Ćwiczenie 10

Ćwiczenie nr 10
Wysokosprawna chromatografia cieczowa- HPLC
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z podstawami teoretycznymi oraz wykorzystaniem HPLC w
analizie jakościowej i ilościowej oraz oznaczanie hydrokortyzonu w tabletkach Hydrocortisonum
20 mg i ocena jakości uzyskanych wyników.
I. Aparatura i sprzęt
Chromatograf cieczowy -shimadzu LC-10AS z detektorem diodowym UV-VIS
Kolumna chromatograficzna: Hypersil BDS- C18, 4,6 x 150 mm, 5 µm
Detektor UV- VIS pomiar przy długości fali 254 nm
Przepływ fazy ruchomej: l ml/ min
Kolby miarowe o poj.10 ml - 5 szt.
Kolba miarowa o poj. 100ml
Kolba miarowa o poj. 50 ml
Kolba miarowa o poj. 25 ml
Pipeta o poj. 5 ml do roztworu roboczego
Pipeta o poj. 5 ml
Pipeta o poj. l ml
II.Odczynniki
Roztwór wzorcowy hydrokortyzonu o stężeniu 2 mg/ml
Roztwór hydrokortyzonu z tabletki Hydrocortisonum 20 mg
Faza ruchoma: woda / acetonitryl 60:40 (v/v)
III.Wykonanie ćwiczenia
1.Przygotować roztwór roboczy hydrokortyzonu o stężeniu 200 µg/ml.
W tym celu pobrać do kolby miarowej o poj. 25 ml ...X.... ml roztworu wzorcowego o stężeniu
2 mg/ml i uzupełnić metanolem do współmierności.
2.Przygotować roztwory wzorcowe hydrokortyzonu do krzywej kalibracyjnej.
W tym celu pobrać do 4 kolbek miarowych na 10 ml odpowiednią objętość roztworu roboczego
w celu otrzymania roztworów o stężeniach: A = 10, B = 20, C = 30, D = 40 µg/ml uzupełnić
metanolem do współmierności.
3.Przygotować roztwór z tabletki do nastrzyku .
W tym celu należy pobrać do kolby miarowej na 10 ml l ml roztworu hydrokortyzonu z tabletki
Hydrocortisonum 20 mg i uzupełnić metanolem do współmierności.
4.Każdy z roztworów wzorcowych hydrokortyzonu do krzywej kalibracyjnej nastrzyknąć
dwukrotnie na kolumnę, następnie roztwór z tabletki nastrzyknąć trzykrotnie.
5.Wykreślić krzywą kalibracyjną zależności powierzchni piku S od stężenia c hydrokortyzonu
S = f(c).
1
6.Metodą najmniejszych kwadratów wyznaczyć parametry a i b równania krzywej kalibracyjnej
oraz współczynnik korelacji r
S=ac+b
S - powierzchnia piku
c - stężenie hydrokortyzonu [µg/ml]
7.Z równania krzywej kalibracyjnej obliczyć stężenie c hydrokortyzonu w badanym roztworze.
8.Obliczyć zawartość hydrokortyzonu w tabletce c tab. [mg] wg wzoru:
ctab = c · 1000 [mg]
9.Przeprowadzić ocenę statystyczną uzyskanych wyników. W tym celu:
a) Oblicz średnią zawartość hydrokortyzonu w tabletce ( c tab = x)
b) Obliczyć błąd (odchylenie standardowe) dla wyniku x wg wzoru:

s=
 ( x  x)
n  1)
s- odchylenie standardowe pojedynczego wyniku
n- liczba pomiarów
c) Obliczyć współczynnik zmienności pojedynczego wyniku (Wz):
s
Wz. =  100%
x
d) Obliczyć odzysk hydrokortyzonu (H) z tabletki:
odzysk(%} =
cHwtabletcedlapoj. próby(mg )
100%
cHwtabletcewg. producenta(mg )
e) Obliczyć średni odzysk hydrokortyzonu z tabletki
2