(pieczęć) SPRAWOZDANIE O STANIE REALIZACJI ZADANIA z

...........................................
(pieczęć)
SPRAWOZDANIE O STANIE REALIZACJI ZADANIA
z wykonania badań podstawowych na rzecz postępu biologicznego w produkcji roślinnej
w 2012 roku
Nr decyzji MRiRW: HOR hn 078-44/12 zadanie nr 23
Nazwa tematu: Badania nad zdolnością do androgenezy u różnych genotypów żyta
Podmiot realizujący temat: Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, ul. Wojska Polskiego
28, 60-637 Poznań
4.
Wydział/Pracownia/ Pracownie: Wydział Rolnictwa i Bioinżynierii, Katedra Genetyki
i Hodowli Roślin, Zakład Genetyki Roślin
5.
Kierownik tematu (zgodnie z kartą tematu): prof. Zbigniew Broda
Wykonawcy: dr inż. Sylwia Mikołajczyk, dr inż. Dorota Weigt, mgr Grażyna Dominiczak
6.
Informacja o realizacji prac w roku 2012
a) Materiały i metody:
Materiał roślinny – androgeneza:
1.
2.
3.
Przedmiotem badań w kulturze pylników było 30 genotypów żyta. Wszystkie badane genotypy
charakteryzowały się diploidalną liczbą chromosomów i były formami ozimymi. Zestawienie
badanych genotypów znajduje się w tabeli 1.
Tabela 1.
Wykaz genotypów, z których izolowano pylniki w celu indukowania androgenezy i otrzymania
roślin DH.
L.p.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Danko Hodowla Roślin Sp. z o.o.
S0 3383/11
S0 3390/11
S0 3395/11
S0 3404/11
S0 3423/11
S 1032/11
S 1036/11
S 1039/11
S 1044/11
S 1050/11
S 1052/11
S 1059/11
S 1067/11
S 1071/11
S 1072/11
Poznańska Hodowla Roślin Sp. z o.o.
NS1/11
NS2/11
NS3/11
NS4/11
NS5/11
NS6/11
NS7/11
NS8/11
NS9/11
NS10/11
NS11/11
NS12/11
NS13/11
NS14/11
NS15/11
Materiał roślinny – krzyżowanie oddalone:
Przedmiotem badań w krzyżowaniach oddalonych z kukurydzą były odmiany żyta: Amilo i
Dańkowskie Złote oraz genotypy żyta dające negatywną odpowiedź w kulturze pylników – 14.
Jako zapylacze wykorzystano 3 odmiany kukurydzy: dwie cukrowe – Waza i Gucio, jedną
pastewną – Wilga (FAO 180), która jest najwcześniejszą z polskich odmian mieszańcowych.
Metodyka – androgeneza (kultura pylników in vitro):
Wzrost roślin donorowych do kultur pylników odbywał się w ogrodzie doświadczalnym Katedry
Genetyki i Hodowli Roślin Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu. Po osiągnięciu
odpowiedniej fazy rozwojowej kłosy z mikrosporami w stadium jednojądrowym ścinano i
traktowano temperaturą 4o C od 2 do 28 dni po uprzednim zanurzeniu w wodzie destylowanej.
Stadium rozwojowe mikrospor sprawdzano za pomocą preparatów rozgniatanych barwionych
metodą acetokarminową. Pylniki zawierające potencjalnie embriogenne mikrospory powinny
mieć długość 8 – 12 mm oraz zielone lub jasnozielone zabarwienie.
Losowo wybrane kwiatostany badanych roślin zawierające mikrospory w fazie
późnojednojądrowej odkażano powierzchniowo 70% alkoholem etylowym i poprzez zanurzenie
w 6% podchlorynie sodu (NaClO), a następnie płukano w dużej ilości wody sterylnej
destylowanej.
Z kłosów izolowano pylniki i umieszczano w płytkach Petriego o średnicy 10cm, zawierających
25 ml pożywki C17 do indukcji androgenezy (Wang i Chen, 1983). W każdej szalce umieszczano
kilkadziesiąt sztuk pylników pochodzących z jednego kłosa. Dla każdego z 30 badanych
genotypów wyłożono pylniki z 15 do 20 kłosów. Założone kultury pylnikowe prowadzono w
ciemności, w temperaturze 26oC – 28oC przez 8 – 12 tygodni w celu indukowania procesu
androgenezy.
Otrzymane po ośmiu tygodniach prowadzenia kultur pylników struktury kalusowe przenoszono
na pożywki: MS (Murashige i Skoog, 1962), MS+kinetyna (Murashige i Skoog, 1962) oraz 1902+kinetyna (Xingzhi i Han, 1984). Kalusy inkubowano w temperaturze 26oC i 16 godzinnym
fotoperiodzie przekładając na świeżą pożywkę regeneracyjną co 21 dni.
Metodyka – krzyżowanie oddalone (kultura zarodków in vitro):
Wzrost roślin odbywał się w warunkach szklarniowych. Z każdej z odmian żyta przygotowano 15
roślin do krzyżowań oddalonych oraz po 5 roślin z trzech odmian kukurydzy. Kłosy żyta w
kastrowano ręcznie na 3 do 5 dni przed rozpoczęciem pylenia, a nastepnie izolowano izolatorami
tomofanowymi umożliwiającymi obserwację dojrzewania znamion. Po osiągnięciu odpowiedniej
fazy rozwojowej na przygotowane kwiatostany nanoszono pędzelkiem pyłek kukurydzy i
ponownie izolowano. Następnego dnia po zapyleniu rośliny żyta podawano opryskowi roztworem
2,4-D o stężeniu 3mg/1litr wody.
Po 18 - 20 dniach zapylone pyłkiem kukurydzy kłosy ścinano i umieszczno na 48 godzin
w temperaturze 4oC. Następnie niedojrzałe ziarniaki odkażano powierzchniowo w 70% roztworze
etanolu – 30 sekund i w 5% roztworze podchlorynu sodu – 3 minuty. Materiał roślinny płukano
trzykrotnie w dużej ilości sterylnej wody destylowanej. Z ziarniaków preparowano pod
mikroskopem stereoskopowym zarodki i umieszczano na trzech pożywkach: MS (Murashige i
Skoog, 1962), White’a (Rangasaswamy, 1961) i N6 (Chu, 1978).
b) Szczegółowe omówienie wykonanych prac i uzyskanych wyników (łącznie dla
wszystkich Pracowni realizujących temat).
Androgeneza:
W trakcie realizacji zadania wyłożono w sumie 28.692 pylniki, w tym 14.396 z puli
materiałow PHR i 14.326 z genotypów DANKO. Liczba wyłożonych pylników mieściła się z
zakresie od 566 szt. (linia S1072/11) do 1.403 szt. (linia NS10/11). Liczby pylników poddanych
kulturze na pożywce indukującej androgenezę C17 przedstawiono dla poszczególnych genotypów
na wykresie 1 i 2.
Wykres 1. Liczba pylników poddanych kulturze in vitro z genotypów żyta (Secale cereale L.)
pochodzących z Poznańskiej Hodowli Roślin Sp. z o.o. w Tulcach k/Poznania.
Wykres 2. Liczba pylników poddanych kulturze in vitro z genotypów żyta (Secale cereale L.)
pochodzących z DANKO H.R. Sp.z o.o. w Choryni.
Przed założeniem kultur kłosy poddano stresowi termicznemu – działaniu temperaturą
4 C, które polegało na przechowywaniu ściętych kłosów w wiadrach z wodą destylowaną z w
chłodni. Średni czas działania temperatury dla genotypów z PHR wynosił 7,2 dnia, a dla linii
pochodzących z DANKO 10,1 dnia. Najkrócej przechowywano w chłodni kłosy genotypu
NS15/11 – średnio 2,6 dnia, a najdłużej S03404/11 – średnio 15 dni. Czas przechowywania
kłosów w chłodni dla 30 badanych genotypów przedstawiono na wykresach 3 i 4.
o
Wykres 3. Średni czas przechowywania kłosów w temperaturze 4oC z genotypów żyta (Secale
cereale L.) pochodzących z Poznańskiej Hodowli Roślin Sp. z o.o. w Tulcach k/Poznania.
Wykres 4. Średni czas przechowywania kłosów w temperaturze 4oC z genotypów żyta (Secale
cereale L.) pochodzących z DANKO H.R. Sp.z o.o. w Choryni.
Obserwacje kultur pylnikowych prowadzono od 6 do 12 tygodnia inkubacji kultur.
Indukcję kalusa zaobserwowano dla 16 z 30 testowanych genotypów. Najwyższą efektywność
tworzenia kalusa zaobserwowano dla pylników z genotypów NS9/11, NS11/11, S1044/11 i
S03404/11.
Kalusy otrzymane na pożywce indukującej androgenezę przenoszono na trzy pożywki
regeneracyjne (MS, MS+kinetyna, 190-2+kinetyna) w równych proporcjach. Powstające roślinki
pasażowano na pożywkę MS w kolbach Erlenmayera gdzie dalej rosły i ukorzeniały się. Obecnie
rośliny są w fazie ukorzenia się w doniczkach i przed jaryzacją.
W trakcie realizacji zadania stwierdzono, że badane w kulturze pylników genotypy
posiadają zróznicowane zdolności do androgenezy – od form nie reagujących (14 linii żyta) do
odpowiadajacych tworzeniem bardzo licznych kalusów i struktur zarodkopodobnych. Najwyższą
efektywność indukcji androgenezy zaobserwowano dla genotypu NS11/11 (12%) i NS9/11
(11,8%).
Zaobserwowano także, że wysoka efektywność tworzenia kalusa nie skutkuje wysokim
odsetkiem regeneracji roślin. W bieżącym roku sprawozdawczym otrzymano 13 zielonych
regenerantów.
Tabela 1
Efektywność indukcji kalusa i regeneracji roślin w kulturze pylników 30 badanych genotypów
żyta (Secale cereale L.).
L.p.
Genotyp
1
NS 1/11
(PHR)
NS 2/11
(PHR)
NS 3/11
(PHR)
NS 4/11
(PHR)
NS 5/11
(PHR)
NS 6/11
(PHR)
NS 7/11
(PHR)
NS 8/11
(PHR)
NS 9/11
(PHR)
NS 10/11
(PHR)
NS 11/11
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Średnia
liczba
dni
W 4 oC
11,2
Liczba zregenerowanych roślin
Pożywka
Pożywka
Pożywka
MS
MS+kinetyna
190-2
+kinetyna
1
1
0
Liczba
wyłożonych
pylników
Liczba
kalusów
1134
7
10,6
914
0
0
0
0
9,6
902
0
0
0
0
3,3
1158
0
0
0
0
8,4
952
9
0
0
1
6,9
879
0
0
0
0
3,0
903
0
0
0
0
14
1038
0
0
0
0
5,4
640
76
0
1
0
9,0
1403
1
0
0
0
6,3
1161
140
1
0
0
(PHR)
12
NS 12/11
(PHR)
13
NS 13/11
(PHR)
14
NS 14/11
(PHR)
15
NS 15/11
(PHR)
SUMA/ŚREDNIA
16
S0 3383/11
(DANKO)
17
S0 3390/11
(DANKO)
18
S0 3395/11
(DANKO)
19
S0 3404/11
(DANKO)
20
S0 3423/11
(DANKO)
21
S 1032/11
(DANKO)
22
S 1036/11
(DANKO)
23
S 1039/11
(DANKO)
24
S 1044/11
(DANKO)
25
S 1050/11
(DANKO)
26
S 1052/11
(DANKO)
27
S 1059/11
(DANKO)
28
S 1067/11
(DANKO)
29
S 1071/11
(DANKO)
30
S 1072/11
(DANKO)
SUMA/ŚREDNIA
5,0
728
0
0
0
0
5,0
1098
0
0
0
0
8,5
725
0
0
0
0
2,6
761
6
0
0
0
7,2
12,9
14.396
791
239
4
2
0
2
1
1
0
6,6
1320
0
0
0
0
6
1066
7
0
0
0
15
1152
18
1
0
0
3
1140
0
0
0
0
14
870
1
0
0
0
13,3
1153
0
0
0
0
12,7
804
2
0
0
0
5,1
1084
20
0
0
0
12,7
1053
14
1
0
0
8,6
680
15
3
0
0
12,4
1050
0
0
0
0
14,8
998
0
0
0
0
10,3
569
15
0
0
0
5
566
9
0
0
0
10,1
14.296
105
5
1
1
Krzyżowanie oddalone:
Z każdej z 15 roślin odmian żyta (Amilo i Dańkowskie Złote) wykastrowano i zapylono
po trzy kłosy z rośliny (każdy kłos zapylono inną odmianą kukurydzy). Pyłkiem kukurydzy
zapylono ogółem 6292 kwiatki żyta. W wyniku zapylenia pyłkiem kukurydzy otrzymano łącznie
42 zarodki, które sporadycznie osiągały stadium rozwojowe umożliwiające wykładanie na
pożywki regeneracyjne. Zarodki najczęściej obumierały pomiędzy 8 – 12 dniem od zapylenia, co
uniemożliwiało ich wykładanie na pożywki. Nieliczne zarodki, które osiągnęły odpowiednią
wielkość przenoszono do warunków in vitro. Dla odmiany Amilo na średnio 354,8 zapylonych
kwiatków otrzymano 2,2 zarodka, a dla odmiany Dańkowskie Złote na średnio 344,2 zapylonych
kwiatków powstało 2,4 zarodka. Na podstawie wstępnego rozpoznania metodycznego
stwierdzono, że wykorzystane odmiany kukurydzy posiadały podobną efektywność zapylania –
dla każdej z nich otrzymano od 13 do 15 zarodków.
Odmiana żyta
Amilo
Liczba kwiatków
Liczba zarodków
Liczba roślin
Odmiana żyta
Dańkowskie Złote
Liczba kwiatków
Liczba zarodków
Liczba roślin
MS
412
1
0
Gucio
White
358
3
0
MS
338
4
0
Gucio
White
368
3
0
Zapylacz – odmiany kukurydzy
Waza
N6
MS
White
N6
MS
324
406
380
310
294
2
2
1
4
2
0
0
0
0
0
Zapylacz – odmiany kukurydzy
Waza
N6
MS
White
N6
MS
374
360
324
330
378
2
1
3
2
1
0
0
0
0
0
Wilga
White
374
3
0
N6
336
2
0
Wilga
White
298
4
0
N6
328
2
0
Celem badań jest: określenie wybranych czynników decydujących o efektywności regeneracji
roślin w kulturach pylników. W związku z szerokim rozpoznaniem procesu androgenezy żyta
oraz występującymi nadal ograniczeniami w efektywności haploidyzacji tego gatunku w
bieżącym roku sprawozdawczym badania realizowano w kulturach pylników żyta oraz
krzyżowaniach oddalonych – żyto x kukurydza.
W trakcie realizacji tematu przeprowadzona została ocena zdolności do androgenezy w
powierzonych materiałach hodowlanych oraz oceniono możliwość wykorzystania krzyżowań
oddalonych w celu haploidyzacji żyta. Ze względu na niski odsetek zregenerowanych roślin z
kalusów otrzymanych na drodze androgenezy w bieżącym roku realizacji zadania zakres prac
poszerzono o testowanie pożywek regeneracyjnych.
Celem krzyżowania oddalonego jest w tym przypadku uzyskanie haploidów o
gametycznej liczbie chromosomów. Gatunek, który jest zapylaczem indukuje embriogeneze
haploidalną i otrzymanie roślin haploidalnych. Biorąc pod uwagę przesłanki metodyczne oraz
genotypowe uwarunkowania zdolności do regeneracji haploidów ważnym elementem postępu
badań nad haploidyzacją żyta, jest zaplanowane w bieżącym i kolejnym roku realizacji tematu
poszerzenie zakresu prac o indukowanie haploidów Secale cereale L. ssp. cereale w
krzyżowaniach oddalonych z kukurydzą. Krzyżowanie międzygatunkowe Secale cereale L. ssp.
cereale x Zea mays L. oraz eliminacja chromosomów u mieszańców mają za zadanie zwiększenie
wskaźnika frekwencji uzyskanych haploidów żyta szczególnie dla genotypów opornych na
haploidyzację drogą androgenezy – w kulturze pylników.
Harmonogram prac w bieżącym roku sprawozdawczym był realizowany w całości, zgodnie z
harmonogramem.
W jakim stopniu cel badania został osiągnięty:
W tym etapie badań rozpoznano genotypową efektywność tworzenia kalusa mikrosporowego w
pulach genowych materiałów roślinnych pochądzących z firm hodowlanych Danko H.R Choryń –
0,7% (maksymalnie 1,84%), a dla Poznańskiej Hodowli Roślin Tulce – 1,6% (maksymalnie –
12%). Wyniki te stanowią podstawę do badań metodycznych nad indukcją androgenezy w
kolejnej fazie, która dotyczy regeneracji roślin z kalusa mikrosporowego.
Z przetestowanych pożywek regeneracyjnych (MS, MS+kinetyna, 190-2+kinetyna) wybrano
pożywkę otymalną dla regeneracji roślin. Była to pożywka MS bez dodatku kinetyny, na której
otrzymano wzrost 7 roślin zielonych z 13 zregenerowanych ogółem.
W porównaniu z poprzedmin rokiem realizacji badań zaobserwowano regenerację roślin
zielonych, ale obniżeniu uległa efektywność indukcji androgenezy – tworzenie kalusa. W roku
2011 wynosiła ona w pulach genowych materiałów roślinnych pochodzących z firm hodowlanych
Danko H.R Choryń – 8,7% a dla Poznańskiej Hodowli Roślin Tulce – 3,6%, a roku 2012
odpowiednio 0,7% i 1,6%.
W bieżącym roku realizacji zadania zakres prac poszerzono o wstępne rozpoznanie możliwości
krzyżowania międzygatunkowego Secale cereale L. ssp. cereale x Zea mays L., w aspekcie
synchronizacji kwitnienia obu gatunków oraz doboru pożywek dla kultur zarodków
haploidalnych. Opracowano metodycznie technikę krzyżowania oraz izolacji zarodków w
różnych stadiach rozwojowych.
7.
Najważniejsze osiągnięcia.
 W procesie androgenezy żyta udoskonalono metodykę badań, szczególnie
zoptymalizowano wpływ stresu abiotycznego – termicznego dla utrzymania wysokiej
żywotności mikrospor w technice androgenezy opartej na kulturach pylnikowych.
 W stosunku do poprzedniego roku realizacji zadania podniesiono efektywność
regeneracji roślin (13 regenerantów), gdzie w roku 2011 nie otrzymano roślin.
 Przeprowadzono wstępne rozpoznanie możliwości krzyżowania międzygatunkowego
Secale cereale L. ssp. cereale x Zea mays L., w aspekcie synchronizacji kwitnienia
obu gatunków oraz doboru pożywek dla kultur zarodków mieszańcowych.
Opracowano metodycznie technikę krzyżowania.
 Wytypowano genotypy o wysokiej efektywności indukcji androgenezy:S02742/10,
S02258/10, S02514/10, 1273C, 1261B, 1291B, S1044/11, S03404/11, NS11/11,
NS9/11.
8.
Forma upowszechnienia wyników
Wyniki będą dostępne na specjalnej stronie internetowej: http://bip.up.poznan.pl
9.
Wykaz prac opublikowanych w roku sprawozdawczym dot. danego tematu:
Sylwia Mikołajczyk, Zbigniew Broda, Dorota Weigt (2012). The effect of cold
temperature on the viability of rye (Secale cereale L.) microspores. BioTechnologia
Journal of Biotechnology, Computational Biology and Bionanotechnology vol. 93(2): 8186.
10.
Wykaz prac złożonych do druku.
Zgłoszenie na Ogólnopolską konferencję Naukową pt. „Nauka dla Hodowli i
Nasiennictwa Roślin Uprawnych”. Zakopane 4 – 8 luty 2013. Plakat pt. „Zdolność do
androgenezy żyta a markery RAPD związane z odpowiedzią w kulturze pylników”.
11.
Przyczyny ewentualnych odstępstw od harmonogramu zapisanego w karcie realizacji
tematu.
nie dotyczy
12.
Informacja o wynikach współpracy naukowo-technicznej krajowej i z zagranicą (przy
współpracy z zagranicą podać kraj, firmę, temat).
nie dotyczy
13.
W przypadku udziału w konferencjach, sympozjach, szkoleniach i warsztatach itp., w
szczególności zagranicznych:
a) cel i korzyści oraz stopień wykorzystania do realizacji zadania:
 Wyjazd na Zjazd Hodowców Żyta miał na celu zapoznanie się z bieżącymi
problemami hodowli w/w gatunku, głównie hodowli heterozyjnej tego gatunku w
aspekcie realizowanego zadania i szczególnie dotyczył zagadnień związanych z
haploidyzacją żyta pod względem różnorodności genotypowej i reakcji na indukcję
embriogenezy haploidalnej – androgenezy. Różnorodność genotypowa ma bowiem
istotny wpływ na efektywność otrzymywania haploidów żyta.
 Udział w XIII Ogólnopolskiej Konferencji Kultur in vitro i Biotechnologii Roślin pt.
„Komórka roślinna obiektem manipulacji genetycznych i fizjologicznych” miał na
celu prezentację wyników otrzymanych w trakcie realizacji zadania.
b) w jaki sposób wyjazd podniósł wartość merytoryczną realizowanego zadania.
 Spotkanie z hodowcami w trakcie Zjazdu Hodowców Żyta umożliwia zapoznanie się
z bieżącymi problemami dotyczącymi hodowli w/w gatunku oraz pozwala na
planowanie ewentualnej korekty zaplanowanych celów realizowanego zadania i
modyfikację harmonogramu w kolejnych latach tak aby realizacja dotacji w pełni
odpowiadała potrzebom hodowli żyta.
 W wyniku udziału w XIII Ogólnopolskiej Konferencji Kultur in vitro i Biotechnologii
Roślin pt. „Komórka roślinna obiektem manipulacji genetycznych i fizjologicznych”
opublikowana została praca pt. „The effect of cold temperature on the viability of rye
(Secale cereale L.) microspores.”.
Data: 07 grudnia 2012 r.
………………………………………………….
Podpis kierownika tematu