Zastosowanie spektrofotometrii UV w analizie leków

Zastosowanie spektrofotometrii UV w analizie leków

Zastosowanie spektrofotometrii w UV
w analizie leków
Dr n.farm. Ireneusz Bilichowski
2012
1
Umowny podział zakresów promieniowania elektromagnetycznego
2
Absorpcyjna spektrofotometria w nadfiolecie i świetle widzialnym jest jedną z fizycznych metod badania własności substancji leczniczych używaną w Farmakopei Europejskiej 6.0 i Polskiej VIII, i opisaną w rozdziale 2.2.25
3
Tabela 1
Promieniowanie
Długość
Metoda spektroskopowa
radiowe
1 ­ 1000m
NMR – Magnetyczny rezonans jądrowy
mikrofalowe
106 – 108 nm
EPR – Paramagnetyczny rezonans jądrowy
podczerwone
750 – 106 nm
IR – Absorbcja w podczerwieni
widzialne
400 – 750 nm
VIS – Absorbcja w świetle widzialnym
nadfioletowe
10 – 400 nm
UV – Absorbcja w nadfiolecie, Spektrometria Ramana, Fluorescencja (UV i VIS)
rentgenowskie
10­3 – 10­1 nm
Rentgenografia strukturalna
Analityczny zakres długości fali wykorzystywany w nadfiolecie wynosi od 200 do 400 nm.
4
Metody Spektroskopowe
H1 NMR
C13 NMR
UV­vis
MS
IR
Ustalanie struktury: NMR > MS > IR > UV-vis
Czułość, Limit Detekcji: MS > UV-vis > IR > 1H NMR > 13C NMR
5
Falowy wykres promieniowania elektromagnetycznego
Z fizyki wiemy że promieniowanie ma dualistyczną naturę:
falową – potwierdzają: polaryzacja, załamanie, dyfrakcja, interferencja
kwantową – którą potwierdza efekt fotoelektryczny
6
Promieniowanie elektromagnetyczne
Jednostki
Jednostkiddługo
ługośścicifali:
fali:
Energia przenoszona przez kwanty promieniowania opisana jest równaniem Plancka:
E = h·ν
-6-6
--µm
–
10
µm – 10 m
m
-9-9
--nm
–
10
nm – 10 m
m
E = h·c/λ = hc·ν
-10
--Å
–
10
Å – 10-10m
m
h – stała Plancka 6,62×10-34 J×s
ν = 1/λ liczba falowa [cm-1]
częstotliwość promieniowania – liczba drgań na sekundę [s­1], [Hz]
 =c/λ
c = 3,0×1010 cm/s prędkość światła w próżni
λ – długość fali, odległość pomiędzy sąsiednimi maksimami
7
Promieniowanie elektromagnetyczne
Przykład obliczenia energii promieniowania elektromagnetycznego z zale żno ści od d ługo ści fali
Wzory, stałe fizyczne
Energia 1 mola fotonów o dł. fali 500 nm (światło widzialne)
Energia 1 mola fotonów o dł. fali 200 nm (światło UV)
500 nm = 500 × 10^­9 [m]
200 nm = 200 × 10^­9 [m] = c / 
 = c / 
prędkość = 2,988 × 10^8 / 500 × 10^­9
 = 2,988 × 10^8 / 200 × 10^­9 2,988 ×10^8
światła c  = 5,98E+014 [ s­1 ]
 = 1,49E+015 [ s­1 ]
[m/s]
E = h∙  E = h∙ 
stała Plancka 6,626 ×10^­34 E = 6,626 x 10^­34 × 5,98 x 10^14 E = 6,626 x 10^­34 × 1,49 x 10^15 Częstotliwość [ s­1 ]
 = c / 
h [J∙ s]
Energia [J]
mol
E = h∙ 
6,023 ×1023
E = 3,96E­019 [J] = 3,96E­022 [kJ] E = 9,90E­019 [J] = 9,90E­022 [kJ]
1 mol fotonów 1 mol fotonów E = 6,023×10^23 [mol­1] ×3,96 × E = 6,023 x 10^23 [mol­1] x 9,90 x 10^­22 [kJ] 10^­22 [kJ] ­1
E = 238,49 [kJ ∙ mol ]
E = 596,231 [kJ mol­1]
­1
~E = 240 [kJ∙ mol ]
~E = 600 [kJ∙ mol­1]
8
Absorpcja
Energia jest skwantowana
Promieniowanie elektromagnetyczne jest absorbowane przez substancję jedynie kiedy ilość energii odpowiada energii potrzebnej do wzbudzenia cząsteczki.
W wyniku absorpcji może ulec zmianie energia wewnętrzna cząsteczki:
elektronowa
wibracyjna
rotacyjna
E2
Energy
∆E = E2 – E1
E1
9
Energia wewnętrzna cząsteczki
Elektronowa – zakres UV
Zmienia się rozkład elektronów wokół atomu lub cząsteczki na powłokach walencyjnych.
Wibracyjna – zakres IR
Zmienia się średnia odległość jąder A – B
(długość wiązania)
A —— B Rotacyjna – zakres IR
Zmienia się energia cząsteczki odpowiadająca za obrót wokół środka ciężkości
E = Eelektronowa +
Eelektronowa
>
Ewibracyjna + Erotacyjna +
Ewibracyjna
>
10
Erotacyjna >
Etranslacyjna
Etranslacyjna
Elektronowe pasmo absorpcyjne składa się z wielu pasm
nakładających się na siebie
11
12
chromofory są to ­ ugrupowania w cząsteczce o wiązaniach podwójnych odpowiedzialne za absorpcję C = C N = N
C = O
N = O
C = N
C = S
Auksochromy ­ podstawniki związane z chromoforami które mogą przesuwać pasmo absorbcji i zmieniać intensywność (εmax) wskutek efektów mezomerycznych i indukcyjnych. Do aksochromów zaliczamy atomy tlenowców, chlorowców, grupy aminowe, jony fenolanowe, które dysponują wolnymi parami elektronowymi (elekronami typu n).
C­OH
C­NH2
C­Br
C­Cl
Efekt batochromowy ( przesunięcie w stronę fal długich ­ red shift) Efekt hipsochromowy (przesunięcie w stronę fal krótszych ­ blue shift). 13
 max =  max(główny chromofor) + (auksochromów)
14
Podstawowe układy chromoforowe
Wiązanie nienasycone ­ ETYLEN
Orbital wiążący HOMO
Orbital antywiążący LUMO
Podwójne wiązanie działa jak chromofor. Podczas przejścia ← elektron z orbitalu  zostaje wzbudzony do orbitalu antywiążącego  15
Podstawowe układy chromoforowe
Grupa karbonylowa
Działanie grupy C=O jak chromoforu polega na wzbudzeniu niewiążącej pary elektronowej n atomu tlenu do antywiążącego orbitalu  grupy C=O.
16
Podstawowe układy chromoforowe
Pojedyncze wiązanie podwójne jeszcze nie wystarcza aby wystąpiło silne
pasmo absorpcyjne nadające się do celów analitycznych. !
Dopiero
oddziaływania,
czyli
sprzężenia
pomiędzy
grupami
chromoforowymi ( - ), oraz między chromoforami i auksochromami
prowadzą do powstania silnych pasm absorbcji w zakresie 200 – 400 nm,
lub 400 – 800 nm.
17
Własności chromoforów - wpływ rozpuszczalnika
Tabela 2
Własności absorbcyjne izolowanych (niesprzężonych chromoforów)
Grupa chromoforowa, związek
Przejście
CHCl3
CH3OH
* ← 
*← n
NH3
Etylen
CH2=CH2
Karbonylowa
aceton (CH3)2CO
Karbonylowa, kwas octowy
CH3COOH
Karbonylowa, aldehyd octowy
CH3COH
* ← n
* ← 
* ← n
* ← n
* ← n
18
dł. fali [nm],
rozpuszczalnik
173, pary
183,
177, n-heksan
192 , pary
165, pary
195
188, n-heksan
279
204, etanol
204, woda
293, heksan
 max
15000
10000
900
15
41
60
11,8
Własności chromoforów ­ wpływ rozpuszczalnika
Tabela 3
cecha
intensywność pasma
zastąpienie rozpuszczalnika
niepolarnego przez polarny
zakwaszenie roztworu
* - 
duża max » 104 - 105
małe przesunięcie ku falom
dłuższym - batochromowe
brak zmian
* - n
mała max » 5 ·101 - 103
przesunięcie ku falom
krótszym - hipsochromowe
zanik pasma
wprowadzenie podstawnika
elektrodonorowego
polaryzacja pasma
pojawienie się nowych pasm
przesunięcie ku falom
krótszym
prostopadle do płaszczyzny
w płaszczyźnie cząsteczki
19
Przykład Obliczenia pochodnych kwasu benzoesowego
Główny chromofor
230 nm
p-OH
25 nm
o, m-OH
2x7
14 nm
Obliczone
suma
269 nm
Obserwowane
270 nm
R.M. Silverstrein, G.C. Bassler, „Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych”, PWN, Warszawa 1970, rozdz. 5 s. 158
20
widma UV ­ przykłady
Widmo UV benzenu
w n-heksanie 1:1000, 1cm
1,0000
0,9000
0,8000
0,7000
A
0,6000
A
0,5000
0,4000
0,3000
0,2000
0,1000
0,0000
210,0 220,0 230,0 240,0 250,0 260,0 270,0 280,0 290,0 300,0
[nm]
21
Benzen wykazuje szerokie pasmo absorpcji pomiędzy 230 a 260 nm. W rozpuszczalnikach niepolarnych pasmo to posiada strukturę subtelną. W rozpuszczalnikach polarnych zanika struktura subtelna.
Gdy grupa chromoforowa przyłączona jest do pierścienia wtedy pasmo benzenoidowe przesuwa się w kierunku dłuższych fal.
Podstawniki z wolna parą elektronową ułatwiają przejścia  – * w wyniku oddziaływania z układem aromatycznym i powodują batochromowe przesunięcie pasma.
widma UV ­ przykłady
EPHEDRINI HYDROCHLORIDUM, EP 6.0
E p h e d rin i H C l
1,0000
0,9000
0,8000
0,7000
A
0,6000
0,5000
0,4000
0,3000
0,2000
0,1000
0,0000
220,0
230,0
240,0
250,0
260,0
270,0
280,0
290,0
300,0
[nm]
Efedryny chlorowodorek w wodzie, c = 0,72 mg/100 ml ; 1 cm
W widmie efedryny obserwujemy pasmo benzenoidowe. Do pierścienia benzenu nie są
przyłączone polarne grupy, więc wibracyjna struktura widma została zachowana ponieważ
chromofor nie oddziałuje silnie z rozpuszczalnikiem.
22
widma UV ­ przykłady
F e n o lo k w a s y w m e ta n o lu
1,00
0,90
0,80
302 nm
0,70
A
0,60
Salicylamid
0,50
Kw. salicylowy
Kw. acetylosalicylowy
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
210,0
230,0
250,0
270,0
290,0
310,0
330,0
350,0
[nm]
nieb. Kwas salicylowy w metanolu 1,60 mg/100 ml, 1cm
cz. Kwas acetylosalicylowy w metanolu 1,67 mg/100 ml, 1cm
ziel. Salicylamid w metanolu 1,54 mg/100 ml, 1cm
Obecność wolnej grupy fenolowej sprawia, że w widmie kwasu salicylowego i salicylamidu
obserwuje się batochromowe przesunięcie pasma benzenoidowego do 302 nm,
zanik jego struktury oscylacyjnej i wzrost intensywności.
23
Wpływ pH na położenie  max
Prokainamidu chlorowodorek
1,20
1,00
A
0,80
H2O
Hcl 3,6 g/L
NaOH 4g/L
0,60
0,40
0,20
0,00
200,0
220,0
240,0
260,0
280,0
300,0
320,0
[nm]
Prokainamidu chlorowodorek 1,16 mg/100 ml
N – w H2 O
Z – w NaOH 4g/l
Cz – w HCl 3,6g/l
24
340,0
360,0
380,0
Wpływ pH na położenie  max
Prokainy chlorowodorek
1,20
1,00
A
0,80
H2O
Hcl 3,6 g/L
NaOH 4g/L
0,60
0,40
0,20
0,00
205,0
225,0
245,0
265,0
285,0
305,0
[nm]
Prokainy chlorowodorek 0,0101 mg/ mL
N – w H2O
Z – w NaOH 4g/l
Cz – w HCl 3,6g/l
25
325,0
345,0
365,0
Wpływ pH na położenie  max
W widmach prokainy i
prokainamidu za zmianę
intensywności pasma odpowiada
auksochrom – grupa -NH2
W środowisku zasadowym wolna
para elektronowa na atomie azotu
oddziaływuje z chromoforem.
26
Wpływ pH na położenie  max
Fenobarbital
N­metylofenobarbital
Fenobarbital
N­Metylofenobarbital
0,80
0,70
0,70
0,60
0,60
0,50
0,50
0,40
pH10
A
A
0,80
pH12
pH12
0,30
0,30
0,20
0,20
0,10
0,10
0,00
220,0
230,0
240,0
250,0
260,0
270,0
280,0
290,0
0,00
220,0
300,0
pH10
0,40
230,0
240,0
250,0
260,0
270,0
[nm]
[nm]
PerkinElmer Lambda 25
Fenobarbital c = 1,0816 mg/100 ml; N­MetyloFenobarbital c = 1,152 mg/100 ml; Niebieskie – 0,1 M bufor boranowy pH=10,0 ;
czerwone – 0,1 M NaOH pH=12,0
27
280,0
290,0
300,0
Wpływ pH na położenie  max
Fenobarbital
pH 2,0
0,1 mol/l HCl
pH 10,05
bufor boranowy
pH 12,0
0,2 mol/L NaOH
N-metylofenobarbital
pH 2,0
pH 10,05 i pH 12,0
28
Wpływ pH na położenie  max
Sulfanilamid
29
Wpływ pH na położenie  max
30
Sulfonamidy
Związek
Rozpuszczalnik, maksimum abs. ()
Sulfanilamid
R=H
NaOH
254 nm ( 1402)
H2O
258 nm
0,1M HCl
218 ; 264 nm
0,1M HCl 218nm (480); 270
nm(200)
NaOH
258 nm (520)
H2O
258 nm (452) ;
284nm (549)
NaOH
258 nm
H2O
254 nm (600) ;
272 nm (660)
0,1M HCl
243nm ; 303 nm
Sufacetamid
R = -CO-CH3
Sulfatiazol
R=
Sulfadimidyna
R=
31
Zastosowanie elektronowych widm absorpcyjnych:
1. Dysponując tylko widmem UV nie można jednoznacznie zidentyfikować danego związku, ponieważ widma w zakresie 200 ­ 800 nm informują nas o rodzaju układu chromoforowego, a nie o grupach funkcyjnych obecnych w cząsteczce co jest domeną IR. Widma IR i NMR dają więcej informacji o budowie związku niż widma w zakresie UV.
2. Poszczególnym chromoforom można przyporządkować długość fali tylko dla prostych związków ( metanol, aceton, kwas octowy itd.) W złożonych związkach pasma od chromoforów nakładają się oraz położenie maksimów zależy od innych czynników jak obecność grup sąsiednich i rodzaju rozpuszcalnika.
3. Można ustalić typ przejść elektronowych p* badając widma w rozpuszczalnikach o różnej polarności
4. Różnice w położeniu i natężeniu pasm absorpcyjnych różnych form cząsteczkowych są wykorzystywane do badania równowag jakie się ustalają między nimi w roztworach
5. Do oznaczania zawartości na podstawie prawa Lamberta Beera
6. Jako dodatkowa metoda identyfikacji na podstawie położenia max i min badanej substancji
7. Do oznaczania czystości badanych związków – przesunięcie położenia maksimum absorpcji, porównanie stosunku wartości absorbancji w dwóch różnych punktach widma
32
Zastosowanie elektronowych widm absorpcyjnych:
Zalety
Wady
łatwa do wykonania metoda analityczna, o dobrej precyzji do oznaczania
zawartości substancji w formach leku
•
mała ilość próbki potrzebna do oznaczenia 10-6 g i krótki czas analizy
•
powszechność spektrofotometrów i detektorów UV
•
rutynowa metoda do wyznaczania fizyko-chemicznych własności
•
niewielkie koszty aparatury
•
mała selektywność
•
wiele związków daje maksimum absorpcji przy tej samej długości fali ,
duże podobieństwo widm w tej samej grupie związków
•
addytywność absorpcji, nie może być zastosowana do analizy mieszanin
związków
•
silny wpływ zanieczyszczeń na kształt widma
•
33
Zastosowanie spektrofotometrii UV w analizie farmaceutycznej:
Często jako podstawowa metoda do oznaczania ilości substancji leczniczej w takich postaciach leku jak tabletki, drażetki jeżeli pozostałe związki nie interferują
wyznaczanie stałych pKa niektórych związków
określenie stopnia uwalniania substancji leczniczej (dissolution testing)
monitorowanie w reakcji kinetyki rozkładu leków
widmo UV może być użyte jako jedna z metod identyfikacji w monografii farmakopealnej
34
Zastosowanie spektrofotometrii UV do badania własności substancji leczniczych, i potwierdzania ich czystości. Nowe wymagania
Farmakopea Europejska 6.0 i Polska VIII ­ rozdział 2.2.25.
35
Badanie czystości substancji
Prawo addytywności absorpcji
Jeżeli absorbancje są zdarzeniami niezależnymi, to absorbancja
całkowita roztworu mieszaniny jest równa sumie absorbancji
poszczególnych jej składników.
n
A = ∑ A i = A1 + A 2 + A n
(1)
i=1
n
A = ∑ a  n⋅cn⋅l = a 1 c1 l + a 2 c2 l + a n c n l
i=1
gdzie: Al – absorbancja przy danej długości fali
c – stężenie roztworu
al – współczynnik absorpcji
l – grubość warstwy
36
(2) Prawo addytywności absorpcji – graficzna interpretacja
37
Badanie czystości substancji farmakopealnej
METODY BADANIA
1. Wykonaniu roztworu badanej substancji i na podstawie widma określenia lambda maksimum i
obliczeniu absorbancji właściwej, i porównaniu otrzymanych danych z wartościami w
monografii w farmakopei.
2. Porównanie widma badanej substancji z widmem substancji wzorcowej. Otrzymane widmo
powinno mieć w tych samych warunkach (ten sam rozpuszczalnik i grubość warstwy) takie
same położenie max i min, oraz tą samą wartość intensywności.
3. Innym sposobem sprawdzenia identyczności dwóch widm jest porównanie stosunku wartości
absorbancji przy dwóch długościach fali np. w maksimum i na stoku krzywej dla substancji
badanej i wzorcowej.
Metody te wynikają z prawa addytywności absorpcji. Każda „obca” substancja
będzie wpływać na kształt uzyskanego widma.
38
Badanie czystości substancji farmakopealnej
A274
=const
A264
A274
A284
39
=const
Badanie czystości substancji farmakopealnej
Badanie czystości kofeiny na podstawie danych Hewlett Packard
(A.J. Owen, „The diode-array advantage in UV/Visible spectroscopy”,
Hewlett-Packard Company, 1988)
40
Badanie czystości substancji farmakopealnej
Przykład badania czystości kofeiny
Sample
Ratio
λmax (274 nm)
λside (284 nm)
Abs.
Conc.
Abs.
Conc.
Abs.
Conc.
1
0.50757
10.1512
0.36751
10.1504
1.3811
1.0001
2
0.50761
10.1521
0.36772
10.1563
1.3804
0.9996
3
0.50751
10.1500
0.36749
10.1500
1.3810
1.0000
4
0.50745
10.1487
0.36772
10.1563
1.3809
0.9993
5
0.50777
10.1551
0.36768
10.1550
1.3810
1.0000
6
0.50725
10.1448
0.36732
10.1453
1.3809
1.0000
30
Mean
0.50714
0.50736
10.1426
10.1503
0.36734
0.36742
10.1458
10.1498
1.3809
1.3809
0.9997
0.9999
%RSD
0.039
0.039
0.041
0.041
0.035
0.035
41
λmax/λside
Badanie czystości substancji farmakopealnej
Natrii Paraaminosalicylas,
Sodu aminosalicylan FPVI, s. 524
4-Amino-2-hydroksybenzoesan sodu
Badanie obecności zanieczyszczeń : kwas 5-aminosalicylowy, 3-aminofenol
42
Badanie czystości substancji farmakopealnej
Kwas p-aminosalicylowy w środowisku kwaśnym ulega hydrolizie do 3-aminofenolu
FP VI, metoda
kolorymetryczna –
porównanie zabarwienia z
wzorcem
EP 6.0, FPVIII
metoda HPLC
3- aminofenol
Brak limitu
0,1%
Kwas 5-aminosalicylowy
Brak limitu
1,0%
43
Badanie czystości substancji farmakopealnej
265 nm
Sodu aminosalicylan,
roztwór w NaOH 4g/l,
c = 0,72 mg/100 ml ; 1 cm
299 nm
A (265 nm) = 0,681
A (299 nm) = 0,447
Widmo absorbcyjne wymagania FP VI
A 265
1,50
 1,56
A 299
A265 0,681
=
=1,52
A299 0,447
Wniosek: badany związek spełnia wymagania FP VI
44
Analiza ilościowa
Podstawowym prawem w metodach absorpcyjnych jest Prawo Lamberta-Beera.
Ilość światła absorbowana przez roztwór jest wykładniczą funkcją stężenia i grubości
warstwy.
I = I0·10- · c·l
A = k·c·l
45
Analiza ilościowa
Stosunek I/I0 jest miarą ilości światła przepuszczonego przez roztwór
Transmitancja
I/I0 = T
Absorbancja
-log (T) = A
Absorbancja wiązki promieniowania monochromatycznego przechodzącej przez jednorodny roztwór
jest wprost proporcjonalna do stężenia roztworu c, grubości warstwy absorbującej l, i współczynnika
k.
A = k·c·l
Wielkość k - jest to współczynnik proporcjonalności, który zależy od rodzaju substancji, oraz od
częstości światła padającego (długości fali). Jego wymiar (jednostka) zależy od sposobu wyrażania
stężenia roztworu i przyjmuje on postać absorbancji właściwej A11cm% , lub molowego współczynnika
absorpcji ε.
46
Analiza ilościowa
A = k·c·l
Jeżeli stężenie będzie wyrażone w mol/l to współczynnik nosi nazwę molowego
współczynnika absorpcji ε [mol-1 ·l ·cm-1]
 - jest to miara absorbancji roztworu o stężeniu mol/l znajdującego się w kiuwecie o
grubości warstwy 1 cm.
Jeżeli stężenie wyrazimy w % objętościowym [g/100cm3] to współczynnik k nosi nazwę
absorbancji właściwej
1%
1%
A 1cm lub a1cm
- jest to miara absorbancji roztworu o stężeniu 1% obj w kiuwecie o grubości
A1%
1cm
warstwy 1 cm.
47
Analiza ilościowa
Obliczenia w spektrofotometrii są względnie proste
Trzy metody postępowania
1. Molowy współczynnik absorbcji jest znany lub może być wyznaczony z roztworu standartowego.
A =  ∙c∙l
⇒
c = A/∙l
2. Z proporcji absorbancji roztworu o znanym (standart) i nieznanym stężeniu.
A bad
A st
=
⋅c bad⋅l
⋅c st⋅l
3. Z krzywej kalibracyjnej dla danego zakresu stężeń.
Y = f(c)
48

c bad =
A bad
A st
⋅c st
Analiza ilościowa
Odstępstwa od prawa Lamberta Beera
instrumentalne – związane z niedoskonałością przyrządów:
szerokość spektralna wiązki
nie monochromatyczność padającego promieniowania
powtarzalność nastawiania długości fali
nieliniowa odpowiedź detektora
chemiczne
reakcje w roztworze przy wzroście stężenia (kondensacja, polimeryzacja, hydroliza)
rozkład związku podczas analizy pod wpływem światła lub rozpuszczalnika
49
Przykłady obliczeniowe
Przykład 1 Odważkę substancji 1,7 mg rozpuszczono w metanolu w kolbie miarowej na 50 cm 3. Wykonano widmo w kiuwecie o grubości 1 cm, i otrzymano maks = 263 nm i A = 0,823. Obliczyć absorbancję właściwą. 0,0017g
w
50cm3
x
w
100cm3
x= 0,0034 g
c = 0,0034 [ g/100cm3 ] = 0,0034 [% obj]
a 1%
1cm =
0,823
=242,06
0,0034 ⋅1
50
Przykład 2
Badano zawartość substancji czynnej w tabletce. Średnia masa jednej tabletki wynosi 0,150g. Odważono 0,100g substancji i przeniesiono do kolby miarowej 50 cm3. Zmierzona absorbancja w λmaks wynosi 0,40. Obliczyć ilość substancji w tabletce jeżeli absorbancja właściwa substancji wynosi 400.
Z prawa Lamberta­Beera czyli 0,001g w
x1
c=
0,40
=0,001 [% obj ]
400 ⋅1
100cm3
w
50cm3
x1 = 0,0005g
0,0005g
w
0,100g (w odważce)
x2
w
0,150g (śred. masa tab.)
x2 = 0,00075g = 0,75mg
51
Przykład 3
Obliczyć absorbancję roztworu, który ma przepuszczalność T[%] = 89% przy λ= 400 nm.
%T = T × 100
T = 89/100 = 0,89
A = ­log(T)
A = ­log (0,89)
A = 0,051
52
Przykład 4
Roztwór kobaltu Co(H2O)2+ daje absorbancję A = 0,20 przy długości fali λ  = 530 nm, i grubości warstwy l=1cm. Wartość molowego współczynnika absorpcji wynosi  = 10 [L∙mol­1 ∙cm­1]. Obliczyć stężenie badanego roztworu.
A = ∙c∙l
⇒
c = A/∙l
c = 0,20/10∙1
c = 0,020 [mol/l]
53
Przykład 5
Absorbancja roztworu badanego (A bad) MnO4­ o nieznanym stężeniu wynosi 0,500 przy = 525 nm. W tych samych warunkach roztwór wzorcowy (Ast) MnO4­ o stężeniu 1,0×10­4 mol/l daje absorbancję Ast = 0,200. Obliczyć stężenie nieznanego roztworu.
Abadane
=
Astandart
A bad
⋅c badane⋅l
⋅c standart⋅l
=
Ast
c bad =
cbad =
0,500
c bad
c st
A bad
A st
−4
⋅c st
⋅1,0×10 =2,5×10
0,200
−4
mol /l
UWAGA: Ten sposób obliczania zawartości daje najbardziej poprawne wyniki kiedy stężenia roztworu
wzorcowego i badanego są zbliżone. Nie mamy pewności w jakim zakresie stężeń jest zależność liniowa.
54
6. Literatura:
1. R.M. Silverstrein, G.C. Bassler, „Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych”,
PWN, Warszawa 1970, rozdz. 5 s. 158
2. Robert M. Silverstein, Francis X. Webster, David J. Kiemle
Spektroskopowe metody identyfikacji związków organicznych,
PWN, 2007 r., ISBN: 978-83-01-15071-6, Wyd.II, zmienione
3. Zbigniew Kęcki, „Podstawy spektroskopii molekularnej”, PWN, Warszawa 1998,
rozdz. 5, s 162
4. Andrzej Cisak, „Chemiczna analiza instrumentalna”, Skrypt AM w Łodzi, 1996,
rozdz. 2.4 i 8.4, s. 25
5. A.J. Owen, „The diode-array advantage in UV/Visible spectroscopy”, Hewlett-Packard Company, 1988
6. Tadeusz W. Herman (red.), Farmacja fizyczna, PZWL, 1999, rozdz. 7, s. 368
7. Peter William Atkins, Podstawy chemii fizycznej, PWN 1999, rozdz. 15, s. 515
8. D.A. Skoog, D.M. West, F.J. Holler, S.R. Crouch,
Podstawy chemii analitycznej. T. 1-2 , PWN 2007, rozdz. 24
55
KONIEC
Dziękuję
UV radiation from the sun
NASA via http://sunearth.gsfc.nasa.gov/sunearthday/media_viewer/flash.html
56
Spektrofotometr dwuwiązkowy
schemat
57
Spektrofotometr Diode­array
58
Kuwety używane w spektrofotometrii
59
Kuwety używane w spektrofotometrii
Typ
Polystyrene
Methacrylate
Glass
Suprasil Quartz
Przepuszczalność
340-800 nm
280-800 nm
350-1000 nm
160-2500 nm
60
Prawa autorskie:
Udostępniony plik jest materiałem pomocniczym dla studentów 3 roku farmacji Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, do ćwiczeń z przedmiotu Chemia Leków.
Materiały te są własnością autora i nie mogą być publikowane bez jego zgody.
Wszystkie widma zostały wykonane w Zakładzie Chemii Farmaceutycznej i Analizy Leków UM na spektrofotometrze UV/VIS Lambda 25 firmy Perkin Elmer i
programie UVWinlab ver. 2.85.04.
61