Analityczne aspekty spektrofluorymetrii.” – opis ćwiczenia

ćwiczenie 7
” Analityczne aspekty spektrofluorymetrii.” – opis ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest wyznaczenie iloczynu rozpuszczalności wodorofosforanu (V) wapnia na
podstawie oznaczeń jonów metodą fluorymetryczną. Podczas ćwiczenia studenci są zobowiązani do
wykonania serii roztworów kalibracyjnych służących do wykreślenia krzywych kalibracyjnych oraz
oznaczenia zawartości anionów fosforanowych oraz kationów wapniowych w nasyconym wodnym
roztworze wodorofosforanu wapnia. Pomiar stężenia wapnia będzie odbywał się na podstawie
pomiarów fluorescencji zasadowego roztworu kalceiny w obecności jonów wapnia, natomiast stężenie
jonów fosforanowych(V) będzie określane na podstawie efektu wygaszania fluorescencji roztworu
rodaminy B w obecności heptamolibdenianu amonu.
Uwaga podczas wykonywania ćwiczenia konieczne jest zachowanie szczególnej czystości
używanego szkła laboratoryjnego i umiejętność sprawnego i poprawnego wykonywania roztworów
kalibracyjnych ze stężonych roztworów wzorcowych.
Na początku zajęć, przed napisaniem „wejściówki”, studenci są zobowiązani do dokładnego umycia
szkła laboratoryjnego przeznaczonego do wykonania ćwiczenia i umieszczeniu go w suszarce.
Oznaczanie zawartości anionów fosforanowych (V) :
1) Mając do dyspozycji roztwór diwodorofosforanu potasu o stężeniu 1mmol/L, proszę wykonać
serię wzorców o stężeniu jonów fosforanowych(V) zmieniających się w zakresie
0-5 µmol/L (co 1) w następujący sposób: w pierwszej kolejności należy w zlewce o pojemności
>25mL rozcieńczyć 200 krotnie roztwór o stężeniu 1mmol/L otrzymując w ten sposób roztwór
o stężeniu jonów fosforanowych 5µmol/L. Następnie do pięciu kolejnych zlewek odpipetować
odpowiednie objętości powstałego roztworu i wody uzyskując serię wzorców o zadanych wyżej
stężeniach.
Do wykonania ćwiczenia potrzebne jest minimum 5ml każdego roztworu wzorcowego!
2) Uruchomić komputer oraz spektrofluorymetr zgodnie z informacjami zamieszczonymi na
obudowie urządzenia. Po uruchomieniu systemu komputerowego, proszę uruchomić z
poziomu pulpitu program o nazwie WaveScan.
3) W głównym oknie programu proszę kliknąć w przycisk „NEW” i podać lokalizację zapisu
nowego pliku w folderze: Pulpit\Analiza Instrumentalna\”utworzyć folder z numerem
grupy”\rodamina-fosforany kliknąć „SAVE”. Pojawi się okno operatora, proszę kliknąć „OK”
4) Ustawienie parametrów pracy spektrofluorymteru, w zakładce „GENERAL” klikamy na ikonę
folderu i z lokalizacji C:\FluoroMasterPlus\Method wybrać metodę o nazwie „Rodamina”
5) Przygotowujemy w dużej zlewce (50mL) roztwór odczynnika służącego do oznaczania
zawartości fosforanów (V) w próbce. Mieszamy w stosunku V:V 1:1 roztwór rodaminy B o
C=20mg/L oraz roztwór heptamolibdenianu amonu o stężeniu C=10mM.
6) Kuwetki fluorymetrycze napełniamy 1mL r-r odczynnika fluorofora oraz 1 mL próbki/wzorca.
Rejestrujemy również widmo ślepej próby. Ważne jest zachowanie stałości czasu
upływającego od momentu zmieszania roztworu odczynnika i próbki. Widma rejestrujemy po
minimum 1 minucie od chwili dodania roztworów do kuwetki.
7) Po zarejestrowaniu widm dla ślepej próby oraz roztworów kalibracyjnych rejestrujemy widmo
dla próbki = roztworu nasyconego wodorofosforanu (V) wapnia rozcieńczonego 500x
8) Gdy zakończymy rejestracje widm, przystępujemy do podpisania pików i odczytania
intensywności promieniowania. Pogram automatycznie znajdzie analityczną długość fali emisji
i odczyta intensywność promieniowania po wybraniu kafelka „PEAK FIND” i określeniu zakresu
widma dla którego ma znaleźć maksima i minima. Tablicowa długość fali emisji rodaminy B
wynosi 575 nm.
9) Na koniec należy zapisać wyniki we wcześniej przygotowanym folderze grupy wybierając
polecenie File  Save as „numer grupy_fosforany”. Wyniki można również wyeksportować w
postaci arkusza kalkulacyjnego MS poleceniem File Export Chart.
Oznaczanie zawartości kationów wapnia :
1) Mając do dyspozycji roztwór chlorku wapnia o stężeniu 2mmol/dm3, proszę wykonać serię
wzorców o stężeniu jonów wapnia zmieniających się w zakresie 400-2000 µmol/L
(co 200 µmol/L) w następujący sposób do pięciu kolejnych zlewek odpipetować odpowiednie
objętości roztworu wzorca i wody uzyskując serię wzorców o zadanych wyżej stężeniach.
Do wykonania ćwiczenia potrzebne jest minimum 5ml każdego roztworu wzorcowego!
2) Uruchomić komputer oraz spektrofluorymetr zgodnie z informacjami zamieszczonymi na
obudowie urządzenia. Po uruchomieniu systemu komputerowego, proszę uruchomić z
poziomu pulpitu program WaveScan.
3) W głównym oknie programu proszę kliknąć w przycisk „NEW” i podać lokalizację zapisu
nowego pliku w folderze: Pulpit\Analiza Instrumentalna\”utworzyć folder z numerem
grupy”\kalceina-wapń kliknąć „SAVE”. Pojawi się okno operatora, proszę kliknąć „OK”
4) Ustawienie parametrów pracy spektrofluorymteru, w zakładce „GENERAL” klikamy na ikonę
folderu i z lokalizacji C:\FluoroMasterPlus\Method wybrać metodę o nazwie „Kalceina”
5) Kuwetki fluorymetrycze napełniamy 1mL r-r odczynnika fluorofora oraz 1 mL próbki/wzorca.
Rejestrujemy również widmo ślepej próby .
6) Po zarejestrowaniu widm dla ślepej próby oraz roztworów kalibracyjnych rejestrujemy widmo
dla próbki = roztworu nasyconego wodorofosforanu (V) wapnia. W przypadku gdy roztwór
próbki byłby mętny należy ją wcześniej przefiltrować przez saczek z bibuły.
7) Gdy zakończymy rejestracje widm, przystępujemy do podpisania pików i odczytania
intensywności promieniowania. Pogram automatycznie znajdzie analityczną długość fali emisji
i odczyta intensywność promieniowania po wybraniu kafelka „PEAK FIND” i określeniu zakresu
widma dla którego ma znaleźć maksima i minima. Tablicowa długość fali emisji kompleksu
wapń-kalceina wynosi 550 nm.
8) Na koniec należy zapisać wyniki we wcześniej przygotowanym folderze grupy wybierając
polecenie File  Save as „numer grupy_fosforany”. Wyniki można również wyeksportować w
postaci arkusza kalkulacyjnego poleceniem File Export Chart.