BIOLOGIA OSADU CZYNNEGO – biotechnologia środowiska II0

Ćwiczenie 1
BIOLOGIA OSADU CZYNNEGO – biotechnologia środowiska II0
Wpływ substancji toksycznych na aktywności dehydrogenaz osadu czynnego.
Wprowadzenie
Proces biologicznego oczyszczania ścieków polega na sorpcji cząsteczek związków rozpuszczonych w ściekach na powierzchni
kłaczków osadu czynnego, dyfuzji do wnętrza komórek bakteryjnych oraz utlenieniu wchłoniętych przez komórkę związków i
usuwaniu produktów przemiany materii. O szybkości przemian biochemicznych w osadzie czynnym decydują nie tylko warunki
środowiskowe, ale także skład morfologiczny i ilośd biomasy mikroorganizmów. Oczyszczanie jest możliwe jeżeli zapewnimy
mikroorganizmom odpowiednią ilośd substratów, które są źródłem C:N:P oraz innych makro i mikroelementów, a proces
prowadzimy w warunkach tlenowych przy pH 6 - 8.
Oddychanie bakterii osadu czynnego może przebiegad drogą klasycznego łaocucha oddechowego. Procesowi temu towarzyszy
powstanie dużej ilości energii. Zachodzące przy oczyszczaniu ścieków osadem czynnym biochemiczne utlenianie związków
organicznych polega na ich odwodorowaniu (dehydrogenacji). W procesie tym odszczepione od substratu atomy wodoru
przenoszone są na tlen z wytworzeniem produktów w postaci H 2O lub H2O2. Łaocuch oddechowy oraz proces utleniania
biologicznego sprzężone są w komórce z fosforylacją oksydacyjną, tj. syntezą związków wysokoenergetycznych typu ATP. W
pierwszej fazie odwodorowania, katalizowanej przez dehydrogenazy osadu czynnego, zaktywowane atomy wodoru przenoszone
są kolejno przez odpowiednie kodehydrogenazy, nukleotyd dwufosfopirydynowy (DPN) i dwunukleotyd flawoadeninowy (FADN).
Druga faza odwodorowania polega na aktywizacji ostatecznego akceptora – tlenu atmosferycznego do tlenu aktywnego. Reakcja
katalizowana jest przez oksydazę cytochromową, współpracującą z cytochromami, złożonymi białkami zawierającymi grupy
czynne w postaci żelazoporfiryn. Cytochromy, przez odwracalny proces oksydacyjno-redukcyjny żelaza grup
żelazoporfirynowych, mają zdolnośd przenoszenia elektronów z odszczepionych atomów wodoru na zaktywowany atom tlenu,
czemu towarzyszy powstawanie cząsteczki wody
+
22H + O → H2O
Na efektywnośd biologicznego utleniania związków organicznych w ściekach ma wpływ rodzaj dostępnego substratu. W ściekach
komunalnych można wyróżnid związki organiczne rozpuszczone oraz w formie zawiesin. Związki organiczne występujące w
postaci rozpuszczonej dzieli się na bardzo łatwo, łatwo oraz trudno rozkładalne. Frakcję nierozpuszczalną (zawiesiny) można
podzielid na łatwo i trudno rozkładalną. Przyjmuje się, że frakcje bardzo łatwo i łatwo rozkładalna składają się z substancji, które
mogą byd bezpośrednio adsorbowane przez mikroorganizmy i metabolizowane dla potrzeb syntezy i pozyskiwania energii.
Natomiast frakcja trudno rozkładalna wymaga rozbicie przez enzymy zewnątrzkomórkowe przed adsorpcję i wykorzystaniem
przez mikroorganizmy.
Aktywnośd dehydrogenaz może służyd jako wskaźnik aktywności mikroorganizmów osadu czynnego. Aktywnośd dehydrogenaz
jest zależna od rodzaju mikroorganizmów, ich fazy wzrostu i żywotności oraz składu fizyko-chemicznego ścieków, a także od
obciążenia osadu ładunkiem zanieczyszczeo. W celu wykonania oznaczenia konieczne jest rozbicie kłaczków osadu ze względu na
zlokalizowanie enzymów łaocucha oddechowego.
Metoda spektrofotometryczna z chlorkiem trójfenylotetrazoliowym (TTC) służy do kontroli procesu oczyszczania ścieków
metodą osadu czynnego. Badanie to jest szczególnie konieczne w przypadku oczyszczania ścieków zawierających szereg
związków toksycznych, inhibitorów reakcji biochemicznych. Metoda oznaczania dehydrogenaz służy do oceny aktywności
biochemicznej mikroorganizmów w procesach utleniania związków organicznych. Oznaczanie tych enzymów stosuje się do
kontroli prawidłowości przebiegu procesu oczyszczania ścieków oraz określania stopnia adaptacji osadu czynnego do ścieków
przemysłowych. W przypadkach pogarszania się efektu oczyszczania ścieków, pomiar aktywności dehydrogenaz daje podstawę
do wprowadzania zmian parametrów technicznych. Czynnikami przeszkadzającymi w oznaczaniu są światło i tlen.
Metoda spektrofotometryczna z TTC (PN-82 C-04616.08)
Oznaczenie aktywności dehydrogenaz w osadzie czynnym polega na pomiarze ilości trójfenyloformazanu (TF) wytworzonego z
chlorku trójfenylotetrazoliowego (TTC). Aktywnośd dehydrogenaz przejawia się w procesie odwodornienia substratu – glukozy,
dodanego do próbki osadu czynnego i przeniesienia wodoru na bezbarwny związek biologicznie czynny TTC, który ulega redukcji
do TF o zabarwieniu czerwonym. Reakcja odwodornienia glukozy przez dehydrogenazy zachodzi podczas inkubacji odtlenionych
próbek w określonym czasie, temperaturze i odczynie. Intensywnośd zabarwienia zależy od ilości wytworzonego formazanu i jest
proporcjonalna do aktywności enzymatycznej mikroorganizmów. TF zostaje wyekstrahowany z próbki za pomocą alkoholu nbutylowego. Intensywnośd zabarwienia ekstraktu oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali 490 nm. W oznaczeniu
uwzględnia się badanie próbki kontrolnej bez dodatku substratu egzogennego – glukozy, w celu określenia intensywności
oddychania endogennego mikroorganizmów osadu czynnego. Jeżeli aktywnośd dehydrogenaz w próbce z dodatkiem glukozy jest
równa lub niższa niż aktywnośd dehydrogenaz w próbce bez dodatku glukozy, w której zachodzi oddychanie endogenne, oznacza
to że dodana glukoza nie stanowi źródła dla mikroorganizmów osadu, a więc osad czynny wykazuje aktywnośd tylko w stosunku
do substratów wewnątrzkomórkowych. Ze względu na trudności w określaniu żywej biomasy, oznaczane są zawartości zawiesin
ogólnych osadu, w których skład wchodzą żywe organizmy i zawiesiny. Jako wynik oznaczenia przyjmuje się iloraz ilości
trójfenyloformazanu do zawartości zawiesin ogólnych.
Degradacja fenolu
Fenole są związkami toksycznymi (powodującymi uszkodzenia narządów miąższowych) stosowanymi w przemyśle jako
półprodukty. Występują głównie w ściekach pochodzących z przemysłu petrochemicznego, farmaceutycznego, papierniczego,
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Ćwiczenie 1
BIOLOGIA OSADU CZYNNEGO – biotechnologia środowiska II0
Wpływ substancji toksycznych na aktywności dehydrogenaz osadu czynnego.
hutniczego, tworzyw sztucznych. Największe ilości znajdują się w ściekach pochodzących z produkcji fenolu i acetonu – stężenie
3000-15000 ppm. Po wstępnym usuwaniu fizyko-chemicznym (adsorpcja na wymieniaczu anionowym) stężenie fenolu często
nadal jest wysokie i wynosi od 300 do 400 ppm. Prowadzonych jest wiele badao dotyczących biodegradacji fenolu w procesach
mikrobiologicznych lub enzymatycznych. Za degradację związku odpowiedzialne są m.in. bakterie Actinetobacter calcoaceticus,
Pseudomonas sp. CF600, Pseudomonas putida WAS2, drożdże np. Trichosporon oraz enzymy m.in. oksydaza o-dwufenolanowa
otrzymywana z grzybów, oksydaza polifenolowa lub peroksydazy. Ograniczenia metod mikrobiologicznych, to przede wszystkim
możliwośd oczyszczania ścieków o niskich stężeniach fenolu (do 30 ppm) oraz małej objętości. Metody te charakteryzują się
długim czasem reakcji, dużą wrażliwością na zmiany temperatury i pH. Szeroko stosowaną obecnie metodą oczyszczania ścieków
zarówno miejskich jak i przemysłowych jest biologiczna metoda oczyszczania ścieków z wykorzystaniem osadu czynnego. Zasadą
oczyszczalni biologicznej jest otrzymanie zawiesiny osadu w ściekach podczas mieszania i napowietrzania. Ilośd osadu czynnego
w oczyszczalni jest regulowana poprzez odprowadzanie tzw. osadu nadmiernego oraz recylkulację. Układy technologiczne
oczyszczania ścieków metodą osadu czynnego różnią się między sobą stopniem biologicznego oczyszczenia. Systemy
oczyszczania ścieków metodą osadu czynnego różnią się między sobą:
- stopniem obciążenia osadu ładunkiem zanieczyszczeo
- wiekiem osadu
- czasem napowietrzania
- sprawnością i efektywnością oczyszczania ścieków.
Usuwanie węglowodorów ze ścieków metodą osadu czynnego polega na ich adsorpcji na kłaczkach oraz rozkładzie biologicznym.
Wymagana jest wstępna aklimatyzacja osadu do danego rodzaju ścieków.
Cel dwiczenia
Celem dwiczenia jest zbadanie wpływu substancji toksycznych (fenol, sole metali ciężkich) na aktywnośd dehydrogenaz
mikroorganizmów osadu czynnego oznaczanych metodą spektrofotometryczną z TTC.
Wykonanie dwiczenia
1.
-
Odczynniki stosowane w analizie:
osad czynny
0,05 M bufor Tris-HCl, pH=8,4
woda buforowana
0,4 % wodny roztwór TTC
0,36 % wodny roztwór siarczynu sodu
alkohol n-butylowy,
kwas siarkowy stężony
15 % octan ołowiu
1 % r-r fenolu
2.
Oznaczanie suchej masy osadu czynnego
Suchą masę osadu czynnego należy oznaczyd, gdyż aktywności dehydrogenaz (A1) mikroorganizmów osadu czynnego
3
podaje się w przeliczeniu na jego suchą masę [mg/cm ].
2.1. 15 minut przed rozpoczęciem pomiaru włączyd wagosuszarkę – urządzenie musi się nagrzad.
2.2. Po 15 minutach otworzyd wieko wagosuszarki, umieścid w niej wieczko szalki Petriego i nacisnąd dwukrotnie przycisk
TARE- tarując wagosuszarkę z szalką.
2.3. Na szalkę Petriego wprowadzid 5ml wymieszanego osadu czynnego – zanotowad masę osadu!. Zamknąd pokrywę
wagosuszarki.
0
2.4. Nacisnąd przycisk F1 (programowanie temperatury) i klawiszem F2 ustawid temperaturę – 104 C.
2.5. Nacisnąd klawisz F1 (czas próbkowania) i klawiszem F2 ustawid czas próbkowania – 5 lub 10.
2.6. Nacisnąd klawisz F1 – pojawi się komunikat na wyświetlaczu READY – potwierdzid ponownie naciskając F1 – rozpoczyna
się pomiar. Wynik podawany jest w % wilgotności próbki. Pomiar prowadzid do momentu uzyskania stałej wartości
wilgotności (wagosuszarka sama zakooczy pomiar po ok. 20-30 minutach).
2.7. Zapisad wynik i wyliczyd suchą masę analizowanej próbki. Zakooczyd pomiar naciskając klawisz TARE – otworzyd
pokrywę wagosuszarki, wyciągnąd szalkę z osadem, zamknąd i wyłączyd urządzenie. Szalkę Petriego dokładnie umyd.
3.
Przygotowanie próbki osadu do badao.
3
3
Pobrad 50 cm dokładnie wymieszanego osadu czynnego do zlewki o pojemności 250 cm i zhomogenizowad przez 0,5 min
przy 2500 obr/min.
4.
Wykonanie oznaczenia
3
4.1. W 3 probówkach okrągło dennych z podziałką i szlifem o pojemności 25 cm przygotowad roztwory wg tabeli 1
3
(objętości poszczególnych składników w cm ).
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba
Ćwiczenie 1
BIOLOGIA OSADU CZYNNEGO – biotechnologia środowiska II0
Wpływ substancji toksycznych na aktywności dehydrogenaz osadu czynnego.
3
Roztwór
Bufor Tris-HCl
Homogenat osadu
Fenol
Octan ołowiu
Woda buforowana
Siarczyn sodu
TTC
Tabela 1 Objętośd roztworów [cm ] w mieszaninie reakcyjnej
1 - osad czynny
2 - osad czynny + fenol
3 - osad czynny + octan ołowiu
5
5
5
5
5
5
1
1
2
1
1
1
1
1
2
2
2
0
4.2. Po zamknięciu korkiem szklanym zawartośd próbek dokładnie wymieszad. Inkubowad w ciemności w temperaturze 37 C
przez 30 minut.
0
UWAGA – czekając na przebieg reakcji należy podgrzad wodę do temperatury ok. 90 C, w zlewce (podgrzewając na
kuchence) lub włączając i programując łaźnię wodną.
3
4.3. Po upływie 30 minut zatrzymad reakcje dodając do każdej próbki 0,1 cm stężonego kwasu siarkowego – całośd
dokładnie wymieszad.
UWAGA - kwas siarkowy pobierad pipetą szklaną, pod dygestorium, używając rękawic gumowych !!!
3
4.4. Do każdej próbki wlad po 10 cm n-butanolu i po zatkaniu korkiem dokładnie wymieszad.
0
4.5. Próbki termostatorowad przez 5 minut w wodzie o temperaturze ok. 90 C.
3
4.6. Następnie ostrożnie wyciągnąd probówki z gorącej wody (nie wstrząsad próbek) i z każdej pobrad 5 cm ekstraktu
butanolowego (faza górna), przenieśd do probówki wirówkowej i odwirowad przy 1000 obr/minutę przez 10 minut.
4.7. Po zakooczeniu wirowania zdekantowad ciecz znad osadu do probówek szklanych i zmierzyd absorbancję klarownego
roztworu w spektrofotometrze przy długości fali = 490 nm.
Dla każdej próby wykonad co najmniej 3 pomiary absorbancji.
4.8. Dla uśrednionych wyników pomiarów absorbancji próbek osadu czynnego, oraz osadu zawierającego fenol i octan
ołowiu odczytad na krzywej wzorcowej zawartośd TF w μmolach.
5.
Obliczenie wyniku oznaczenia
5.1. Aktywnośd dehydrogenaz (A1) osadu czynnego obliczyd w μmolach na 1 mg suchej masy osadu wg wzoru:
gdzie:
3
a1 – odczytana z krzywej wzorcowej ilośd TF, odpowiadająca próbce osadu o objętości 5 cm [µm]
3
sm – sucha masa osadu [mg/cm ]
3
3
5 – współczynnik przeliczeniowy z objętości 10 cm na 50 cm alkoholu n-butylowego
3
3
200 – współczynnik przeliczeniowy z objętości 5 cm na 1 dm
Krzywa wzorcowa do obliczenia stężenia TF [µm] w próbce na podstawie absorbancji: y=0,5048x – 0,0382
6.
Opracowanie wyników
W sprawozdaniu umieścid wszystkie wyniki pomiarów i obliczenia. Sprawozdanie podsumowad wnioskami wyciągniętymi na
podstawie przeprowadzonego doświadczenia – określając wpływ substancji toksycznych na aktywnośd enzymatyczną
mikroorganizmów osadu czynnego.
7.
Literatura
7.1. Minczewski J., Marczenko Z., chemia analityczna. Chemiczne metody analizy ilościowej, PWN, Warszawa 1998.
7.2. Dymaczewski Z., Poradnik eksploatatora oczyszczalni ścieków. Polskie Zrzeszenie inż. I tech. Sanitarnych, Poznao, 1997.
7.3. Hermanowicz W., Fizyczno-chemiczne badanie wody i ścieków, Arkady, Warszawa, 1999.
Prowadzący: dr Sławomir Wierzba