Polimorfizm transpozonów z rodziny Tc1

Instytut Oceanologii Polskiej Akademii Nauk
Sopot
Polimorfizm transpozonów z rodziny
Tc1-podobnych w genomach ryb
Rozprawa doktorska
Anita Poćwierz-Kotus
Promotor:
prof. dr hab. Roman Wenne
Recenzenci:
prof. dr hab. Grzegorz Węgrzyn
dr hab. Dariusz Grzebelus
Wprowadzenie
Elementy transpozonowe

Transpozony są odcinkami DNA zdolnymi do zmiany
miejsca położenia w genomie.

Transpozony mają znaczący udział w składzie
prokariotycznych i eukariotycznych genomów, a zakres
ich występowania obejmuje prawie wszystkie zbadane
organizmy.

Dzięki zdolności do transpozycji elementy te mogą
rozprzestrzeniać się zarówno w obrębie pojedynczej
komórki poprzez kopiowanie się w nowych miejscach
genomu, jak i między osobnikami wewnątrz populacji, a
także pomiędzy gatunkami w procesie horyzontalnego
transferu (HT).
Wprowadzenie
Elementy transpozonowe
Eukariotyczne elementy transpozonowe
I klasa:
retrotranspozony



II klasa:
transpozony DNA
mechanizm transpozycji „copyand-paste”
w transpozycji uczestniczy
RNA
gen kodujący odwrotną
transkryptazę
LTR
LTR
gag
RT
RH
IN



mechanizm transpozycji „cutand-paste”
gen kodujący transpozazę
odwrócone terminalne
powtórzenia - ITR (ang.
inverted terminal repeat)
ITR
ITR
gen transpozazy
Wprowadzenie
Transpozony Tc1

Jedną z rodzin TE klasy II jest rodzina transpozonów
Tc1-podobnych, homologiczna do sekwencji Tc1
u nicienia Caenorhabditis elegans. Występuje ona
w genomach wielu gatunków zwierząt, szczególnie
zaś rozpowszechniona jest w genomach ryb i płazów.

Większość kopii transpozonów Tc1 z powodu
wielokrotnych mutacji jest nieaktywna i występuje
w postaci stałych składników genomu (tzw.
genetyczna skamieniałość).
RT
Wprowadzenie
Horyzontalny transfer

HT - zjawisko umożliwiające transmisję TE od jednego gatunku
gospodarza do innego, za pośrednictwem wektora.
HT aktywnego transpozonu
Wzrost liczby kopii
Kolonizacja
genomowego
DNA
Rozprzestrzenienie w populacji
Gatunek A
Stochastyczna utrata
Kolejny HT
Wertykalna inaktywacja
Kolejny HT
Mutacje punktowe
Gatunek C
Gatunek B
Wprowadzenie
Horyzontalny transfer

Doniesienia w pracy Leavera (2001) o HT u ryb
i płazów:
RT

Kompletna kopia transpozonu Tc1-podobnego zidentyfikowana
w genomie Pleuronectes platessa może świadczyć o
zachowaniu zdolności do transpozycji tego transpozonu.

Obecność spokrewnionych transpozonów z rodziny Tc1podobnych w genomach Pleuronectes platessa, Salmo salar,
Rana temporaria, czyli gatunków, których dywergencja
nastąpiła ponad 400 mln lat temu może świadczyć o
horyzontalnej transmisji tego transpozonu.
Cele pracy

Zbadanie zakresu występowania transpozonów z rodziny
Tc1-podobnych w genomach różnych gatunków ryb.

Określenie polimorfizmu i uzyskanie charakterystyki sekwencji
transpozonów Tc1-podobnych w badanych gatunkach ryb.

Przeprowadzenie analizy filogenetycznej transpozonów
Tc1-podobnych zidentyfikowanych w genomach ryb.

Wykazanie możliwości zajścia horyzontalnego transferu u
wybranych gatunków ryb.

Opracowanie metodyki określania miejsc integracji
transpozonów Tc1-podobnych w genomach ryb.
Metody
Pobór prób

Badaniami objętych było 495 osobników należących do 36
gatunków ryb zasiedlających wody słone i słodkie.

Najliczniejszą grupę stanowili przedstawiciele rodzin:

Pleuronectidae – 179 osobników:



Scophthalmidae – 82 osobniki:


Scophthalmus maximus
Percidae – 54 osobniki:


Platichthys flesus
Pleuronectes platessa
Perca fluviatilis
Liczebnościowo mniejsze grupy stanowili przedstawiciele rodzin:
Esocidae,
Cyprinidae,
Poeciliidae,
Anguillidae,
Scorpaenidae.
Salmonidae,
Clupeidae,
Dasyatidae,
Scombridae,
Gobidae,
Belonidae,
Ophidiidae,
Gempylidae,
Merlucciidae,
Gadidae,
Channichthyidae,
Carangidae,
Metody
Polimorfizm transpozonów Tc1-podobnych
Izolacja DNA
Trawienie enzymami
restrykcyjnymi
Amplifikacja PCR
Startery komplementarne
do genu transpozazy
RFLP
Pojedynczy starter
komplementarny do ITR
Klonowanie do wektora
pGEM3Zf(+)
Sekwencjonowanie
Analiza bioinformatyczna
sekwencji
Transfer DNA na
membranę nylonową
Hybrydyzacja
z sondą specyficzną
do fragmentu genu
transpozazy
Metody
Identyfikacja miejsc insercji transpozonów Tc1-podobnych
Izolacja DNA
Trawienie enzymami restrykcyjnymi
Ligacja fragmentów restrykcyjnych
Odwrotna reakcja PCR (ang. inverse PCR)
Ponowna reakcja PCR (rePCR)
Sekwencjonowanie
Obróbka bioinformatyczna sekwencji
Wyniki
Zakres występowania transpozonów Tc1-podobnych w genomach
różnych gatunków ryb



Analiza przesiewowa przy pomocy techniki PCR
Liczba przebadanych gatunków – 36
Liczba przebadanych osobników – 495
starter I (1)
starter I (1630)
produkt
produktPCR
PCR(1630
(1630pz)
pz)
starter APK1 (407)
starter APK2 (1220)
produkt PCR (814 pz)
ITR
gen transpozazy
ITR
Wyniki
Zakres występowania transpozonów Tc1-podobnych w genomach
różnych gatunków ryb

Dystrybucja transpozonów Tc1-podobnych w genomach
wybranych gatunków ryb oszacowana dzięki amplifikacji PCR z
pojedynczym starterem I.
A
1
B
2
C
3
4
5
D
6
7
8
E F B G F E
F
H
F H
I
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
3530
1904
1584
1375
947
564
A - P. platessa
B - P. flesus
C - S. salar
D - H. platessoides
E - R. hippoglossoides
F - E. lucius
G - S. maximus
H - S. lucioperca
I - C. harrengus (I)
Wyniki
Zakres występowania transpozonów Tc1-podobnych w genomach
różnych gatunków ryb

Dystrybucja transpozonów Tc1-podobnych w genomach
różnych gatunków ryb oszacowana z zastosowaniem
amplifikacji PCR z parą starterów komplementarnych do
genu Tnp.
M
P. platessa
P. flesus
S. trutta fario
M
947
564
90
Platichthys flesus
Pleuronectes platessa
Salmo trutta fario
Salmo trutta trutta
Anguilla anguilla
Salmo salar
Esox lucius
Scophthalmus maximus
Stizostedion lucioperca
Limanda aspera
Neogobius melanostomus
Blicca bjoerkna
Danio rerio
Clupea harengus
Sprattus sprattus
Belone belone
Theragra chalcogramma
Poecilia sphenops
Thunnus albacares
Megalaspis cordyla
Perca fluviatilis
Abramis brama
Urogymnus asperrimus
Hippoglossoides platessoides
Merluccius merluccius
Oncorhynchus nerka
Rutilus rutilus
Gadus morhua
Reinhardtius hippoglossoides
Cyprinus carpio
Tinca tinca
Genypterus capensis
Champsocephalus gunnari
Scomber scombrus
Ruvettus pretiosus
Sebastes marinus
%
142
25
19
1
3
7
16
82
21
4
5
1
2
10
10
8
3
2
4
4
33
13
3
3
2
6
5
21
5
2
3
8
14
3
2
3
Zakres występowania transpozonów Tc1-podobnych w genomach
różnych gatunków ryb
Wyniki
Liczebność
100
150
PCR 1
PCR 2
135
80
120
70
105
60
90
50
75
40
60
30
45
20
30
10
15
0
0
Wyniki
Potwierdzenie specyficzności wykrytych transpozonów Tc1-podobnych
Liczba
osobników
Gatunek
Miejsce pochodzenia
Platichthys flesus
15
Morze Bałtyckie
Pleuronectes platessa
10
Morze Bałtyckie
Scophthalmus maximus
5
Morze Bałtyckie
Salmo trutta fario
2
hodowla rybna, Gościcino
Salmo salar
2
Morze Norweskie
Esox lucius
13
Jezioro Żarnowieckie
fragment restrykcyjny 711 pz
PvuII (663)
BamHI (763)
gen transpozazy
PvuII(1374)
Wyniki
Potwierdzenie specyficzności wykrytych transpozonów Tc1-podobnych
Użyto
enzymów restrykcyjnych: PvuII, BamHI, HindIII.
Enzym restrykcyjny PvuII
Platichthys flesus Pleuronectes platessa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
ok. 710 pz
Wyniki
Polimorfizm sekwencji transpozonów Tc1-podobnych
określony przy użyciu RFLP

Użyto enzymów restrykcyjnych: AluI, MboI,
DdeI, HinfI.
Gatunek
Liczba
osobników
Miejsce pochodzenia
Platichthys flesus
44
Morze Bałtyckie
Morze Północne
Pleuronectes platessa
20
Morze Bałtyckie
Scophthalmus maximus
5
Morze Bałtyckie
Salmo trutta fario
5
hodowla rybna, Gościcino
Salmo salar
10
Morze Norweskie
A - Platichthys flesus
B - Pleuronectes platessa
A
B
A
B
A B
417
311
249
200
140
Wyniki
Polimorfizm sekwencji transpozonów Tc1-podobnych na podstawie
analizy sekwencji nukleotydowych
Klonowanie sekwencji transpozonów Tc1-podobnych z 10 osobników ryb
reprezentujących 8 gatunków:
Lp.
Gatunek
Symbol
osobnika
Pochodzenie
Liczba
uzyskanych
klonów
1
Platichthys flesus
31S
200S
8ST
Morze Bałtyckie
Morze Bałtyckie
Morze Północne
94
20
20
2
Pleuronectes platessa
50G
Morze Bałtyckie
20
3
Scophthalmus maximus
11SKB
Morze Bałtyckie
20
4
Esox lucius
10E
Jezioro Żarnowieckie
30
5
Belone belone
BB5
Morze Bałtyckie
16
6
Neogobius melanostomus
4B
Morze Bałtyckie
19
7
Perca fluviatilis
O35
Morze Bałtyckie
16
8
Oncorhynchus nerka
ON6
Ocean Spokojny
20
Ogółem 275 klonów
Wyniki
Polimorfizm sekwencji transpozonów Tc1-podobnych na podstawie
analizy sekwencji nukleotydowych


Przeprowadzono zestawienie 275 sekwencji, na bazie którego skonstruowano
globalne drzewo filogenetyczne.
Na podstawie jego topologii wydzielono 7 kladów: A, B, C, D, E, F, G,
których odrębność potwierdzono za pomocą obliczeń średniego zróżnicowania
genetycznego.
KLAD
GATUNKI
Śr. zróżnicowanie
genetyczne
A
P. flesus (131), P. platessa (20),
S. maximus (18), O. nerka (1)
0,043
B
N. melanostomus (19), P. fluviatilis (13)
0,01
C
B. belone (10)
0,06
D
O. nerka (19)
0,19
E
E. lucius (11), B. belone (6), P. fluviatilis (3)
0,1
F
P. flesus (3), S. maximus (2)
0,04
G
E. lucius (19)
0,0005
Wyniki
Analiza filogenetyczna transpozonów Tc1-podobnych z uwzględnieniem
sekwencji uzyskanych z baz danych
A
P. flesus, P. platessa
S. maximus , O. nerka
B
N. melanostomus , P. fluviatilis
C
B. belone
D
O. nerka
E
E. lucius , B. belone P. fluviatilis
F
P. flesus , S. maximus
G
E. lucius
a - (Leaver, 2001)
b - (Ivics i in., 1996)
c - (Sinzelle i in., 2005)
d – transozaza BX294110 of Danio rerio,
e – transpozaza CR931802 of Danio rerio,
f - (Jaillon i in., 2004)
Wyniki
Analiza filogenetyczna transpozonów Tc1-podobnych oparta na
sekwencjach aminokwasowych

W obrębie zidentyfikowanych 7 kladów wydzielono
13 sekwencji konsensusowych dla każdego gatunku:
Tc1-1Pla, Platichthys flesus
Tc1-1Ple, Pleuronectes platessa
Tc1-1Sco, Scophthalmus maximus
Tc1-1Onc, Oncorhynchus nerka
Tc1-2Onc, Oncorhynchus nerka
Tc1-1Bel, Belone belone
Tc1-1Neo, Neogobius melanostomus
Tc1-2Per, Perca fluviatilis
Tc1-1Eso, Esox lucius
Tc1-1Per, Perca fluviatilis
Tc1-2Pla, Platichthys flesus
Tc1-2Sco, Scophthalmus maximus
Tc1-2Eso, Esox lucius
Wyniki
Analiza filogenetyczna transpozonów Tc1-podobnych oparta na
sekwencjach aminokwasowych
PPTN, Ple uron ectes pla tessa
Tc1-1P le, Pleuronectes platessa
Tc1-1S co , S co phthalmus maximus
98
Tc1-1Pla, Platichthys flesus
100
Tc1-1Onc , Oncorhynchus nerka
Tc1-2P la, Platichthys flesus
100
Tc1-2Sco , S co phthalmus maximus
63
98
1
Tc1-10Xt (Eagle), Xenopus trop icalis
Tc1-2Ory, Oryzias la tipes
Glan, On corhyn chus mykiss
1 00
Tc1-1Ory, Oryz ias la tip es
97
92
89
Tc1-2Onc, Oncorhynchus nerka
61
Barb, Onc orhynchus m ykiss
SSTN, Salmo s alar
Tc1-12Xt, Xenopus tropicalis
1 00
99
Tc1-1Bel, Belone belone
Tc1-1Eso, E so x lucius
89
98
2
3
RTTN , Rana temporaria
Tc1-1Per, Perca fluviatilis
89
Tzf, Danio rerio
Tc1-3Ory, O ryzias latipes
74
100
1 00
100
100
68
100
85
99
77
Tc1-1Neo, Neogobius melanostomus
Tc1-2Per, Perca flu viatilis
Niezidentyfikowa ny Tc1 , Danio re rio
Tc1-11Xt (Fro ggy), Xen opu s tropicalis
Tc1-1D r, Dan io rerio
Tc1-1Xt (XtT Xr), Xen opu s tropicalis
Tc1-FR4, F ugu rubripes
Tc1-8Xt, Xe nop us tropic alis
Tc1-4Xt, Xeno pus tro pic alis
Tc1-1Tet, Tetrao don n igrovirid is
100
Tc 1-FR6, Fugu rub ripe s
Tss, Sa lmo salar
Tdr1, Danio rerio
Tc1-2Xt (M ay a), Xenopus trop icalis
89
Tc1-2E so, Eso x lucius
1 00
1 00
59
63
TC 1
0.1
Tc1 -FR1, F ugu rubripes
Titof2, Tetraodon n igro viridis
Tc1 DR3 , Danio re rio
Tc1-4Ory, Oryzias la tipes
4
5
Wyniki
Szacowanie prawdopodobieństwa zajścia HT na podstawie dystrybucji
zidentyfikowanych transpozonów Tc1-podobnych w genomach ryb
Xenopus tropicalis
Rana temporaria
Danio rerio
485MYA
Oncorhynchus mykiss
75MYA
400MYA
Oncorhynchus nerka
Salmo salar
261 MYA
Esox lucius
Porównanie struktury transpozonów
Tetraodon nigroviridis
84MYA
Takifugu rubripes
288MYA
Neogobius melanostomus
190MYA
Belone belone
99%
Oryzias latipes
180MYA
Perca fluviatilis
Pleuronectes platessa
1.6MYA
5MYA
Platichthys flesus
Scophthalmus maximus
98%
Wyniki
Opracowanie metodyki umożliwiającej identyfikację miejsca integracji
transpozonów Tc1-podobnych w genomie storni P. flesus
genomowy DNA
Tc1
Tc1
Tc1
trawienie HindIII
Tc1
Tc1
odwrotna reakcja PCR
APK1 (1)
Tc1
inv3 (124)
starter I (1381)
ligacja
Tc1
inv1 (1614)
inv4 (1493)
Tc1
Tc1
inv6 (1251)
1630 pz
Tc1
Tc1
Tc1
SFT
inv5 (989)
HindIII (748)
Wyniki
Identyfikacja i analiza sekwencji miejsca integracji kopii transpozonu
Tc1-podobnego w genomie storni P. flesus
Wykres zależności filogenetycznych:
 sekwencje aa
 156 sekwencji RVT z bazy Pfam
(tzw. SEED)
 10 reprezentantów ze 100 sekwencji
z bazy est (GenBank)
SFT
LINE:
ryby, owady
niescharakt.
RVT
retrowirusy
retroelementy:
owady, rosliny
0.1
Wnioski

Transpozony z rodziny Tc1-podobnych są szeroko rozpowszechnione
w genomach ryb.

Lokalizacja sekwencji transpozonowych w obrębie gatunku jest
konserwatywna, natomiast zaobserwowano polimorfizm na poziomie
międzygatunkowym.

Identyczność transpozonów zidentyfikowanych u okonia i babki może
wskazywać na horyzontalny transfer.
Wnioski

Zademonstrowano integrację transpozonu Tc1 do zdegenerowanego
retrotranspozonu LINE.

Zależności filogenetyczne między analizowanymi transpozonami
nie potwierdzają hipotezy Leavera.
. uwagę
Dziękuję za
Poćwierz-Kotus A, Wenne R. Properties of mobile elements of genomes
and their application in biotechnology. Environmental Biotechnology, in
press.
Wenne R, Handschuh L, Poćwierz-Kotus A, Urbaniak R, Formanowicz P,
Całkiewicz J, Brzozowska K, Figlerowicz M, Węgrzyn G, Wróbel B.
The application of microarray technology to the identification of Tc1-like
element sequences in fish genomes. Marine Biology Research, in press
Poćwierz-Kotus A, Burzyński A, Wenne R. 2010. Identification of a Tc1like transposon integration site in the genome of the flounder (Platichthys
flesus): a novel use of an inverse PCR method. Marine Genomics, 3: 45-50
Poćwierz-Kotus A, Burzyński A, Wenne R. 2007. Family of Tc1-like
elements from fish genomes and horizontal transfer. Gene, 390: 243-251
. uwagę
Dziękuję za