Inne enzymy wykorzystywane w klonowaniu molekularnym

INNE ENZYMY I BIAŁKA NIEENZYMATYCZNE
KLONOWANIU MOLEKULARNYM
WYKORZYSTYWANE
W
Wiele różnych enzymów, nie tylko restryktazy, jest wykorzystywanych rutynowo w klonowaniu
molekularnym:
DNA POLIMERAZY (DNA- i RNA-ZALEŻNE)
Wiele etapów klonowania molekularnego wymaga syntezy DNA in vitro – reakcje te katalizują
polimerazy DNA. Są to enzymy, które wymagają matrycy (w większości) i syntetyzują produkt,
którego sekwencja nukleotydów jest komplementarna do matrycy. Większość polimeraz preferuje
matryce DNA, ale mogą również kopiować RNA (odwrotna transkryptaza).
RNA POLIMERAZY (DNA-ZALEŻNE)
Enzymy, które katalizują syntezę RNA na matrycy dsDNA. Polimerazy pochodzenia fagowego są
wykorzystywane in vitro do generowania dużych ilości RNA komplementarnego do jednej z nici
obcego DNA sklonowanego za fagowym promotorem w wektorze plazmidowym.
LIGAZY
Enzymy wykorzystywane do łączenia dwóch różnych cząsteczek DNA to ligazy DNA. Najczęściej
wykorzystywaną jest ligaza kodowana w genomie faga T4. RNA ligaza to enzym zdolny do
kowalencyjnego łączenia cząsteczek jednoniciowego RNA posiadających grupy 5’-fosforanową i
3’-hydroksylową.
KINAZY
Enzymy te wykorzystywane są do fosforylowania końców cząsteczek DNA pozbawionych reszt
fosforanowych, np.: kinaza polinukleotydowa faga T4.
FOSFATAZY
Odwrotnie niż kinazy enzymy te wykorzystujemy do defosforylacji, czyli usuwania grup
fosforanowych z 5’-końców łańcuchów polinukleotydowych, np.: fosfataza alkaliczna E. coli.
NUKLEAZY
Enzymy, które katalizują hydrolizę wiązania fosfodiestrowego. Egzonukleazy usuwają
mononukleotydy z końców liniowego DNA. Endonukleazy atakują wiązania fosfodiestrowe
wewnątrz cząsteczek dwu- lub jednoniciowych; np.: Dezoksyrybonukleaza I – endonkleaza, która
hydrolizuje ds lub ssDNA preferencyjnie w miejscach przylegających do nukleotydów
pirymidynowych; produkty takiej reakcji trawienia to złożona mieszanina 5’-fosfo mono- i
oligonukleotydów; w obecności jonów Mg2+ każda nić jest atakowana niezależnie, a miejsca
trawienia na obu niciach rozmieszczone w sposób przypadkowy; Rybonukleaza A –
endorybonukleaza, przecinająca wiązanie 3’-fosfodiestrowe przy pirymidynach, niewykazująca
żadnej aktywności w stosunku do DNA, stosowana do usuwania RNA z preparatów DNA
BIAŁKA NIEENZYMATYCZNE
W inżynierii genetycznej wykorzystywane są również nieenzymatyczne białka wiążące DNA, np.:
białko SSB (ang. single-stranded DNA-binding protein), wiążące się w sposób kooperatywny z
ssDNA (ich użyteczność wynika z faktu, że mogą destabilizować struktury drugorzędowe powstałe
w obrębie jednej nici i zwiększać tym samym procesywność enzymów, usuwając „bariery” na ich
drodze).