Standardy w laboratoryjnej parazytologii medycznej

Standardy w laboratoryjnej parazytologii
medycznej
Danuta Grygierczyk
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 21 stycznia 2009r zmieniające
rozporządzenie w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów
diagnostycznych
Opracowano na podstawie publikacji Myjak i wsp. 2011
Kał
 Należy pobrać przed rozpoczęciem leczenia
 W przypadku antybiotykoterapii czy stosowania leków
przeciwpasożytniczych
(badanie kontrolne po leczeniu), po upływie 1- 3 tygodni od
zakończenia stosowania leków.
 Oddany do czystych pojemników z łopatką, nie może być
zanieczyszczony moczem, wodą czy glebą.
 Zaleca się pobranie z trzech różnych miejsc do 2/3 wysokości
pojemnika opisanego imieniem i nazwiskiem, datą i godz. pobrania
 Zaleca się 3x badanie kału w odstępach 2-3 dniowych, od
pacjentów powracających z tropiku 4x ( ostatnie po prowokacji
środkami czyszczącymi); przy podejrzeniu lambliozy lub amebozy
6x
 Postacie dojrzałe lub fragmenty helmintów należy umieścić w
pojemniku z solą fizjologiczną lub wodą i dostarczyć do
laboratorium w ciągu 24 godzin
 Pobrane próbki kału dostarczyć jak najszybciej od momentu
pobrania
- wodnisty kał do 30min.
- uformowany na obecność cyst/oocyst pierwotniaków do 72 godz.
Do czasu badania przechowywane i transportowane w temp. +4st. C –
+10st. C
Kał można utrwalać w SAF, PVA i formalinie do 5%

W badaniu makroskopowym określamy konsystencjęwodnisty, luźny, uformowany
obecność śluzu, krwi, postaci dorosłych lub fragmentów
pasożytów
W badaniu mikroskopowym robimy preparaty :
1. W soli fizjologicznej
2. Podbarwiony płynem Lugola 2-5%
3. Zagęszczony metodą sedymentacji i flotacji
4. Gruby wg Kato - Miura
5. Trwałe barwione
6. Założenie hodowli in vitro w kierunku E. histolytica sensu lato,
B. coli, Strongyloides, Ancylostoma, Trichostrongylus, test
wykluwania miracydiów (hatching test) na obecność żywych jaj
Schistosoma spp.
Ocena preparatów
 Rozmaz kału – 2mg w soli fizjologicznej; pow. obiektywu 20,40,60x
 Preparat gruby wg Kato i Miura przykryty celofanem w poszukiwaniu
oocyst Sarcocystis i Isospora
 Trwałe barwione – hematoksylina, trichrom, Ziehl-Neelsen, pod
imersją 100x
Wynik
Podana nazwa gatunkowa i postać rozwojowa pasożyta, czy jaja żywe
lub martwe Schistosoma,
Glisty jaja zapłodnione czy nie, orientacyjną liczbę form pasożytów :
mało poniżej 2/10 pola widzenia, średnio 3-9/10, dużo powyżej
10/10; inne struktury –makrofagi, krwinki czerwone, leukocyty
wieloróżnojądrzaste, kryształy Charcot-Leydena, włókna mięsne ,
kule tłuszczowe
 Wymaz okołoodbytniczy w kierunku E. vermicularis
Materiał pobrać przed leczeniem i ponownie 2-3 tygodni po
zakończeniu (kontrola).
Pobór rano przed myciem i oddaniem kału wg metody Halla (NIH),
Grahama pow. 20x – jaja lub dorosłe osobniki
Zaleca się wykonanie 5 przylepców u dzieci w tygodniu .
 Krew
Krew pobieramy przed rozpoczęciem leczenia:
- w przypadku podejrzenia malarii lub
babeszjozy bezzwłocznie, także przy
stosowaniu środków farmakologicznych
- w przypadku podejrzenia leiszmaniozy czy
filariozy, nie jest konieczne natychmiastowe
pobranie materiału
Z krwi włośniczkowej 2-3 rozmazy każdego rodzaju wykonane do
30min.,żylną do probówki na EDTA.
W przypadku nie wykrycia malarii w pierwszym badaniu, badanie
należy wykonywać co 6-8 godz. przez kolejne 3 dni; w przypadku
wiciowców tkankowych 1x przez 3 kolejne dni.
Przy filariozach należy pamiętać o cykliczności występowania
mikrofilarii we krwi- co 8-12 godz. przez 3 kolejne dni.
Badanie próbki krwi powinno obejmować:
 Rozmaz bezpośredni w soli fizjologicznej( ruch świdrowców i
mikrofilarii - obserwacja)
 Cienki rozmaz krwi – w kierunku wszystkich gatunków
pasożytów krwi
 Preparat grubej kropli – w kierunku malarii i filariozy
 Ocena parazytemii
 Koncentrację wg Knotta- gruba kropla w kierunku mikrofilarii,
łącznie z obliczeniem parazytemii
 Barwienie Giemzą, Wrighta, MGG, hematoksyliną z
eozyną(różnicowanie mikrofilarii)
 Preparaty oglądamy 100pw
Parazytemia – procent zarażonych krwinek lub liczba pasożytów w
1μl krwi, ewentualnie liczbę pasożytów na 200 leukocytów
(Plasmodium), liczbę mikrofilarii w 1ml krwi.
Poza badaniem mikroskopowym stosuje się :
 Zakładanie hodowli in vitro w kierunku Leishmania i
Trypanosoma cruzi
 Badanie w kierunku antygenów Plasmodium spp. oraz
Wuchereria bancrofti, Loa loa
 Badanie w celu wykrycia swoistych przeciwciał
 Badanie na obecność kwasów nukleinowych
Badanie materiału z układu moczowo-płciowego
Mocz jest materiałem używanym do wykrycia jaj Schistosoma
haematobium i trofozoitów Trichomonas vaginalis, jaj owsika
S. haematobium – mocz 200 ml ,kolekcjonowany miedzy 12.0015.00 , ewentualnie po wysiłku, przetrzymywany w chłonnym
pomieszczeniu (zapobiega wylęgowi miracydiów)
Wirowanie i wykonanie preparatu bezpośredniego – ocena jaj
(żywe czy martwe)
T. vaginalis – początkowy strumień moczu , odwirować i wykonać
preparat bezpośredni oraz trwały, barwiony Giemsą
Badanie materiału z dróg oddechowych
Stosuje się do wykrycia jaj Paragonimus spp., rzadziej larw
Strongyloides, Ancylostoma, Ascaris lumbricoides oraz Entamoeba
histolytica, czy Cryptosporidium spp.
Materiał: popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) lub plwocinę
pobraną rano, jak najszybciej dostarczyć do laboratorium. 3x
pobranie i badanie
Po odwirowaniu materiału należy wykonać preparat bezpośredni
Badanie aspiratów
 Płyn mózgowo- rdzeniowy – Trypanosoma spp.
Acanthamoeba spp., Naegleria fowleri, Toxoplasma gondii ;
materiał w ob. 5-10cm3 w jałowym pojemniku w 37st. C jak
najszybciej dostarczyć
 Treść dwunastnicza – Giardia intestinalis, Strongyloides
stercoralis, Fasciola hepatica, Cryptosporidium spp.; sonda
dwunastnicza ( w 37st.C jak najszybciej dostarczona, ph=7-9),
po odwirowaniu żółci preparat bezpośredni, rozmazy barwimy
Giemzą
 Z torbieli wątroby – na obecność skoleksów lub materiału
genetycznego
Echinococcus granulosus i E. multilocularis
Materiał uzyskany śródoperacyjnie , nie poleca się biopsji
cienkoigłowej (protoskoleksy w torbieli mogą się rozsiać)
Wykonanie badania do 6 godz., schłodzenie materiału 4+ - 10+ st.
C, płyn z torbieli odwirować i wykonać co najmniej 3 preparaty
bezpośrednie.
Do badań molekularnych materiał schłodzony, zamrożony lub
utrwalony w 70-96% alkoholu etyl. do 7 dni
 Materiał pobrany podczas rektoskopii lub z ropni wątroby/płuc
(Entamoeba histolytica, Balantidium coli)
Materiał ze zmian śluzówki lub ropni powinien być zmieszany z solą
fizjologiczną i badany bezpośrednio pod mikroskopem ; należy
wykonać preparat trwale barwiony (trichrom, hematoksylina),
utrwalony w etanolu lub zamrożony przesłany do badań
molekularnych
 Materiał z gruczołów limfatycznych, szpiku, śledziony
W kierunku ruchliwych postaci trypomastigota Trypanosoma spp.,
amastigota biopsja cienkoigłowa ze szpiku, śledziony w
zarażeniu Leishmania donovani
Wykonujemy rozmazy, utrwalić w metanolu i wybarwić Giemzą,
zabezpieczyć do badań molekularnych
Ze zmian skórnych lub odciskowy
Leiszmaniozy skórne lub śluzowo- skórne
Postacie amastigota wykryte w rozmazach, utrwalone, barwione
j.w. Wskazane założenie hodowli in vitro ( podłoże NNN)
Materiał tkankowy do badań histopatologicznych
Materiał stanowią:
 barwione lub nie preparaty mikroskopowe
 bloczki parafinowe
 utrwalony w formalinie
 utrwalony w alkoholu przeznaczony do badań molekularnych
barwienie hematoksyliną z eozyną ,
PAS ( E. multilocularis)
larwy włośnia z wycinka mięśnia naramiennego (0.5g)
wykrywamy met. kompresorową, trawienie trypsyną lub pepsyna
(sztuczny sok żołądkowy)
Diagnostyka laboratoryjna chorób odkleszczowych
( rekomendacje KIDL, NIZP- PZH, konsultanta Krajowego z chorób zakaźnych, Kliniki Chorób
Zakaźnych i Neuroinfekcji UM w Białymstoku)
 Badania mikroskopowe
krew pełna na EDTA (włośniczkowa z opuszki palca 3 lub 4, u dzieci
z pięty) do probówki z kapilarą (200-500µl) lub krew z żyły( 2ml), do
laboratorium w ciągu 2 godzin
Cienki i gruby rozmaz krwi zabarwiony Giemsą
Ocena 1cm2 rozmazu lub 300pól widzenia oraz ocena parazytemii
(w cienkim rozmazie 500 policzonych erytrocytów, w grubym liczba
pasożytów w 1µl krwi oraz białe krwinki ( 8000/1µl krwi)
Diagnostyka c.d.
 Badania serologicznewczesna faza 5-10ml krwi na skrzep, po 2 tygodniach druga próbka
krew przechowywana: świeża w temp. 50 C, do badań późniejszych w
zamrażalce, do transportu w -200C
Płyn mózgowo-rdzeniowy 1ml przechowywać w temp.pokojowej;
oznaczenia pciał w PMR powinny być wykonane równolegle z
oznaczeniami pciał w krwi
Test ELISA, RF( czynnik reumatoidalny)
Czynniki interferujące w badaniu: obecny w surowicy czynnik
reumatoidalny, swoiste dla antygenu pciała IgG, jony żelaza,
zanieczyszczenia bakteryjne, wielokrotne zamrażanie
Diagnostyka c.d.
 Badania metodą PCR
Krew pobrana na EDTA ( nie na heparynę) - 3ml , do 24godzin w
temp. pokojowej, dłuższy czas chłodnia
PMR 1-2ml w temp. chłodni ( 5st. C)
Wymazy z miejsc chorobowych wykonywać jałową bagietka ,
koniec zanurzyć w jałowym płynie soli fizjologicznej i
bezzwłocznie dostarczyć do laboratorium
Mocz 10-20ml pierwszy strumień po 2 godzinach od ostatniego
oddania moczu i bezzwłocznie dostarczony do laboratorium
BAL 1-2 ml dostarczyć zaraz po pobraniu
Wycinki tkanek 0,2 g do sterylnego pojemnika z jałowa solą
fizjologiczną , szybko dostarczyć