właściwe – glicerydy (alkoholem jest glicerol)
1.2
woski (alkoholem jest jednowodorotlenowy alkohol wielowęglowy)
2
tłuszcze złożone, oprócz alkoholu i kwasów tłuszczowych zawierają związki dodatkowe:
2.1
fosfolipidy (zawierają związane estrowo reszty kwasu fosforowego)
2.2
glikolipidy (zawierające fragmenty cukrowe)
Wyróżnia się również lipidy izoprenoidowe, obejmujące sterydy i karotenoidy, zbudowane z jednostek izoprenowych (C5H8). Pod
względem chemicznym są to związki chemiczne odmienne od tłuszczy. Włącza się je jednak do tłuszczy ze względu na ich
rozpuszczalność w rozpuszczalnikach tłuszczowych, w związku z czym występują one wspólnie z tłuszczami w ekstraktach
tkankowych.
Tłuszcze pełnią w organizmie zwierzęcym rolę wysokoenergetycznego paliwa. Ich wartość kaloryczna jest dwukrotnie wyższe
od wartości kalorycznej węglowodanów i białek. W przeciwieństwie do białek tłuszcze mogą być magazynowane w organizmie w
dużych ilościach i stanowią jego główny materiał zapasowy. Tłuszcze są także niezbędnym składnikiem struktur komórkowych oraz
zapewniają równowagę koloidową cytoplazmy. Ułatwiają również wchłanianie witamin: A, D, E, K i cholesterolu pokarmowego.
Tłuszcze proste stanowią główny materiał zapasowy organizmu, tłuszcze złożone - przede wszystkim fosfolipidy, stanowią
zasadniczy składnik tłuszczy komórkowych. Fosfolipidy takie jak lecytyny i kefaliny znajdują się w każdej komórce zwierzęcej.
Tłuszcze należą do surowców odnawialnych, których znaczenie gospodarcze dotyczy nie tylko aspektu żywieniowego, lecz jest
przede wszystkim związane z wykorzystaniem ich jako chemicznych surowców podstawowych.
Tradycyjne chemiczne procesy hydrolizy tłuszczów prowadzone są w obecności katalizatorów nieorganicznych w temperaturze do
250 oC i ciśnieniu 80 barów. Metody te, mimo iż są efektywne, powodują powstawanie niepożądanych produktów ubocznych,
polimerów wyższych kwasów tłuszczowych, węglowodorów i innych substancji, co stwarza konieczność dalszego oczyszczania
produktów hydrolizy.
Lipazy są hydrolazami estrów glicerolu i wyższych kwasów tłuszczowych. Działają na substraty nierozpuszczalne w wodzie, co
decyduje o przebiegu reakcji na powierzchni rozdziału faz z szybkością zależną od wielkości tej powierzchni. Metody enzymatycznej
hydrolizy tłuszczów posiadają w porównaniu z ich hydrolizą chemiczną szereg zalet, takich jak:
- optymalne wykorzystanie tłuszczu
- możliwość uzyskania produktów o określonej konfiguracji
- prowadzenie procesu w warunkach energooszczędnych (temperatura hydrolizy 30-40 oC)
- ograniczenie wydatków inwestycyjnych (koszt reaktora)
- czystość ekologiczną procesu (brak produktów ubocznych)
Większość lipaz, syntezowanych przez różne szczepy drożdży, pleśni czy bakterii (Candida rugosa, Aspergillus niger, Bacillus
piocyaneum), wykazuje specyficzność w stosunku do 1,3-sn-pozycji w triacyloglicerolach. Produktami hydrolizy są więc: wolne
kwasy tłuszczowe, 1,2 (2,3)-diacyloglicerole i 2-monoacyloglicerole. Produkty te nie są stabilne ponieważ acyl z pozycji 2 migruje
tworząc 1,3-diacyloglicerole i 1(3) monoacyloglicerole, które są dalej hydrolizowane. Dlatego przedłużenie czasu hydrolizy
triacyloglicerolu w obecności lipazy o specyficzności pozycyjnej 1,3-sn powoduje całkowitą hydrolizę tłuszczu. Ostateczny skład
produktów hydrolizy tłuszczów zależy zarówno od specyficzności stosowanych enzymów, ich właściwości *inhibicja wolnymi
kwasami tłuszczowymi), parametrów prowadzenia procesu (stężenie lipazy, czas hydrolizy) jak i sposobu prowadzenia reakcji
(hydroliza, acydoliza, alkoholiza). Handlowe preparaty zawierają często kilka różniących się właściwościami lipaz, których końcowy
efekt działania jest obserwowany przez użytkowania.
Szczególnie cennymi produktami hydrolizy tłuszczów są mono- i diacyloglicerole. Substancje te należą do niejonowych
emulgatorów o wysokiej równowadze hydrofilno-lipofilnej (HLB), których udział w ogólnym rynku emulgatorów wynosi aż 73,5%.
Mono- i diacyloglicerole można otrzymać na drodze alkoholizy, t.j. hydrolizy tłuszczów w obecności nadmiaru glicerolu lub syntezy
katalizowanej przez lipazy w środowisku niewodnym. Bioemulgatory charakteryzują się wysokim stopniem czystości. W
środowisku naturalnym łatwo ulegają biodegradacji. Tłuszcze odpadowe w zależności od miejsca powstawania mogą stanowić
bądź surowiec do dalszego przerobu i wykorzystania lub uciążliwy odpad, który dopiero po hydrolizie można utylizować w
procesach oczyszczania tlenowego lub beztlenowego.
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest ocena degradacji tłuszczu odpadowego w środowisku dwufazowym pod wpływem lipazy rozpuszczalnej.
Wykonanie ćwiczenia
1.
Odczynniki używane w doświadczeniu:
1.1. bufor fosforanowy o pH 7,8
1.2. eter naftowy
1.3. 0,01 M roztwór NaOH
1.4. 0,5% fenoloftaleina
1.5. tłuszcz odpadowy (olej odpadowy, łój odpadowy)
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Kierunek Biotechnologia – Biotechnologia w utylizacji odpadów stałych od 2014
Biodegradacja odpadów tłuszczowych
1.6. lipaza rozpuszczalna (Mucor circinelloides) roztwór 20% (bufor fosforanowy)
2.
Przeprowadzenie hydrolizy tłuszczowców
2.1. Do 6 probówek wprowadzić po 1 ml buforu fosforanowego, 4 ml eteru naftowego, 0,5 cm3 oleju odpadowego (lub łoju
odpadowego) i 0,5 ml lipazy rozpuszczalnej. Wymieszać i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 0C.
3.
Oznaczenie uwolnionych kwasów tłuszczowych
3.1. Po 20 minutach od dodania enzymu zawartość dwóch probówek przenieść do kolb stożkowych (50 cm3), dodać 3-4 krople
fenoloftaleiny i miareczkować mianowanym roztworem NaOH do trwałego lekko różowego zabarwienia (barwa takiej
samej intensywności we wszystkich miareczkowanych próbach).
3.2. Analogicznie postąpić a kolejnymi dwoma próbami po 40 minutach, a następnie z ostatnimi po 60 minutach.
3.3. Aby określić kwasowość mieszaniny inkubacyjnej należy wykonać próbę „zerową” (w dwóch powtórzeniach). W tym celu
należy odmierzyć do dwóch kolb stożkowych (50 cm 3) po 1 ml buforu fosforanowego, 4 ml eteru naftowego, 0,5 cm 3 oleju
odpadowego (lub łoju odpadowego), 0,5 ml lipazy rozpuszczalnej i kilka kropel fenoloftaleniny, a następnie miareczkować
mianowanym roztworem NaOH.
4. Opracowanie wyników
4.1. Uzyskane wyniki zestawić w tabeli
Rodzaj próby
Czas hydrolizy [minuty]
kontrola
0
olej /łój odpadowy
20
40
60
Objętość NaOH [ml]
Hydroliza tłuszczów [mikromole]
4.2. Określić aktywność użytej do hydrolizy lipazy. Aktywność wyrazić w mikromolach kwasów tłuszczowych uwolnionych w
ciągu 1 minuty przez 1 mg enzymu wiedząc, że 1 ml 0,01 M NaOH zobojętnia 10 mikromoli kwasów tłuszczowych. W
obliczeniach uwzględnić stężenie użytego roztworu enzymu (10%):
JAL =
gdzie:
MLNaOH – ilość zużytego w miareczkowaniu 0,01 M NaOH
t – czas inkubacji
𝑀𝐿𝑁𝑎𝑂𝐻 ∙ 10
𝑡
4.3. Sporządzić wykres przedstawiający ilość mikromoli kwasów tłuszczowych uwalnianych w 20 minutowych przedziałach
czasu.
5. Literatura
- Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998
- Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna I i II tom; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000
- Klimiuk E., Łebkowska M., Biotechnologia w ochronie środowiska. PWN, 2008.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba