docANALIZA POLIMORFIZMU GENU 16S rRNA SZCZEP¬W
download 
Reklamacja Transkrypt
ANALIZA POLIMORFIZMU GENU 16S rRNA SZCZEP¬W
!.!,):!0/,)-/2&):-5'%.53R2.!3:#:%0¬7-9#/"!# 4%2)5-45"%2#5,/3)3#/-0,%8:79+/2:934!.)%-4%#(.) +)!2$2! !NALYSISOFPOLIMORPHISMOF3R2.!GENEINSTRAINSOF-YCO BACTERIUMTUBERCULOSISCOMPLEXBY!2$2!METHOD 2OBERT$7OJTYCZKA$ANUTA)DZIK-AGORZATA+ÃPA-ICHA7IECZOREK*ERZY0ACHA +ATEDRAI:AKAD-IKROBIOLOGII7YDZIAU&ARMACEUTYCZNEGOZ/DDZIAEM-EDYCYNY,ABORATORYJNEJW3OSNOWCU gLSKIEGO5NIWERSYTETU-EDYCZNEGOW+ATOWICACH Streszczenie W rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej, jedynie stwierdzenie obecności prątków w badanym materiale metodą hodowli potwierdza istnienie procesu chorobowego. Obecnie coraz częściej poszukuje się różnych technik molekularnych, które umożliwiłyby nie tylko identyfikację, ale także różnicowanie prątków w obrębie rodzaju. Celem badań było określenie przydatności techniki ARDRA do identyfikacji prątków gruźlicy i ich różnicowania wewnątrzgatunkowego. Badania przeprowadzono na 30 szczepach Mycobacterium tuberculosis complex z użyciem starterów opartych na genie 16S rRNA, oraz trzech enzymów restrykcyjnych: HindIII, EcoRI i HaeIII. Warunki reakcji dobrano doświadczalnie. Analizując otrzymane wyniki największą różnorodność w profilach restrykcyjnych uzyskano w przypadku enzymu HaeIII, mniejszą przy zastosowaniu enzymu EcoRI, a najsłabszą dla enzymu HindIII. Podsumowując, można stwierdzić, że technika ARDRA przy doborze szerokiego panelu różnych enzymów restrykcyjnych może stanowić skuteczne narzędzie diagnostyczne do identyfikacji szczepów Mycobacterium sp., oraz ich różnicowania. Summary: In routine microbiological diagnostics, detection of mycobacteria in examined material, through the cultivation, confirms morbidity. In our paper we tested usefulness of ARDRA for identification of tubercule bacilli and their differentiation inside species. Experiments were carried out with Mycobacterium tuberculosis complex and starters based on 16S rRNA and 3 restriction enzymes HindIII, EcoRI and well as HaeIII. Reaction conditions were got experimentally. It was observed that restriction profiles were most diverse when HaeIII was used and the most weak for Hind III. So we showed that ARDRA can be a useful diagnostic tool for identification of Mycobacterium as well as their species differentiation. Key words: ARDRA, Mycobacterium tuberculosis complex, 16sRNA Słowa kluczowe: ARDRA, Mycobacterium tuberculosis complex, 16sRNA &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO )33. kU¤°°U ' Ö Gruźlica to jedna z najstarszych chorób poznanych przez człowieka, która nadal odpowiedzialna jest za miliony zgonów każdego roku. W rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej, jedynie stwierdzenie obecności prątków w badanym materiale metodą hodowli potwierdza istnienie procesu chorobowego. Dlatego coraz częściej poszukuje się innych technik m. In. molekularnych, które umożliwiłyby nie tylko identyfikację, ale także umożliwiałyby różnicowanie prątków w obrębie rodzaju [1]. W chwili obecnej diagnostykę molekularną szczepów Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), opiera się głownie, na wykorzystaniu techniki PCR z zastosowaniem fragmentu insercyjnego IS6110 lub fragmentu genu gyrB jako miejsca docelowego do przyłączenia starterów. Technika ta, choć skuteczna do identyfikacji kompleksu MTC jako czynnika etiologicznego przebiegającego procesu chorobowego, nie nadaje się do różnicowania szczepów w obrębie MTC lub w badaniach epidemiologicznych [2,3]. Taką zaletę posiada technika ARDRA (amplified rDNA restriction analysis), która opiera się na amplifikacji fragmentu genu 16S rRNA a następnie na wykorzystaniu enzymów restrykcyjnych do otrzymania profili restrykcyjnych danego gatunku. Następnie porównując otrzymane profile z profilami referencyjnymi gromadzonymi w bibliotece (library of ARDRA profiles) można precyzyjne i z wysoką czułością przeprowadzić skuteczna identyfikację [3]. Rq7-J-Í Celem badań było określenie przydatności techniki ARDRA do identyfikacji prątków gruźlicy i ich różnicowania wewnątrzgatunkowego przy użyciu starterów opartych na genie 16S rRNA. R |J¬p-7-J-Í Badania przeprowadzono na 30 szczepach Mycobacterium tuberculosis complex z użyciem starterów opartych na genie 16S rRNA, MBUZ 1 5’- GAC GAA CGC TGG CGG CGT GTC TAA C – 3’ MBUZ 2 5’ – CGT CCC AAT CGC CGA TC – 3’, które dają produkt amplifikacji o wielkości około 1500 pz. Amplifikację prowadzono przy użyciu termostabilnej polimerazy HOT STAR Taq Polymerase (QIAGEN) wg następującego profilu temperaturowego: 0 wstępna denaturacja 95 C – 15 minut 3 cykle 0 C – 1 minuta94 denaturacja 0 przyłączanie C – 2 minutystarterów 55 0 wydłużanie starterów 72 C – 1 minuta następnie 0 denaturacja 94 C – 20 sekund 0 przyłączanie C – 1 minutastarterów 55 0 C – 1 minuta wydłużanie starterów 72 COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO )33. Po zakończeniu reakcji PCR dokonano detekcji produktów amplifikacji stosując elektroforezę w 1,5% żelu agarozowym. W kolejnym etapie badań przeprowadzono cięcie amplimeru przy użyciu trzech enzymów restrykcyjnych: HindIII, EcoR1 i HaeIII oraz doświadczalnie dobranych warunków reakcji. '¬ylpl7-J-ÍlJ¬p¥o-ª¬ylp}ª Obecność amplimeru w postaci widocznego prążka o długości około 1460 pz. stwierdzono u 30 izolatów DNA poddanych reakcji PCR (ryc.1). W wyniku cięcia amplimerów enzymem restrykcyjnym HaeIII otrzymano 5 profili restrykcyjnych 1 profil – obecność prążków o wielkościach 391 pz, 207 pz i 198 pz 2 profil – 391 pz i 198 pz 3 profil – 198 pz 4 profil – 391 pz i 207 pz 5 profil – brak cięcia (ryc.2) Analizując próbki pocięte enzymem EcoRI także otrzymano 5 profili restrykcyjnych 1 profil – 839 pz, 625 pz i 564 pz 2 profil – 839 pz i 625 pz 3 profil – 625 pz 4 profil – 564 pz 5 profil – brak cięcia (ryc. 3) W przypadku enzymu Hind II nie stwierdzono miejsca uchwytu enzymu w sekwencji amplimeru. Cięcie enzymami HaeII i Eco RI umożliwiło podział badanych próbek na 5 grup. Jednak zestawienie wyników badań obu enzymów razem (Tabela I) pozwoliło na uzyskanie 12 różnych profili restrykcyjnych w obrębie 30 badanych szczepów, co może świadczyć o możliwości użycia techniki ARDRA do identyfikacji i różnicowania szczepów w obrębie rodzaju Mycobacterium. ¬p¥oPokrewieństwo niektórych gatunków z rodzaju Mycobacterium jest bardzo wysokie i niekiedy sięga wartości 99%. Dlatego też konwencjonalne metody badań prątków takie jak badania mikroskopowe i hodowlane, okazują się zupełnie nieprzydatne do ich różnicowania. Z tego też względu ciągle trwają badania nad prostą, szybką i skuteczną techniką molekularną służącą do identyfikacji i różnicowania różnych gatunków z rodzaju Mycobacterium. Takie możliwości może dawać metoda ARDRA. Jest to metoda na tyle prosta (składa się z dwóch głównych etapów – amplifikacji i cięcia enzymami restrykcyjnymi), że daje możliwości zastosowania jej także w mało wyspecjalizowanych laboratoriach. W badaniach prowadzonych przez Baerra i Mendorca przebadano 3500 próbek klinicznych, w których w 151 przypadkach wykryto obecność drobnoustrojów z rodzaju Mycobacterium a tylko 3 nie udało się zidentyfikować. Związane to było z obecnością bardzo rzadkich gatunków, &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY kU¤°°U ¬A'¬ylpl-uql]p-Aol®¥¸¬AlRu - R}ª#® l#+¤}7plk°u-pR których profile restrykcyjne nie zostały jeszcze umieszczone w bibliotece [4]. Dokładność metody ARDRA rośnie wraz z ilością użytych enzymów restrykcyjnych do analizy. Potwierdzają to przeprowadzone badania gdzie w przypadku użycia pojedynczych enzymów uzyskano jedynie 5 profili restrykcyjnych, a w przypadku ich kombinacji już 12 różnych profili restrykcyjnych. Użycie jednak zbyt wielkiej liczby enzymów może skomplikować analizę i wydłużyć czas badania, dlatego optymalne wydaje się użycie 3 – 4 enzymów. W badaniach Vanehouette i Beenhower zastosowano zestaw 3 enzymów restrykcyjnych: CfoI, MboI i RsaI. Już po użyciu CfoI i MboI badacze byli w stanie zidentyfikować 18 z 21 badanych szczepów [5]. W przypadku użycia 4 innych enzymów, takich jak: HhaI, MboI, RsaI, BstUI, Baera i Mendroc sklasyfikowali 33 z 51 ¬A ¤ |®J®l-t RqRp |\|R ¬A®y¬ |J¥p }ª AlÖAl- Ry®¬k uRuR ¬pA¬oy¬u-R}7plk^GGk°G badanych szczepów wzorcowych a pozostałe podzielili na kilka grup o wysokim stopniu pokrewieństwa [4]. W prowadzonych badaniach ważny wydaje się także fragment DNA poddawany analizie restrykcyjnej. Metody oparte na analizie regionu genu 16SrRNA wydają się bardzo skuteczne, gdyż już do tej pory dostarczyły bardzo wielu informacji na temat systematyki rodzaju Mycobacterium. Metody te są obecnie szeroko akceptowane i traktowane jako szybki i dokładny sposób identyfikacji nie tylko rodzaju Mycobacterium, ale i innych rodzajów. Należy jednak pamiętać, że mimo wysokiej skuteczności tej metody nie wszystkie gatunki można nią zróżnicować. Duże trudności spotkano w różnicowaniu szczepów Mycobacterium kansasi od Mycobacterium gastri, Mycobacterium malmoense od Mycobacterium szulgai, Mycobacterium marinum od Mycobacterium ulcerans, oraz wśród gatunków należących do Mycobacterium tuberculosis complex (MTC). Związane to jest z wysokim podobieństwem w sekwencji 16S rRNA pomiędzy tymi gatunkami [6]. Można to jednak rozwiązać wprowadzając np. analizę regio¬A¡ |®J®l-t RqRp |\|R ¬A®y¬ |J¥p }ª AlÖAl- Ry®¬uRu R ¬pA¬oy¬u A| nu leżącego pomiędzy genami }7plkzGGk¤°G 16S i 23S rRNA co przykłado- &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO )33. kU¤°°U ¥uR}7pl ¤ ¡ ` ^ U z ° ¤ ¡ ` ^ U z ¤° ¤ ¤¤ ¤¡ ¤` ¤^ ¤ ¤ ¤U ¤z ¡° t¥a|²É\-auRy }ªR ¬pA¬oy¬Ai¥®¬p-y¬Ai t¥a|²É\-auRy }ªR ¬pA¬oy¬Ai¥®¬p-y¬Ai ªª¬ylp¥AlÖAl-Ry®¬uRu-R ªª¬ylp¥AlÖAl-Ry®¬uRuA| ¡z® ¤°® zU® 7-p U¡z® ¤^® ^`® 7-p "-7Rq-|]qRR ¬pA¬oyR¥®¬p-yRªª¬ylp¥AlÖAl--uqluR¥Ry®¬u-ul-RlA| wo precyzyjnie różnicuje szczepy MTC od Mycobactreium avium [7]. Podsumowując uzyskane wyniki badań oraz doniesienia literaturowe, mimo dynamicznego rozwoju różnych technik molekularnych bardziej precyzyjnych od metody ARDRA, to zautomatyzowana hodowla w połączeniu z ta techniką ciągle wydaje się być atrakcyjnym narzędziem do identyfikacji mykobakterii. -De Baerze T. e tion analysis (ARDRA) for the identification of cultured mycobacteria in a diagnostic laboratory. BMC Microbiol. 2002 2, 4. 5. Vaneechouette M., et all Mycobacterium species using amplified ribosomal DNA restriction analysis. J. Clin. Microbiol. 1993, 8, 2061-2065. -Kasai H. Ezak 6. geneticaly related slowly growing Mycobactera by their gyrB sequences. J. Clin. Microbiol. 2000, 1, 301 – 308. 7. Sansila A., et al. Differentiatio Mycobacterium Piśmiennictwo tuberculosis and Mycobacterium avium by amplification of the – 23Siribosomal DNA spacer. J. Clin. Micro1. Zalewska N. 16S Gruźlica mykobakteriozy – diagnostyka biol. 1998, 8, 2399 – 2403 laboratoryjna. Centrum diagnostyki i terapii AIDS. Wojewódzki Szpital Zakaźny, Warszawa, 1999. 2. Niemann Mycobac-S. et al. Differentiation of clinical terium tuberculosis complex isolated by gyrB DNA sequence polymorphism analysis. J. Clin. Microbiol. 2000, 38, 3231-3234. 3. -Wojtyczka R.D. et al. PCR-RFLP analysis of a point mu tation in codons 315 and 463 of the katG gene of Mycobacterium tuberculosis isolated from patients in Silesia, Poland. Pol. J. Microbiol. 2004, 53, 89-93. COPYRIGHT'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO )33. 4. &ARMACEUTYCZNY 0RZEGLD.AUKOWY
