Udział endoteliny-1, oksydazy NADPH, oksydazy ksantynowej i
Transkrypt
Udział endoteliny-1, oksydazy NADPH, oksydazy ksantynowej i
mgr Paulina Kleniewska Katedra Fizjologii Doświadczalnej i Klinicznej Zakład Fizjologii Układu Krążenia Uniwersytet Medyczny w Łodzi Streszczenie rozprawy doktorskiej pt. „Udział endoteliny 1, oksydazy NADPH, oksydazy ksantynowej i kinazy białkowej C w procesie powstawania reaktywnych form tlenu” Założenia Mechanizmy odpowiedzialne za wytwarzanie reaktywnych form tlenu (RFT) w komórkach pod wpływem działania endoteliny 1 (ET-1) w dalszym ciągu pozostają słabo poznane. Nadmierne stężenie ET-1 we krwi powoduje obkurczenie naczyń krwionośnych (łącząc się z receptorami ETA), wzrost ciśnienia tętniczego krwi oraz spadek przepływu krwi przez narządy wewnętrzne. Efekty te prowadzą do niedokrwienia narządów wewnętrznych, ich dysfunkcji i w konsekwencji do rozwoju stresu oksydacyjnego. Poznanie mechanizmów komórkowych działania endoteliny oraz procesów regulujących szlak sygnałowy endoteliny 1 daje możliwość wpływania na generowane przez nią RFT. Cel pracy Celem podjętych badań było: zbadanie wpływu dożylnie podanej ET-1 na tworzenie RTF w sercu i płucach na podstawie oznaczeń markerów stresu oksydacyjnego oraz stężenia TNF –α; zbadanie mechanizmu receptorowego działania ET-1 w narządach wewnętrznych szczura; zbadanie źródła powstawania RFT. Dodatkowym celem pracy była analiza ciśnienia tętniczego krwi skurczowego, rozkurczowego i średniego u zwierząt doświadczalnych. Materiały i metody Doświadczenia przeprowadzono na szczurach - samcach normotensyjnych szczepu Wistar-Kyoto, które podzielono na 10 grup: Grupa I (n = 6) – kontrolna, otrzymywała 0,9% roztwór NaCl (0,2 ml - w odstępach 30 minutowych) do żyły udowej; Grupie II (n = 6) – podawano 0,9% roztwór NaCl i po 30 min endotelinę 1 (ET-1) w dawce 3 µg/kg m. c. do żyły udowej; Grupa III (n = 6) – otrzymywała bloker receptorów endotelinowych ETA - BQ123 w dawce 1 mg/kg m. c. i po 30 min ET-1 (3 µg/kg m. c.) do żyły udowej; Grupie IV (n = 6) - podawano bloker receptorów endotelinowych ETB - BQ788 w dawce 3 mg/kg m. c. i po 30 min ET-1 (3 µg/kg m. c.) do żyły udowej; Grupa V (n = 6) - otrzymywała inhibitor oksydazy NADPH - apocyninę (apo) w dawce 5 mg/kg m. c. do żyły udowej; Grupie VI (n = 6) - podawano apocyninę (apo) w dawce 5 mg/kg m. c. i po 30 min ET-1 (3µg/kg m. c.) do żyły udowej; Grupa VII (n = 6) - otrzymywała inhibitor oksydazy ksantynowej - allopurinol w dawce 25 mg/kg m. c. i po 30 min ET-1 (3 µg/kg m. c.) do żyły udowej; Grupie VIII (n = 6) - podawano inhibitor syntazy tlenku azotu (L -NAME) w dawce 5 mg/kg m. c. i po 30 min ET-1 (3 µg/kg m. c.) do żyły udowej; Grupa IX (n = 6) - otrzymywała inhibitor kinazy białkowej C – chlorowodorek GF 109203X w dawce 85 μg/kg m. c. i po 30 min ET-1 (3 µg/kg m. c.) do żyły udowej; Grupie X (n = 6) - podawano inhibitor kinazy białkowej C specyficzny dla izoenzymów α i β1 - Go 6976 w dawce 2 μg/kg m. c. i po 30 min ET-1 (3 µg/kg m. c.) do żyły udowej; Każde doświadczenie trwało 5 godzin. W czasie eksperymentu monitorowano ciśnienie tętnicze krwi. Zwierzętom pobierano krew żylną - przed rozpoczęciem doświadczenia, po 60 minutach od podania badanego związku oraz po zakończeniu doświadczenia. Po 5 godz. trwania doświadczenia zwierzęta poddano eutanazji, następnie pobrano narządy wewnętrzne (serca i płuca) do dalszych badań. W pobranych narządach oznaczono markery stresu oksydacyjnego. Metodami spektrofotometrycznymi w homogenatach tkankowych oznaczono: ilość produktów reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS); stężenie nadtlenku wodoru (H2O2); stężenie glutationu całkowitego (GSHt), utlenionego (GSSG) i zredukowanego (GSH); stężenie wolnych grup sulfhydrylowych (–SH). W osoczu metodami spektrofotometrycznymi oznaczono: ilość zredukowanych jonów żelaza (FRAP) oraz stężenie TBARS. Metodą immunoenzymatyczną (ELISA) oznaczono w homogenatach tkankowych stężenie TNF –α. Dodatkowo w homogenatach tkankowych oznaczono stężenie białka całkowitego metodą Lowry’ego. Wnioski: Na podstawie uzyskanych wyników sformułowano następujące wnioski: 1. Endotelina 1 podana dożylnie stymuluje produkcję RFT oraz prozapalnej cytokiny TNF -α w sercu i płucach zwierząt doświadczalnych. 2. Stężenia: TBARS, H2O2, wolnych grup –SH, glutationu oraz TNF -α różnią się między narządami. Stężenia badanych markerów stresu oksydacyjnego w homogenatach serc są znacząco wyższe w porównaniu z homogenatami płuc. 3. Zdolność antyoksydacyjna mięśnia sercowego jest wyraźnie niższa niż płuc. 4. Powstawanie RFT w mięśniu sercowym i płucach odbywa się głównie za pośrednictwem receptorów ETA, ponieważ zablokowanie tych receptorów zmniejsza wytwarzanie RTF. 5. W mięśniu sercowym głównym źródłem powstawania RFT jest oksydaza NADPH. 6. W płucach głównym źródłem powstawania RFT jest syntaza tlenku azotu. 7. W badanych narządach w powstawaniu RFT bierze udział kinaza białkowa C (PKC). 8. W generowaniu RFT w sercu i płucach tylko częściowo uczestniczy oksydaza ksantynowa. 9. Endotelina 1 podana dożylnie wpływa na wzrost ciśnienia tętniczego krwi za pośrednictwem receptorów ETA, oksydazy NADPH oraz PKC.