ĆWICZENIE XI

ĆWICZENIE XI
Temat I: Udział drobnoustrojów w obiegu węgla w przyrodzie cd.
Bakterie octowe:
"Fermentacja octowa" jako przykład niecałkowitego utleniania substratu. Niektóre heterotroficzne
drobnoustroje tlenowe zdobywają energię w procesach niecałkowitego utleniania substratu. Wytwarzane i
wydzielane do środowiska kwasy organiczne mogą stanowić (w zależności od drobnoustroju) produkt końcowy
lub czasem ulegać dalszemu (całkowitemu) utlenieniu do CO2.
Tego typu procesy mikrobiologiczne są wykorzystywane do produkcji określonych kwasów organicznych na
skalę przemysłową.
Szereg kwasów organicznych produkują w procesach niecałkowitego utleniania grzyby. Na przykład
Aspergillus niger utlenia glukozę do kwasu cytrynowego. Bakterie z rodzajów Acetobacter i Gluconobacter
utlenianą etanol do kwasu octowego ("fermentacja octowa") lub glukozę do kwasu glukonowego. Szczepy
Acetobacter utleniają powstający kwas octowy do CO2.
Hodowla bakterii octowych (Acetobecter lub Gluconobacter) została założona na pożywce płynnej w kolbkach
stożkowych (dla zapewnienia warunków tlenowych) i na płytkach Petriego na podłożu zestalonym agarem i
zawierającym węglan wapniowy. W celu demonstracji procesu "fermentacji octowej" pożywka powinna
zawierać etanol jako substrat energetyczny - może to być brzeczka niechmielona z dodatkiem 2-3% etanolu.
Nie wszystkie szczepy bakterii octowych rosną dobrze na takim podłożu. Stosuje się wówczas często pożywkę
zawierające glukozę jako źródło C i energii oraz ekstrakt drożdżowy jako źródło substancji wzrostowych.
Acetobecter - gramujemne pałeczki 0,6-0,8 x 1-4 µm, nieruchliwe lub urzęsione, ściśle tlenowe. Temperatura
optymalna 25-30°C. Chemoorganoheterotrofy. Wiele szczepów utlenia etanol do kwasu octowego.
Acetobecter wykorzystywany jest do produkcji octu.
Część praktyczna
a) obserwacja makroskopowa hodowli bakterii octowych na podłożu stałym z CaCO3
W hodowli na podłożu stałym z CaCO3 można zaobserwować przejaśnienia wokół kolonii wywołane kwasem
octowym produkowanym przez bakterie octowe, który rozpuszcza CaCO3.
Studenci wykonują rysunek stref rozpuszczania węglanu wapnia wokół kolonii bakterii fermentacji octowej
b) obserwacja mikroskopowa bakterii octowych w preparacie barwionym metodą Grama (pow. 1250x).
Studenci wykonują rysunek gramujemnych pałeczek bakterii fermentacji octowej.
Z hodowli należy pobrać materiał wyżarzoną ezą, wykonać na szkiełku podstawowym rozmaz, który po
utrwaleniu barwi się metodą Grama. Preparat obserwujemy pod powiększeniem 1250x i wykonujemy rysunek.
Temat II: Udział drobnoustrojów w obiegu azotu w przyrodzie c.d.
Drobnoustroje wolno żyjące wiążące azot cząsteczkowy - obserwacje makro i mikroskopowych
założonych hodowli.
1. Tlenowe drobnoustroje wolno żyjące wiążące azot cząsteczkowy:
Azotobacter - jest bakterią tlenową (gramujemną) wolno żyjącą wiążącą azot cząsteczkowy. W celu
odizolowania przedstawicieli rodzaju Azotobacter od innych drobnoustrojów glebowych i wyhodowania ich w
czystej kulturze, bądź też w kulturze wzbogaconej stosuje się pożywkę wybiórczą. Azotobacter jest
drobnoustrojem mogącym żyć i rozwijać w warunkach braku azotu związanego, odżywiającyym się wyłącznie
azotem cząsteczkowym. Pożywka wybiórcza dla Azotobactera jest pożywką bezazotową. Azotobacter tworzy
komórki duże, o charakterystycznym owalnym kształcie, występujące często w postaci dwoinek. W naszych
glebach występuje powszechnie Azotobacter chroococcum. Są to ruchliwe pałeczki o wymiarach 2-5 µm,
tlenowe, występujące często po dwie obok siebie. Starzejące się komórki tracą rzęski i przybierają bardziej
zaokrąglone kształty. Często otaczają się śluzem obejmującym kilka komórek, tworząc tzw. zoogleje chroniące
komórki bakteryjne przed niekorzystnym wpływem otoczenia, głównie przed wysychaniem. Stare komórki
Azotobactera w niesprzyjających dla niego warunkach środowiskowych zmniejszają nieco swoje wymiary,
otaczają się grubą błoną tworząc cysty. W starszych hodowlach przeważają formy spoczynkowe Azotobactera kuliste cysty. W tej postaci mogą przetrwać bardzo długi czas. W przypadku zaistnienia sprzyjających
warunków dla ich rozwoju, cysty kiełkują. Azotobacter chroococcum jest bakterią wymagającą w stosunku do
warunków środowiska. Oprócz dobrych warunków tlenowych wymaga odpowiedniego zasobu substancji
energetycznych. Odczyn środowiska nie może być kwaśny, gdyż Azotobacter chroococcum nie rozwija się przy
pH niższym niż 6.W naszych glebach można znaleźć szczepy Azotobactera, które mogą rozwijać się także i
przy niższych pH środowiska. Optymalną temperaturą dla rozwoju Azotobacter chroococcum jest 28-30°C,
maksymalną +45°C, a minimalną +4°C.
Azotobacter
Komórki wegetatywne i cysty
wg Kunicki-Goldfinger
Część praktyczna
a). obserwacja makroskopowa hodowli Azotobactera w pożywce płynnej i na podłożu stałym.
Obserwacja makroskopowa. Opisujemy charakter wzrostu Azotobactera na podłożu stałym i na pożywce
płynnej (w postaci kożuszka typowego dla tlenowców), jego konsystencję i zabarwienie, obecność na podłożu
stałym śluzów obecność lub brak w płynie hodowlanym pęcherzyków gazu. Występowanie pęcherzyków gazu
świadczy o rozwoju drobnoustrojów beztlenowych, znajdujących warunki do wzrostu w głębszych warstwach
pożywki wskutek zużywania tlenu przez Azotobactera i obecności kożuszka utrudniającego dostęp powietrza do
głębszych warstw płynu.
b). obserwacja mikroskopowa Azotobactera
W celu przygotowania preparatu w kropli płaskiej z żywych komórek, z hodowli na pożywce płynnej pobieramy
ezą odrobinę kożuszka pokrywającego pożywkę i rozprowadzamy ją w kropli wody umieszczonej na szkiełku
przedmiotowym. Po nałożeniu szkiełka nakrywkowego oglądamy preparat pod pow. 500x. Obrazy z pod
mikroskopu należy narysować.
Z hodowli na podłożu stałym przygotowujemy preparat barwiony negatywnie nigrozyną. Mikroskopujemy pod
pow. 1250x. Szukamy przede wszystkim dwoinek Azotobactera w otoczkach śluzowych. Rysujemy.
2. Beztlenowe drobnoustroje wolno żyjące wiążące azot cząsteczkowy:
W glebie znajdują się również bakterie wolno żyjące, wiążące azot atmosferyczny w warunkach beztlenowych,
należące do gatunku Clostridium.
Bakterie z rodzaju Clostridium - gramdodatnie laseczki 0,3-1,9x2-10 µm, ruchliwe lub nieruchliwe,
wytwarzające endospory. Bezwzględne beztlenowce, w niewielu przypadkach areotolerancyjne.
Chemoorganoheterotrofy. Metabolizm fermentacyjny chociaż niektóre szczepy (np. C. perfringens) mogą
przeprowadzać oddychanie azotanowe. Wśród laseczek Clostridium występują gatunki chorobotwórcze.
Clostridium wiąże niewiele bo około 2-3 mg azotu na 1 g zużytego źródła energii. Gdy usuwa się w
doświadczeniu laboratoryjnym tworzący się w wyniku fermentacji masłowej wodór, bakterie te są w stanie
związać około 6 mg azotu na 1 g cukru. Clostridium pasteurianum ma wymagania pokarmowe zbliżone do
wymagań Azotobactera. Wybiórczość pożywki polega na wyeliminowaniu związków azotu. Bardzo istotnym
elementem jest uniemożliwienie dostępu tlenu, gdyż Clostridium jest beztlenowcem bezwzględnym. O
obecności w hodowli Clostridium świadczy wytwarzanie gazu i zapach kwasu masłowego (produkty
fermentacji masłowej).
Beztlenowa laseczka Clostridium
wg Kunicki-Goldfinger
Część praktyczna
a). obserwacja makroskopowa hodowli wzbogaconej i naturalnej Clostridium pasteurianum
Obserwujemy rozerwanie jednolitego słupa gleby w hodowli spontanicznej (naturalnej) przez powstające w
procesie fermentacji gazy. Probówki z hodowlą wzbogaconą lekko wstrząsamy. Zwracamy uwagę na
wydzielanie się pęcherzyków gazu i zapach kwasu masłowego.
•
•
Wydzielanie się gazu (H2) świadczy o przeprowadzonej fermentacji (w hodowli spontanicznej
wydzielanie gazu jest tak silnie, że powoduje ono wypychanie gleby z probówki).
Ostry zapach kwasu masłowego z hodowli wzbogaconej świadczy o przeprowadzonej fermentacji
masłowej przez Clostridium pasteurianum.
b) obserwacja mikroskopowa Clostridium pasteurianum w kropli płaskiej z dodatkiem płynu Lugola
(preparat przygotowany z hodowli wzbogaconej) - pow. 500x
Pobieramy pipetą pasterowską kroplę z hodowli lub ezą osad ze ścianki probówki (znad powierzchni gleby) i
przenosimy na szkiełko przedmiotowe, następnie dodajemy kroplę płynu Lugola. Materiałem zapasowym w
komórkach Clostridium pasteurianum jest granuloza (cukier), która z płynem Lugola daje zabarwienie
granatowo - fioletowe.
Przy obserwacji (pow. 500x) zwracamy uwagę na charakterystyczne kształty komórek, obecność
przetrwalników oraz ruch. Wykonujemy rysunek spod mikroskopu .
II. Mikrobiologiczne przemiany związków azotu w glebie - założenie doświadczeń.
Dostające się do gleby resztki obumarłych roślin i zwierząt zawierają azot związany w białkach, kwasach
nukleinowych, lipoproteidach i innych związkach wchodzących w skład komórek. Te organiczne połączenia
azotu mogą być wykorzystywane przez drobnoustroje jako źródło węgla, azotu, a także jako substrat
energetyczny. Im wszechstronniej drobnoustroje wykorzystują daną substancję, tym proces minera1izacji
przebiega intensywniej. W procesie rozkładu organicznych związków azotu uwalniany jest, amoniak - forma
przyswajana przez rośliny i zbiałczana przez mikroflorę. Rozkład białek - proteo1iza - zachodzi zarówno w
warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Drobnoustroje zwane proteolitycznymi syntezują
zewnętrzkomórkowo enzymy hydrolityczne - proteazy, rozkładające białka do peptonów i polipeptydów. Pod
wpływem różnego typu peptydaz polipeptydy i peptydy ulegają rozkładowi do aminokwasów. Końcowe
produkty proteolizy - aminokwasy, podlegają dalszym przemianom mikrobiologicznym. Dezaminację
aminokwasów, prowadzącą do uwalniania amononiaku, nazywamy amonifikacją. Amonifikacja przebiega w
różny sposób w zależności od warunków środowiska i właściwości amonifikatorów, drobnoustrojów
przeprowadzających ten proces: Poza głównym produktem - amoniakiem, mogę powstawać różne kwasy
organiczne oraz alkohole, aldehydy, węglowodory, CO2. W czasie rozkładu aminokwasów zawierających
siarkę mogą powstawać merkaptany i siarkowodór. Drobnoustroje proteolityczne powszechnie występują w
przyrodzie. Należą do nich bakterie tlenowe z rodzajów Bacillus, Pseudomonas, Proteus, bakterie beztlenowe,
np Clostridium putrificum, C. sporogenes; promieniowce z rodzaju Streptomyces, Mycobacterium oraz grzyby
z rodzajów Aspergillus, Mucor, Oidium, Rhizopus.
Jak już wspomniano, drobnoustroje rozkładające białko nazywa się proteolitycznymi. Nie wszystkie jednak
drobnoustroje proteolityczne potrafią rozkładać białko aż do amoniaku. Z kolei te drobnoustroje, które w
wyniku rozkładu organicznej substancji azotowej wydzielają amoniak nazywa się amonifikatorami. Tak więc
nie wszystkie mikroorganizmy proteolityczne są amonifikatorami, jak również nie wszystkie amonifikatory
można zaliczyć do organizmów proteolitycznych, chociaż i takie spotyka się wśród nich. Często jest to swoiste
współdziałanie. Bakterie proteolityczne np. rozkładają białko do aminokwasów, które z kolei są dezaminowane
przez właściwe amonifikatory.
Do amonifikatorów można zaliczyć wiele różnych drobnoustrojów, a wśród nich bakterie, grzyby i
promieniowce. Wydajesię, że do najbardziej energicznych amonifikatorów należą bakterie tlenowe, beztlenowe
oraz tzw. względnie beztlenowe. Do beztlenowców można zaliczyć laseczki takich gatunków jak: Clostridium
sporogenes (dawna nazwa Bacillus sporogenes), Clostridium putrificum (Bacillus putrifrcus) i wiele innych. Z
grupy bakterii względnie beztlenowych jako silne amonifikatory znane są pałeczki z grupy: coli-aerogenes, a
więc przede wszystkim gatunek Escherichia coli i Aerobacter aerogenes - zaliczany obecnie do innego rodzaju
- Klebsiella. Prawdopodobnie najsilniejszym amonifikatorem jest jednakże względnie beztlenowa pałeczka
Proteus vulgaris. Wśród bakterii tlenowych do amonifikatorów zalicza się zarówno laseczki, jak i pałeczki, a
nawet niektóre ziarniaki. Do najbardziej znanych tlenowych amonifikatorów należą: Bacillus subtilis, Bacillus
cereus var. mycoides, Bacillus megaterium oraz pałeczki takie jak: Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
aeruginosa, Serratia marcescens i Halobacterium salinarium.
Do silnych amonifikatorów należą również bakterie mocznikowe. Rozkładają one mocznik dzięki zawartej w
ich komórkach ureazie. Do tej bardzo specyficznej grupy bakterii należą: Bacillus pasteurii (Urobacillus
pasteuri), Bacillus freudenreichii (Urobacillus freudenreichii), Sporosarcina ureae i wiele innych. Przy
rozkładzie mocznika uwolnionego z cyjanamidu jest czynny Bacillus pasteurii a przy amonifikacji chityny Pseudomonas chitinovora .
Uwalniany w czasie mineralizacji substancji organicznej oraz wprowadzany do gleby z nawozami
nieorganicznymi, amoniak jest formą azotu przyswajaną przez rośliny i drobnoustroje. Intensywność
mikrobiologicznego uwsteczniania jonów amonowych - zbiałczania zależy od warunków środowiska,
decydujących o aktywności mikroflory (stosunku C:N, temperatury, wilgotności, odczynu).
W glebie o dobrych stosunkach wodno-powietrznych jony amonowe są utleniane do azotanów przez bakterie
nitryfikacyjne. Proces ten zwany nitryfikacją jest dwufazowy. Pierwsza faza - nitrosofikacja - polega na
utlenieniu jonu amonowego do azotynów przez bakterie należące głównie do rodzaju Nitrosomonas,
Nirtosococcus:
NH4+ + 1,5O2 ----> NO2¯ + 2H+ + H2O + 275,88 · 103 J (66 kcal)
W drugie, fazie azotyny są utleniane do azotanów przez bakterie głównie z rodzaju Nitrobacter, Nirtosococcus,
NO2¯ + 0,5O2 ----> NO3¯ + 75,24 · 103 J (18 kcal)
Bakterie nitryfikacyjne są chemolitrofami. Uwolnioną w nitryfikacji energię wykorzystują do redukcji CO2. Są
to tlenowce, wrażliwe na zakwaszenie środowiska.
Azotany, wykorzystywane przez rośliny jako źródło azotu, są również zbiałczane przez niektóre drobnoustroje
glebowe. W glebie w warunkach beztlenowych azotany mogą ulegać denitryfikacij. Jest to proces redukcji
przeprowadzany przez bakterie względnie beztlenowe. Bakterie te wykorzystują jon azotanowy jako końcowy
akceptor wodoru w procesie utleniania związków organicznych lub nieorganicznych. Produkty denitryfikacji
całkowitej (N2O, N2) to formy azotu nieprzyswajalnego dla roślin i często ulatniające się z gleby. Jest to proces
rolniczo szkodliwy, który może prowadzić do strat azotu w glebie.
Zdolność do denitryfikacji wykazują liczne gatunki bakterii:
•
•
•
heterotrofy z rodzaju Pseudomonas, np. P. stutzeri, P. aeruginosa, P. fluorescens;
bezwzględny autotrof - Thiobacillus denitrificans, wykorzystujący tiosiarczany, siarczki i siarkę jako
substrat energetyczny
autotrof względny - Paracoccus denitrificans utleniajacy wodór cząsteczkowy do wody.
Część praktyczna
1. Założenie hodowli naturalnej drobnoustrojów hydrolizujących mocznik.
Każda para dodaje 2 cm3 1% roztworu mocznika (2% w stosunku do masy gleby) do probówki z 10 g
powietrznie suchej gleby. W celu dokładnego zwilżenia gleby, uzupełnić mieszaninę gleby i mocznika wodą.
Następnie włożyć do probówek papierek lakmusowy, umieszczając jeden jego koniec pod korkiem probówki.
Hodowle inkubować przez 7 dni w temp. 28o C
2. Założenie hodowli drobnoustrojów amonifikacyjnych w pożywkach płynnych z asparaginą i z asparaginą i
glukozą
a). pożywka z asparaginą (0,2 g/1l pożywki) jako jedynym związkiem organicznym (źródło C i N)
b). pożywka z asparaginą i glukozą (10 g/1l pożywki) w stężeniu 1 % (dodatkowe, łatwo przyswajalne źródło
węgla)
Każda para wysiewa po małej grudce gleby do 2 probówek z pożywkami (a i b) dla amonifikatorów.
3. Założenie hodowli autotroficznych bakterii nitryfikacyjnych (I fazy) w pożywce płynnej .
W celu stwierdzenia obecności nitryfikatorów w glebie, otrzymaną płynną pożywkę wybiórczą dla bakterii
przeprowadzających I fazę nitryfikacji szczepimy grudki gleby. Jako kontrolę pozostawiamy pożywkę jałową
(nie szczepiona glebą). Pożywkę stanowi roztwór soli mineralnych, zawierający siarczan amonu jako substrat
energetyczny i źródło azotu. O wybiórczości pożywki decyduje brak związków organicznych. Pożywkę rozlano
do probówek po 5 cm3 w celu zapewnienia warunków tlenowych. Aby utrzymać odczyn optymalny dla bakterii z
rodzaju Nitrosomonas (pH 7,5-8,0), po jałowieniu dodano do pożywki ok. 1% węglanu wapnia węglan wapnia
wyjałowiono oddzielnie. O obecności bakterii nitrosofikacyjnych w badanej glebie wnioskujemy pośrednio na
podstawie pojawienia się produktów ich działania - azotynów.
4. Założenie hodowli heterotroficznych bakterii denitryfikacyjnych w pożywce płynnej
Do hodowli bakterii cudzożywnych, przeprowadzających denitryfikację, stosujemy pożywkę zawierającą
roztwór soli mineralnych, KNO3 jako akceptor wodoru i octan sodu jako źródło węgla i substrat energetyczny.
pH pożywki doprowadzamy do 6. Pożywkę rozlewa się do probówek z rurkami Durhama Otrzymaną jałową
pożywkę szczepimy glebą. Jako kontrola pozostaje pożywka nie szczepiona. Inkubujemy 7 dni w temp. 28°C.