Przydatność metody enzymatycznej do

Transkrypt

INSTYTUT BIOTECHNOLOGII PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO
Zakład Technologii Przetworów Owocowych i Warzywnych
Joanna Danielczuk, Wojciech Zieliński *
PRZYDATNOŚĆ METODY ENZYMATYCZNEJ DO
OZNACZANIA ZAWARTOŚCI WITAMINY C
W WYBRANYCH SOKACH OWOCOWYCH
I WARZYWNYCH
Streszczenie
Statystyczne opracowanie wyników badań oznaczania kwasu L-askorbinowego
i witaminy C metodami wg PN (miareczkową i spektrofotometryczną) oraz
metodą enzymatyczną w trzech rodzajach soków owocowych i warzywnych
przedstawiono w poprzedniej części pracy opublikowanej w 2000 r [1].
W niniejszym artykule uzyskane wyniki oznaczeń poddano analizie
statystycznej metodami regresji liniowej w celu stwierdzenia:
• zgodności lub niezgodności wyników metod wg PN z wynikami metody
enzymatycznej
poprzez
przyjmowanie
lub
odrzucanie
hipotez
statystycznych,
• możliwości zastępowania metod wg PN metodą enzymatyczną i przeliczaniu
wyników na obowiązujące obecnie wyniki wg PN, poprzez wykorzystanie
odpowiednich równań regresji,
• możliwości wykorzystania równań regresji do obliczania orientacyjnych
poprawek na zawartość reduktonów w próbkach soków , bez wykonywania
analiz chemicznych.
Podano również praktyczne zastosowania uzyskanych równań regresji liniowej
wzajemnej zależności wyników.
______________________________________________
*SGGW, Katedra Statystyki Matematycznej i Doświadczalnictwa
Przydatność metody enzymatycznej do oznaczania zawartości witaminy C...
I.
WSTĘP
Jedynym związkiem o działaniu antyoksydacyjnym oznaczanym
rutynowo w laboratoriach przemysłu owocowo-warzywnego jest kwas
L-askorbinowy (KA). Dzieje się tak ze względu na jego rolę
w organizmie człowieka, jak również wynika z łatwości do
przechodzenia w formę utlenioną (KDA), co oznacza że KA może być
dobrym wskaźnikiem prawidłowości procesu technologicznego.
Utlenianie KA mogą katalizować takie czynniki jak: obecność tlenu,
wysoka temperatura, środowisko obojętne, enzymy oksydacyjne,
metale ciężkie, promienie ultrafioletowe lub np. benzoesanu sodu
[15]. Ze względu na odwracalność procesu utleniania, rolę witaminy
C w organizmie pełnią KA i KDA (wit. C = KA + KDA).
1. Metody analityczne
Zgodnie z rozporządzeniem Ministra ds. Rolnictwa i Gospodarki
Żywnościowej, w sprawie obligatoryjności norm [4], są obecnie
stosowane dwie rutynowe metody zawarte w Polskiej Normie [13]:
metoda miareczkowa i spektrofotometryczna:
Zasada metody miareczkowej polega na utlenieniu w środowisku
kwaśnym kwasu L-askorbinowego (KA) do dehydroaskorbinowego
(KDA) za pomocą niebieskiego barwnika
2,6-dichlorofenoloindofenolu. Barwnik redukuje się do formy
bezbarwnej (leuko) i przy pH 4,2 barwi się na czerwono; reakcja
przebiega ilościowo. Metodę stosuje się do produktów bezbarwnych i
słabo zabarwionych.
Zasada metody spektrofotometrycznej polega na utlenieniu
w środowisku kwaśnym kwasu L-askorbinowego (KA) do kwasu
dehydro-L-askorbinowego (DHA) za pomocą nadmiaru
2,6-dichlorofenoloindofenolu, który ekstrahuje się za pomocą ksylenu.
Nadmiar barwnika wyekstrahowanego ksylenem oznacza się
spektrofotometrycznie przy długości fali λ = 500 nm. Metoda
stosowana jest do produktów o silnym zabarwieniu.
W krajach Unii Europejskiej jako metody rutynowe można stosować
podane. metody: miareczkową i spektrofotometryczną proponowane
przez AOAC 1), ISO 2) i IFU 3).
Jako metody odwoławcze (referencyjne) mogą być stosowane: metoda
Wysokosprawnej Chromatografii Cieczowej (HPLC) zamieszczona
w„Code of Practice” 4), proponowana przez AIJN 5) i IFU albo metoda
fluoroscencyjno- spektrofotometryczna wykorzystująca reakcję kwasu
dehydro-L-askorbinowego z o-fenylodiaminą proponowana przez
AOAC i ISO .
Inne stosowane metody to np. metoda elektroforezy kapilarnej [10]
i metody polarograficzne [8].
Metody stosowane rutynowo w laboratoriach przemysłu owocowowarzywnego powinno cechować:
• proste i krótkotrwałe przygotowanie próbki
• mało skomplikowane oprzyrządowanie
• stosowanie bezpiecznych ekologicznie odczynników
• krótki czas oznaczania
• ekonomicznie uzasadniony koszt
oraz
• odpowiednie wartości wymaganych wskaźników walidacji metody.
Praktyka analityczna w laboratoriach przemysłu owocowowarzywnego wykazała, że opisane metody obowiązujące w polskich
laboratoriach mają wiele niedoskonałości.
Do krajowej praktyki analitycznej coraz częściej wprowadzane są
metody enzymatyczne, stosowane w UE do oznaczania wielu
składników odżywczych [6, 7, 9, 11, 12]. Wiele metod
enzymatycznych zostało umieszczonych w urzędowych zestawach
metod analitycznych, prawie we wszystkich krajach Wspólnoty
Europejskiej.
___________________________________________________________________________
1)
AIJN - Association of the Industry of Juices and Nectars from Fruits and Vegetables
IFU - International Fruit Juice Union (inna nazwa IFFJP - International Federation of
Juice Producers)
3)
dokument dotyczący oceny jakości soków owocowych i warzywnych
4)
AOAC - Association of Official Analytical Chemists
5)
ISO - International Standardization Organization
2)
Metody enzymatyczne zostały przyjęte przez takie organizacje
międzynarodowe jak: ISO, EBC 6), IFU, IDF 7), OIV 8), ICUMSA 9) ,
IUPAC10), MEBAK11), NMKL12), OICCC 13).
Metodą enzymatyczną można również oznaczać zawartość
witaminy C.
Zasadę metody enzymatycznej opisano szczegółowo w poprzedniej
części pracy[1]. KA i inne związki o właściwościach redukujących
redukują sól tetrazolową MTT do MTT-formazanu, natomiast
oksydaza askorbinianowa utlenia wyłącznie KA do KDA. Zawartość
KA oblicza się wykorzystując różnice absorbancji MTT-formazanu
przy długości fali λ = 578 nm. Istnieje również możliwość obliczenia
zawartości KA łącznie ze wszystkimi związkami o właściwościach
redukujących zbliżonymi do KA, reagujących z
2,6-dichlorofenoloindofenolem (tzw. reduktonów). Sumę tych
związków często zwyczajowo nazywa się w przemyśle spożywczym
witaminą C. Jest to określenie nieprecyzyjne (porównaj pkt. I
WSTĘP: wit C = KA + KDA) W pracy, ze względów
systematycznych, witaminą C nazywano sumę związków
stanowiących „bezpośrednią redukcyjność”, czyli KA i inne związki
o właściwościach redukujących.
6)
EBC – European Brewing Convention
IDF – International Dairy Federation
8)
OIV – Office International de laVigne et du Vin
9)
ICUMSA – International Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis
10)
IUPAC – International Union for Pure and Applied Chemistry
11)
MEBAK – Mitteleuropäische Brautechnische Analysen Kommission
12)
NMKL – Nordisk Metodikkommitté för Livsmedel; Denmark, Norway, Sweden,
Iceland
13)
OICCC – Office International du Cacao, du Chcolat et de la Confiserie
7)
J. Danielczuk, W. Zieliński.
W metodzie spektrofotometrycznej, w celu oznaczenia
wyłącznie KA można wykonywać test kontrolny z zastosowaniem
formaldehydu i od otrzymanego wyniku odejmować poprawkę.
W metodzie enzymatycznej oznaczenie jest specyficzne
w stosunku do KA, gdyż oksydaza askorbinowa jest enzymem
„wysoce” specyficznym. Nie ma potrzeby izolacji oznaczanego
związku i wystarczy przygotować próbkę do pomiarów
fotometrycznych
Przy tak wysokiej specyficzności metody f-ma Boehringer gwarantuje
uzyskanie poprawności mierzonej jako odzysk w granicach od 94100 %.
Czułość metody
W metodzie miareczkowej czułość metody warunkowana jest
objętością kropli dodawanego 2,6-dichlorofenoloindofenolu i wynosi
ok. 10 mg/l. Z tego względu metoda miareczkowa jest mało przydatna
do oznaczeń witaminy C w produktach o niskiej zawartości witaminy
C, np.:
- sokach owocowo-warzywnych (bez dodatku witaminy C),
- napojach, np. w celu stwierdzenia rodzaju dodawanej zaprawy
- dżemach, np. w celu ustalenia najwłaściwszej metody utrwalania.
W metodzie spektrofotometrycznej niska czułość metody
warunkowana jest nie tylko objętością kropli dodawanego
2,6-dichlorofenoloindofenolu, lecz również dokładnością wykreślenia
krzywej wzorcowej i dokładnością odczytu spektrofotometrycznego.
Metoda enzymatyczna ma wyższą czułość wynikającą
z minimalnych uzyskiwanych różnic absorpcji, wg deklaracji firmy
Boehringer wynoszących 0,005 jednostek. Dla takiej różnicy
absorpcji, przy maksymalnej możliwej objętości roztworu próbki
równej 1,600 ml, czułość wynosi 0,1 mg/l, natomiast przy minimalnej
objętości roztworu próbki 0,100 ml można już oznaczyć KA na
poziomie 1,4 mg/l.
Bezpieczeństwo odczynników
W metodzie miareczkowej mają zastosowanie roztwory kwasu
szczawiowego i 2,6-dichlorofenoloindofenolu.
W metodzie spektrofotometrycznej dodatkowo stosuje się kwas
octowy lodowaty, zaliczany do trucizn ksylen, a do wyznaczania
poprawki na zawartość reduktonów – rakotwórczy formaldehyd.
Ksylen zakwalifikowany jest jako substancja łatwopalna, działająca
szkodliwie w przypadku narażenia drogą oddechową i w przypadku
kontaktu ze skórą [5].
W metodzie enzymatycznej odczynniki są bezpieczne
ekologicznie. Nie mają w niej zastosowania związki żrące lub trujące.
Czas trwania oznaczania
W metodzie miareczkowej oznaczanie trwa ok. 1 godziny
W metodzie spektrofotometrycznej oznaczanie jest długotrwałe.
Wykonanie dwóch powtórzeń, razem z poprawką do uzyskania
wyników o powtarzalności określanej normą, trwa ok. 4 godzin.
W metodzie enzymatycznej oznaczenie jest krótkotrwałe i trwa
ok. 1/2 godziny. W tym czasie można wykonać oznaczenie KA w serii
wielu próbek. Istnieje również możliwość automatyzacji oznaczenia.
Koszt odczynników (orientacyjny) na jedno oznaczenie; [PLN]
W metodzie miareczkowej jedno oznaczenie kosztuje ok.0,5 PLN, w
metodzie spektrofotometrycznej oznaczenie kosztuje ok.5,0 PLN,
natomiast w metodzie enzymatycznej ok.7,5 PLN. Koszt metody
enzymatycznej jest więc porównywalny z kosztem metody
spektrofotometrycznej.
Biorąc pod uwagę powyższe porównanie, zwrócono uwagę na
możliwość zastosowania w laboratoriach przemysłu owocowowarzywnego
enzymatycznej
metody
oznaczania
kwasu
L-askorbinowego wg Boehringera, która została szczegółowo opisana
w poprzedniej części pracy [1].
II.
MATERIAŁ DO BADAŃ
Materiał do badań stanowiły soki zakupione w punktach sprzedaży
detalicznej:
• próbki soków z kiszonej kapusty (23 szt.),
• próbki soków handlowych pomarańczowych (20 szt.)
• próbki soków handlowych z czarnych porzeczek (20 szt.)
Powyższe produkty stanowią dobre źródło witaminy C, a ponadto są
łatwym obiektem badań, gdyż nie wymagają ekstrakcji analitu do
roztworu przed analizą. Soki pomarańczowe i z kiszonej kapusty są to
typowe soki analizowane rutynowo w laboratoriach przemysłu
owocowo-warzywnego. Oznaczanie zawartości witaminy C w sokach
z czarnych porzeczek często jednak nastręcza problemy.
Uzyskano wyniki oznaczeń witaminy C i KA metodami wg PN
i metodą enzymatyczną. Łącznie analizowano 5 wariantów metod [1]:
• wariant I:
metoda miareczkowa – do oznaczeń witaminy C
• wariant II:
metoda spektrofotometryczna bez poprawki – do oznaczeń
witaminy C
• wariant III:
metoda spektrofotometryczna z poprawką – do oznaczeń KA
• wariant IV
metoda enzymatyczna – do oznaczeń KA
• wariant V
modyfikacja metody enzymatycznej – do oznaczania witaminy C.
III. METODYKA STATYSTYCZNA
Dla omawianych trzech metod w pierwszej części pracy [1]
oznaczono i porównano wskaźniki statystyczne dotyczące:
• poprawności mierzonych odzyskiem oraz
• powtarzalności
mierzonych
współczynnikiem
zmienności
i ocenianych testem Snedecora.
W niniejszej pracy przeprowadzono analizę zgodności wyników
równoległych oznaczeń prowadzonych dwiema metodami [2,14].
Jeżeli X oznacza wynik oznaczenia uzyskiwany metodą 1, zaś Y jest
wynikiem oznaczenia (równoległego) metodą 2, to rezultaty te
związane są zależnością
Y=aX+b+ε
Przy czym ε oznacza błąd pomiaru. Zgodnie z ogólną teorią pomiaru
możemy przyjąć, że wyniki oznaczeń są zmiennymi losowymi
o rozkładach normalnych.
Badane metody uznawane są za równorzędne, jeżeli dla każdej próbki
uzyskuje się X=Y z dokładnością do błędów losowych niezależnych
od otrzymywanych rezultatów, np. błędów odczytów. Innymi
słowami, metody są zgodne jeżeli w powyższym równaniu regresji
a=1 oraz b=0. Jeżeli jednak a≠1 i/lub b≠0, to mamy do czynienia
z metodami niezgodnymi, przy czym każda z trzech możliwości ma
zupełnie inne znaczenie. Pokrótce omówione one zostaną poniżej.
Pierwsza sytuacja, w której a=1 oraz b≠0 świadczy o tym, że
analizowane metody dają wyniki ,,przesunięte'' względem siebie
o wartość błędu
systematycznego. Wielkość tego
błędu
reprezentowana jest przez stałą b. Można to interpretować w ten
sposób, że co najmniej jedna z metod popełnia pewien błąd
systematyczny w swoich oznaczeniach. Odkrycie, która z metod
popełnia ów błąd wymaga specjalnie zaplanowanych eksperymentów.
Druga sytuacja, w której a≠1 oraz b=0 świadczy o stałym ,,gubieniu''
części oznaczanej witaminy C przez jedną z metod, przy czym, jeżeli
a<1, to metoda druga (Y) gubi w stosunku do pierwszej (X), natomiast
jeżeli a>1, to metoda pierwsza (X) gubi w stosunku do drugiej (Y).
Jeżeli na przykład a = 0.7, to druga metoda wskazuje tylko 70% tego
co pokazuje metoda pierwsza (X), czyli nie wykrywa 30% zawartej
w soku witaminy C (zakładając oczywiście, że metoda pierwsza
wskazuje rzeczywistą jej zawartość).
Trzecia sytuacja, w której a≠1 oraz b≠0 świadczy o całkowitej
niezgodności porównywanych metod. Występuje tutaj zarówno błąd
systematyczny jak i stałe ,,gubienie'' części oznaczanej witaminy C.
Analizy statystyczne oparte na parach wyników równoległych
oznaczeń (X1,Y1),…,(Xn,Yn) rozpoczynamy od weryfikacji hipotezy
H0: a=1 oraz b=0
Korzystając z ogólnej teorii weryfikacji hipotez statystycznych
w modelach liniowych [14] skonstruowano specjalny test oparty na
rozkładzie F Snedecora. Nie odrzucenie powyższej hipotezy sugeruje,
że badane metody można traktować jako równoważne. Jeżeli liczba ta
jest większa od założonego poziomu istotności (tutaj: 0.05), to
hipotezy nie odrzuca się. W przeciwnym przypadku należy hipotezę
odrzucić i można wówczas przejść do szczegółowej analizy jednej
z trzech omówionych wcześniej sytuacji. Do rozpoznania, z którą
sytuacją mamy do czynienia zastosowano przedziały ufności dla
współczynnika regresji „a” oraz stałej regresji „b”. Jeżeli liczba jeden
znajduje się w przedziale ufności dla współczynnika regresji, to
można uznać, że a=1. Podobnie dla stałej regresji, przy czym tutaj
badane jest, czy zero leży w odpowiednim przedziale ufności. Należy
zwrócić uwagę na to, że mimo iż ogólna hipoteza została odrzucona,
to szczegółowe badanie parametrów regresji doprowadza do
wniosków, iż możliwe jest, że a=1 oraz b=1. Wydaje się, iż jest to
sprzeczne z odrzuceniem hipotezy (H0:a=1 oraz b=0). Niemniej
jednak, taki wynik w badaniach statystycznych jest możliwy.
Sugeruje, to iż dla pewnych zawartości witaminy C badane metody
dają wyniki rozbieżne, zaś dla innych oznaczenia są zgodne.
Rozstrzygnięcie problemu zgodności oznaczeń dla takich metod
wymaga dalszych badań. Należy podkreślić, że w prowadzonych
badaniach nie wystąpiła tak sytuacja.
Siła związku między wynikami oznaczeń może być przedstawiona
współczynnikiem korelacji. Należy jednak pamiętać, że wartość
współczynnika korelacji ma niewiele wspólnego z uzyskanymi
wartościami współczynników funkcji regresji. Jeżeli współczynnik
osiąga wartość bliską jedności, to element przypadkowości
w oznaczeniach jest niewielki i uzyskaną funkcję regresji można
niemalże traktować jako formułę przeliczeniową wyników jednej
metody na drugą. W przypadku niewielkiej korelacji, element
przypadkowości oznaczeń jest znacznie większy i uzyskany wzór
funkcji regresji tylko w dużym przybliżeniu umożliwia wzajemne
przeliczanie wyników oznaczeń.
Analizę statystyczną przeprowadzono w specjalnie przygotowanym
arkuszu kalkulacyjnym.
Ze względu na całkowicie odmienny sposób oznaczania metodami wg
PN i enzymatyczną, porównano nie tylko zawartości KA oznaczanych
tymi dwiema metodami i witaminy C oznaczanej dwiema metodami,
lecz również np. KA oznaczany metodą wg PN z witaminą C
oznaczaną metodą enzymatyczną [14].
II.
1.
WYNIKI BADAŃ I ICH OMÓWIENIE
Analiza zgodności wyników uzyskiwanych w próbach
równoległych
1.1 Metody zgodne
Dla soków pomarańczowych i z kiszonej kapusty przyjęto hipotezę
H0, pełnej zgodności wyników metody oznaczania witaminy C:
enzymatycznej i miareczkowej. Wartości p wynosiły bowiem
odpowiednio dla rodzaju produktu: 0,2075 i 0,5458 i były wyższe od
zadanego poziomu istotności α = 0,05.
Reasumując: powyższe metody można uważać za równorzędne
z dokładnością do błędów losowych i stosować do omawianych
soków uzyskując równoważne wyniki.
1.2 Metody niezgodne (sytuacja 1)
Wyniki niezgodne określone jako sytuacja 1 otrzymano dla metod
stosowanych do analizy soków z czarnych porzeczek.
Porównując oznaczanie witaminy C metodą enzymatyczną
i spektrofotometryczną uzyskano wartość p = 0,0256, a więc niższą od
Również przy porównaniu oznaczania KA metodą enzymatyczną
i spektrofotometryczną uzyskano wartość p = 0,0094, niższą od
Rozstrzygnięcie, czy wobec innych stwierdzonych niedoskonałości
metody spektrofotometrycznej nie byłoby uzasadnione zastąpienie
metody spektrofotometrycznej metodą enzymatyczną, wymaga
dalszych badań.
1.3 Metody niezgodne (sytuacja 2)
Wyniki niezgodne określone jako sytuacja 2 (p=0,000) otrzymano
przy porównywaniu wyników : enzymatycznego oznaczania KA
z miareczkowym (soki pomarańczowe) lub spektrofotometrycznym
(soki z czarnych porzeczek) oznaczaniem witaminy C.
Jest to całkowicie zrozumiałe, gdyż pierwszą z wymienionych metod
enzymatycznie oznacza się KA, czyli jedynie składową witaminy C.
2.
Analiza korelacji wyników uzyskiwanych równolegle
dwiema metodami
Porównując wyniki oznaczeń równoległych dwiema metodami
wyznaczono również odpowiednie równania regresji liniowej;
Y = aX + b, przedziały ufności dla współczynników „a” i „b” oraz
współczynniki korelacji „r”. Osobno omówione zostaną korelacje dla
metod zgodnych i niezgodnych.
2.1 Metody zgodne
Dla soków pomarańczowych i z kiszonej kapusty, porównując
oznaczanie witaminy C: metodą enzymatyczną (Enz. C)
i miareczkową (Miar C) uzyskano odpowiednio do produktu
następujące równania regresji:
Dla soków z kapusty:
Miar C = 1,0057 Enz. C + 7,6115
w którym:
• niepewności współczynników równania regresji wynoszą:
a±0,21 ; b±56,76
• Miar C – wynik metody miareczkowej oznaczania wit. C
• Enz C – wynik metody enzymatycznej oznaczania wit. C
Dla soków pomarańczowych:
Miar C = 0,8878 Enz. C + 32,4708
w którym:
a±0,22 ; b±57,08
• Miar C i Enz C – j.w
Dla równań tych uzyskano stosunkowo wysokie współczynniki
korelacji „r”: dla soków z kiszonej kapusty współczynnik korelacji
metod „r” wynosił 0,9084, a dla soków pomarańczowych 0,8926.
Oznacza to, że korzystając z powyższych równań można stosunkowo
dokładnie szacować zawartość witaminy C, która byłaby oznaczona
miareczkowo (wg metodyki obowiązującej) na podstawie wyniku
oznaczania witaminy C metodą enzymatyczną. Na dokładność
oszacowania będą również miały wpływ obliczone przedziały ufności
współczynników równania regresji.
2.2 Metody niezgodne (sytuacja1)
Dla soków z czarnych porzeczek, porównując oznaczanie witaminy C
metodą enzymatyczną (Enz. C ) i spektrofotometryczną (Spektr. C)
oraz oznaczanie KA metodą enzymatyczną (Enz KA )
i spektrofotometryczną (Spektr KA), uzyskano następujące równania
regresji:
dla witaminy C:
Spektr. C = 0,6293 Enz. C + 66,4001
w którym:
a±0,21 ; b±56,76
• Spektr C – wynik metody spektrofotometrycznej oznaczania
wit.C
• Enz C – wynik metody enzymatycznej oznaczania wit C
oraz
dla KA:
Spektr. KA = 0,4533 Enz. KA + 56,5078
w którym:
a±0,36 ; b±34,21
• Spektr KA – wynik metody spektrofotometrycznej oznaczania
KA
• Enz KA – wynik metody enzymatycznej oznaczania KA.
Współczynniki korelacji dla tych związków wyników były niskie:
odpowiednio: 0,7018 i 0,5299. Wobec tego powyższych równań nie
można wykorzystywać do szacowań zawartości witaminy C i KA.
2.3 Metody niezgodne (sytuacja2)
Dla soków pomarańczowych i z czarnych porzeczek porównano
wyniki zawartości KA oznaczonego metodą enzymatyczną (Enz KA )
i witaminy C oznaczonej metodą miareczkową (Miar C) lub
spektrofotometryczną (Spektr. C). Mimo, że metoda enzymatyczna
oznaczania KA nie była zgodna z metodami miareczkową ani
spektrofotometryczną oznaczania witaminy C , uzyskano wysokie
wartości współczynników korelacji: odpowiednio 0,9775 i 0,9013 dla
obrazujących te związki równań regresji:
dla soków pomarańczowych:
Miar C = 0,9850 Enz KA + 48,6534
w którym:
a±0,11 ; b±29,27
• Miar C – wynik metody miareczkowej oznaczania witaminy C
• Enz KA – wynik metody enzymatycznej oznaczania KA
dla soków z czarnych porzeczek:
Spektr. C = 1,0011 Enz KA + 70,6075
w którym:
a±0,24 ; b±22,69
• Spektr C – wynik metody spektrofotometrycznej oznaczania
witaminy C
• Enz KA – wynik metody enzymatycznej oznaczania KA
3.
Praktyczne zastosowanie wyników analizy i podsumowanie
3.1 Wykorzystanie równań regresji dla metod zgodnych:
W przypadku stosowania w laboratorium metody enzymatycznej
oznaczania witaminy C w sokach z kiszonej kapusty lub
pomarańczowych, obliczone równania regresji mogą znaleźć
zastosowanie do przeliczania uzyskanych wyników na wyniki obecnie
obowiązującej wg PN metody miareczkowej. Porównując
współczynniki korelacji liniowej dla metod zgodnych, dla soków
z kiszonej kapusty i pomarańczowych (odpowiednio 0,9084 i 0,8926),
nieco dokładniejsze oszacowanie uzyskamy obliczając wynik metody
miareczkowej z równania regresji dla soków z kapusty niż
pomarańczowych. Dla tego równania również niepewności
współczynników a i b są niższe.
3.2 Wykorzystanie równań regresji dla metod niezgodnych:
Równania regresji dla metod niezgodnych (sytuacja 2) ,
w szczególności dla soków pomarańczowych, można wykorzystać do
obliczania:
• przybliżonej zawartości KA jaką otrzymalibyśmy metodą
enzymatyczną (KA-Enz), na podstawie wyniku oznaczania
witaminy C metodą miareczkową (wit C-miar) lub odwrotnie,
• przybliżonej poprawki na zawartość reduktonów ,jako różnicy
zawartości witaminy C oznaczonej metodą spektrofotometryczną
lub miareczkową i zawartości KA obliczonej dla tej samej próbki
z odpowiedniego równania regresji. Poprawkę można by obliczać
bez wykonywania oznaczenia, odejmując jedynie od wyniku
oznaczenia metodą miareczkową wit. C wynik oszacowanej
zawartości KA.
Miarą dokładności szacunków mogą być obliczone długości
przedziałów ufności dla współczynników „a” i „b” równań regresji
stosowanych równań.
III. WNIOSKI
1.
2.
3.
Metody enzymatyczna i miareczkowa oznaczania witaminy C
w sokach z kiszonej kapusty i pomarańczowych dawały zgodne
wyniki
Metody enzymatyczna i spektrofotometryczna stosowane dla
soków z czarnych porzeczek dawały wyniki niezgodne
Wyznaczone równania regresji dla zależności wyników metod
enzymatycznej oznaczania KA i miareczkowej oznaczania
witaminy C można wykorzystać do obliczania przybliżonej
zawartości reduktonów bez wykonywania dodatkowej analizy
chemicznej.
IV. PIŚMIENNICTWO
1.
2.
3.
4.
5.
Danielczuk J., Jakubowski A., Czarnecka A.: Badania porównawcze
oznaczania zawartości kwasu L-askorbinowego metodą enzymatyczną
i metodami wg Polskiej Normy w wybranych sokach owocowych
i warzywnych, Pr. Inst. Lab. Bad. Przem. Spoż, 2000, t.55, s.127-151
Dobecki M.: „Zapewnienie jakości analiz chemicznych”, Oficyna
Wydawnicza Instytutu Medycyny Pracy, Łódź, 1998
Drzazga B.: Analiza techniczna w przetwórstwie owoców i warzyw,
Wydawnictwa Szkolne i Pedagogiczne, Warszawa 1974
Dziennik Ustaw Rzeczypospolitej Polskiej Nr. 88 z dn. 29 października
1999 r.
Dziennik Ustaw Rzeczypospolitej Polskiej, załącznik do Nr 105, poz. 671
z dn. 10 września 1997 r., „Substancje chemiczne stwarzające zagrożenie
dla zdrowia lub życia”.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Henniger G.: (1997), Introduction into Procedures of Enzymatic
Analysis, Materiały z seminarium, nt. ”Enzymatyczne metody analizy
żywności”.
Horubała A.:, Zastosowanie metod enzymatycznych w kontroli jakości
żywności. Przem. Ferm. Owoc.-Warz., 1994, nr 9, s.1-3
Kajita T., Senda M.: Simultaneous determination of L-ascorbic acid,
triose reductone and related compounds in foods by a polarographic
method. J. Agr. Chem. Soc. Jap., 1972, t.46, nr 3, s.137-145
Kolesnov A. Ju.: Fermentativnyjj analiz w pishhevojj promyshlennosti.
Pishh. Prom., 1996, nr 11, s.24-28
Liao T. , Swi-Bea Wu J, Ming-Chang Wu: Epimeric Separation of LAscorbic Acid by Capillary Zone Electrophoresis. J. Agric. Food Chem.,
2000, t.48, s.37-41
Matsumoto K., Yamada K., Osajima Y.: Ascorbate electrode for
determination of L-ascorbic acid in food. Anal. Chem., 1981. t.53. nr 13,
s.1974-1979
Okuma H., Takahashi H., Yazawa S. i in.: Determination of L-ascorbic
acid in green tea with an enzyme reactor electrolise system. J. Jap. Sci.
Food Sci. Technol., 1996, t.43, nr 6, s.668-673
PN-98/A-04019; „Produkty spożywcze. Oznaczanie zawartości
witaminy C”
Seber G.A.F.: Linear Regression Analysis, Wiley, 1997
Wartanowicz M., Ziemlański Ś.: Rola witaminy C (kwasu
askorbinowego) w fizjologicznych i patologicznych procesach ustroju
człowieka. Żyw. Człow. Metabol., 1992, t.19, nr 3, s.1193 – 1206
INSTITUTE OF AGRICULTURAL AND FOOD BIOTECHNOLOGY
Department of Fruit and Vegetable Product Technology
Joanna Danielczuk, Wojciech Zieliński *
COMPATIBILITY ANALYSIS OF THE RESULTS OF L-ASCORBIC
ACID DETERMINATION BY BOEHRINGER ENZYMATIC METHOD
AND BY THE METHODS ACCORDING TO THE POLISH
STANDARD
Summary
Statistical elaboration of the research results of L-ascorbic acid and
vitamin C determinaton in three types of fruit and vegetable juices by the
methods according to the Polish Standard (titration and spectrophotometric
analysis) and by the enzymatic method was presented in the previous part of the
work, published in 2000. Then statistical evaluation of the determination results
with line regression analysis was carried on in order to find:
• consistency or inconsistency of the results obtained by the methods according
to the Polish Standard (PS) with the results by the enzymatic method with
acceptance or rejection of statistical hypothesis
• possibility of the replacement of the methods according to the PS with the
enzymatic method and conversion of the determination results to the now
obligatory results according to the PS, with use of the proper regression
equations
• possibility of use of the regression equations for calculation of approximate
reducton content corections in juice samples (titration and
spectrophotometric methods)
Practical applications of the elaborated line regression equations of the
interdependance of obtained determination results are show.

Przydatność metody enzymatycznej do

Transkrypt

Podobne dokumenty

Vitaminum A 2500 50 kaps.

Śliwkowy zawrót głowy

Plik PDF - art of BEAUTY

Acerola

DX2, szampon wzmacniający włosy dla mężczyzn x 30 kaps.

owocu aceroli

Gazetka 10.2016

streszczenie - Konferencja BioMedTech Silesia

D-Vitum Forte 1000 jm 120 kaps.