Zastosowanie kolumn wypełnionych żywicą jonowymienną w

&ARM0RZEGL.AUK†
:ASTOSOWANIEKOLUMNWYPEŒNIONYCH˜YWIC’JONOWYMIENN’
WPREPARATYCEALKALOIDÌWPROTOBERBERYNOWYCH
WEKSTRAKTACHZBERBERYSUKRETEÊSKIEGO"ERBERIS#RETICA
2ESINCOLUMNSINANALYSISOFPROTOBERBERINEALKALOIDS
FROMDIFFERENTEXTRACTSOFCRETANBARBERRY"ERBERIS#RETICA
7IRGINIA+UKUŒA.EKTARIOS!LIGIANNIS!LEXIOS†,EANDROS3KALTSOUNIS+AZIMIERZ'ŒOWNIAK
+ATEDRAI:AKŒAD&ARMAKOGNOZJIZ0RACOWNI’2OuLIN,ECZNICZYCH5NIWERSYTET-EDYCZNYW,UBLINIE
$EPARTMENTOF0HARMACOGNOSYAND0HARMACEUTICAL#HEMISTRY
.ATIONALAND+APODISTRIAN5NIVERSITYOF!THENS'REECE
Streszczenie
Badania fitochemiczne ekstraktów roślinnych, będących
bogatymi mieszaninami ciał czynnych, wymagają wprowadzenia wielu metod rozdzielania oraz analizy zawartych w nich składników. Obecne w materiale roślinnym
chlorofile, cukry, czy tłuszcze często utrudniają przeprowadzenie analizy jakościowej bądź ilościowej. Występując w nadmiarze, substancje te zafałszowują obraz badań.
Wobec powyższego konieczne jest wprowadzenie do nowych technik chromatograficznych celem postępowania
laboratoryjnego szybkiej i łatwej metody rozdzielenia
substancji aktywnych od cukrów, tłuszczów oraz chlorofili.
W przeprowadzonej pracy użyto kolumny żywicowe jonowymienne do oczyszczenia ekstraktów pochodzących
z różnych części berberysu kreteńskiego (Berberis cretica) z nadmiaru cukrów. Jako cząsteczki polarne, stanowią
one przeszkodę w oznaczeniu alkaloidów protoberberynowych posiadających podobną polarność. Dotychczasowe doniesienia literaturowe traktują o wykorzystaniu tej
metody jedynie dla rozdzielenia flawonoidów.
Skuteczność metody sprawdzono, stosując technikę chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Procedura ta miała
na celu potwierdzenie, iż wraz z zastosowaniem kolumn
amberlitowych, skład jakościowy ekstraktów nie uległ
zmianie. Strata ciał czynnych – głównie z grupy alkaloidów protoberberynowych - byłaby wysoce niekorzystna. Warunkują one główne działania berberysu – między
innymi: przeciwmalaryczne, przeciwbólowe, przeciwbakteryjne, przeciwarytmiczne, żółciotwórcze czy przeciwdepresyjne. Niniejsza praca potwierdziła skuteczność
wprowadzonej metody oczyszczania. Dzięki zastosowaniu kolumn z żywicą jonowymienną otrzymano ekstrakt
pozbawiony cukrów bez istotnego wpływu na skład jakościowy pozostałych metabolitów wtórnych.
Słowa kluczowe: alkaloidy, berberys, chromatografia
cienkowarstwowa.
Summary
Phytochemical analysis of plant extracts, which are rich
mixtures of active compounds, employs different separative and analytical methods. Chlorofiles, sugars or fats
present in plant material make both the qualitative and
quantitaive analisis difficult. Being in excess, they falsify
the results. In that case it is advisable to introduce to analytical procedures a fast and easy method to separate the
active compounds from the disturbing agents.
Research presented in the current paper is focused on purification of extracts coming from different parts of Cretan
barberry (Berberis cretica) from excess sugars using resin
columns. Sugars, polar molecules, disturb in the analysis of protoberberine alkaloids, which are substances of
similar polarity. According to current research, amberlite
columns are commonly used in plants reach in flavonoids.
Separation of Cretan barberry’s extracts on resin columns
is the first trial. Efficacy of this method was controlled
using thin-layer chromatography – on TLC plates. The
procedure above was employed to check, whether there is
no loss in active compounds’ concentration after the separation on resin columns.
The propable loss of active constituents, mainly those belonging to protoberberine alkaloids, would be highly unfavourable. Just because they determine berberry’s properties: antimalarial, antibacterial, antiarrhytmic, cholagogic
or antidepressive.
Current study confirmed the efficacy of introduced method. Usage of resin columns helps to get rid of sugars without any significant difference in qualitative composition
of barberry’s extract.
Key words: alkaloids, barberry, ion-exchange resins, thin
layer chromatography.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
Wstęp
Metody oczyszczania próbek wykorzystują mechanizmy
adsorpcji, filtracji, sedymentacji, osmozy, utleniania, czy też
wymiany jonowej.
Do najbardziej popularnych należy adsorpcja zanieczyszczeń lub substancji niepożądanych na cząstkach
węgla aktywnego. Kolumny węglowe skutecznie usuwają
chlorofil z ekstraktów roślinnych. Należy jednak nadmienić, iż proces regeneracji złoża jest kosztowny. Rozwiązaniem powyższego problemu było wprowadzenie żywic
jonowymiennych. Możliwość łatwej modyfikacji ich powierzchni oraz porowatości wpływa na zwiększenie selektywności jonitu [1,2].
Żywice jonowymienne to nierozpuszczalne polimery,
które cechuje zdolność do wymiany jonów z roztworem –
anionów lub kationów. Posiadają one w swojej strukturze
grupy jonogenne, które wiążą określone składniki mieszaniny, uwalniając je pod wpływem zmiany pH eluentu [3].
Stosowane obecnie żywice mogą być pochodzenia naturalnego (zeolity, glaukonity, torf, celuloza, glinka czerwona,
węgiel) lub też syntetycznego (polimery styrenu, diwinylobenzenu, pirydyny, polietylenoimina, żywica fenolowoformaldehydowa). Tych ostatnich używa się na szerszą skalę
zarówno w przemyśle, jak i w laboratoriach analitycznych
[4,5].
Uformowane w postaci perełek syntetyczne jonity
pęcznieją po zanurzeniu w roztworze wodnym. Duża powierzchnia całkowita żywic warunkuje sprawną separację.
Żywice jonowymienne wykorzystuje się między innymi
podczas usuwania przeszkadzających jonów oraz trucizn
(np. dioksyn) z roztworów, zagęszczania próbek, koncentracji związków fenolowych, a także podczas ekstrakcji olejków eterycznych z ekstraktów roślinnych [6,7].
W przeprowadzonym badaniu wykorzystano właściwości jonowymienne żywic w celu wyeliminowania z ekstraktów roślinnych niepożądanych związków, jakimi są cukry.
Ponadto usiłowano sprawdzić, czy zastosowanie jonitów ma
wpływ na skład jakościowy ekstraktu.
Utrata składników mieszaniny razem z cukrami wiązałaby się ze zmianą aktywności rośliny. Szeroki wachlarz
alkaloidów – głównie z grupy pochodnych protoberberynowych – warunkuje silne działanie przeciwmalaryczne
ekstraktów z berberysu kreteńskiego. Ponadto w literaturze naukowej znaleźć można wiele prac na temat zastosowania berberyny – głównego alkaloidu berberysu – w lecznictwie. Właściwości przeciwzapalne, przeciwdepresyjne,
działanie hamujące rozwój choroby Alzheimera, właściwości bakteriobójcze oraz wirusobójcze to tylko niektóre
z jej działań [8,9].
Materiał i metody
W badaniu wykorzystano następujące ekstrakty
z berberysu kreteńskiego: ekstrakt metanolowy z ziela,
ekstrakt etanolowy z owocu, ekstrakt etanolowy z korzenia.
Ekstrakty rozwijano na płytkach chromatograficznych
pokrytych żelem krzemionkowym (Merck, TLC Silica gel
Ryc. 1. Chromatogram etanolowego ekstraktu z korzenia
berberysu kreteńskiego.
Ilustracja przedstawia dwie płytki TLC – lewą wywołaną
odczynnikiem wanilinowym oraz prawą – odczynnikiem
Dragendorffa (kolor żółty). Na chromatogramach zaznaczono następujące punkty:
1 oraz 4 – przedstawiający ekstrakt wodny otrzymany przez
rozdzielenie na kolumnie żywicowej, 2 oraz 5 – ekstrakt
wyjściowy - nie poddany zabiegowi oczyszczania na kolumnie żywicowej, 3 oraz 6 – ekstrakt otrzymany przez odmycie
metanolem zaadsorbowanych na kolumnie ciał czynnych.
60 F254). Kolumnę przygotowano z użyciem żywicy jonowymiennej Amberlite XAD 4 (0,5kg żywicy na 3g ekstraktu).
Jonit kondycjonowano na kolumnie szklanej, przemywając
go trzykrotnie wodą, a następnie trzykrotnie metanolem,
mieszając po każdym napełnieniu rozpuszczalnikiem. Następnie kolumnę przepłukiwano wodą, aby usunąć pozostałości metanolu.
Ekstrakty pochodzące z berberysu kreteńskiego (odważki po 5g) rozpuszczano w 500 ml wody destylowanej
i powoli dozowano na kolumnę. 0,5 dm3 bezbarwnego eluatu zebrano do kolby 1000ml i zatężono. Następnie kolumnę
przepłukiwano 800ml wody destylowanej i przesącz dołączono do zatężonej już próbki.
Zaadsorbowane na żywicy metabolity wtórne – alkaloidy – wymywano metanolem aż do uzyskania przezroczystej barwy eluatu (ok. 1,5 l). Brak ciał czynnych
w wycieku metanolowym sprawdzono metodą cienkowarstwowej chromatografii TLC. Uzyskane frakcje zagęszczono.
&ARM0RZEGL.AUK
Ryc. 2. Chromatogram metanolowego ekstraktu z ziela berberysu kreteńskiego.
Ilustracja przedstawia dwa chromatogramy – prawy wywołany odczynnikiem wanilinowym oraz lewy – odczynnikiem Dragendorffa. Na chromatogramach zaznaczono następujące punkty: 1 oraz 4 – ekstrakt wodny, 2 oraz
5 – ekstrakt wyjściowy, 3 oraz 6 – ekstrakt metanolowy.
1 oraz 2 wskazują na wysokie stężenie cukrów we frakcji
wodnej.
Pasma wyciągu wodnego wywołane odczynnikiem Dragendorffa (pasma nr 4, Ryc. 1. i Ryc. 2.) nie posiadają pomarańczowych plam. Świadczy to o braku alkaloidów w eluacie wodnym. Wobec powyższego, w wyniku oczyszczania
ekstraktów na kolumnach żywicowych nie zaobserwowano
utraty cennych ciał czynnych.
Frakcje nr 3 oraz 6 widoczne na ilustracjach 1 i 2 zawierają w swoim składzie znacznie mniej cukrów niż ekstrakt
wyjściowy. Potwierdza to założenia niniejszej pracy.
Płytki chromatograficzne przedstawiające rozdział ekstraktów pochodzących z owocu pokazują, iż zastosowana
metoda nie jest skuteczna w przypadku niealkaloidowych
ekstraktów berberysu. Wszystkie frakcje przedstawione na
płytce chromatograficznej TLC posiadają, w przypadku
owocu, podobny skład. Owoc berberysu jest jedyną częścią
rośliny, która nie zawiera w swoim składzie alkaloidów.
Przedstawiona metoda separacji cukrów od reszty ekstraktu zawierającego alkaloidy jest nową oraz łatwą techniką rozdzielania tych grup związków. Użyta po raz pierwszy
do badań nad alkaloidowymi ekstraktami berberysu żywica
jonowymienna Amberlite XAD 4 pozwala na szybkie i skuteczne pozbawienie badanych ekstraktów z cukrów, co potwierdziła metoda chromatografii cienkowarstwowej. Metoda ta może być zastosowana do rutynowego oczyszczania
ekstraktów roślinnych z zawartych w nich polisacharydów
w preparatyce fitochemicznej od towarzyszących im alkaloidów.
Wnioski
Wyniki badań
Otrzymane w przebiegu badań frakcje nakroplono
na płytki chromatografiiczne i rozwinięto w mieszaninie
metanolu oraz dichlorometanu: 20% MeOH: 80% DCM
w komorach pionowych wysycanych przez 15 minut przed
rozwinięciem płytek parami eluentu. Płytki rozwijano na
dystansie 8cm, ustalając linię startu na 1cm od krawędzi
płytki.
Sporządzono po dwie płytki z każdego wyciągu. Jedną z nich wywołano odczynnikiem wanilinowym, a drugą odczynnikiem Dragendorffa. Waniliną wizualizuje się
cukry, barwiące się na kolor ciemnobrązowy, natomiast
sole bizmutu zawarte w odczynniku Dragendorffa tworzą
pomarańczowoczerwone osady z alkaloidami. Wywołane
odczynnikiem Dragendorffa płytki chromatografii TLC pozwolą stwierdzić, czy w odrzuconej frakcji bogatej w cukry
nie tracone są również alkaloidy.
Zamieszczone ilustracje (Ryc. 1. oraz Ryc. 2.) przedstawiają otrzymane chromatogramy.
Dyskusja
Zamieszczone w niniejszej pracy zdjęcia płytek TLC pokazują, iż od ekstraktu pierwotnego, w wyniku przeprowadzonej separacji, zostały oddzielone cukry. Wyraźne ciemnobrązowe plamy widoczne w obrębie pasma nr 1 ilustracji
Opisana w niniejszej pracy technika rozdzielania chromatograficznego ekstraktów roślinnych z zastosowaniem
żywic jonowymiennych jest skuteczna w eliminacji nadmiaru cukrów z ekstrahowanego materiału. Zastosowana w
badaniu metoda chromatografii cienkowarstwowej potwierdziła, iż użycie kolumny wypełnionej jonitem nie powoduje obniżenia stężenia innych metabolitów wtórnych, co
potwierdzono na chromatogramach wywołanych odczynnikiem Dragendorffa.
Piśmiennictwo
1. Abburi K. Adsorption of phenol and p-chlorphenol from
their single and bisolute aqueous solutions on Amberlite
XAD-16 resin. J Haz Mat 2003; B105: 143-156.
2. Su-Hsia L, Ruey-Shin J. Adsorption of phenol and its
derivatives from water using synthetic resins and lowcost natural adsorbents:a review. J Env Man 2009; 90:
1336-1349.
3. Kocjan R. Chemia Analityczna. Tom 2. Analiza instrumentalna. PZWL 2002.
4. Lepane V. Comparison of XAD resins for the isolation of
humic substances from seawater. J Chromatogr A 1999;
845: 329-335.
5. Findeisen A i wsp. Analysis of diterpenoic compounds in
natural resins applied as binders in museum objects by
capillary electrophoresis. J Chromatogr A 2007; 1157:
454-461.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
6. Young K, Kuen-Chyr L. Removal of phenols from aqueous solution by XAD-4 resin. J Haz Mat 2000; B80:
59-68.
7. Matsumyia H i wsp. Sulfinylcalix[4]arene-impregnated
Amberlite XAD-7 resin for the separation of niobium (V)
from tantalum(V). J Chromatogr A 2005; 1090: 197-200.
8. Shmeller T, Latz-Broening B, Wink M. Biochemical
activities of berberine, palmatine and sanguinarine mediating chemical defence against microorganisms and
herbivores. Phytochemistry 1997; 44: 257-266.
9. Grycova L, Dostal J, Marek R. Quarternary protoberberine alkaloids. Phytochemistry 2007; 68: 150-175.
Adres do korespondencji:
prof. dr hab. Kazimierz Głowniak
Katedra i Zakład Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych
Uniwersytet Medyczny w Lublinie
ul. Chodźki 1, 20-093 Lublin
tel. +48 81 742 38 09
e-mail: [email protected]