CHROMATOGRAFICZNE BADANIA TRWAŁOŚCI MELITTYNY

Nowiny Lekarskie 2008, 77, 6, 426–429
JAN MATYSIAK, PAWEŁ DEREZIŃSKI, ZENON J. KOKOT
CHROMATOGRAFICZNE BADANIA TRWAŁOŚCI MELITTYNY –
GŁÓWNEGO SKŁADNIKA JADU PSZCZOŁY MIODNEJ (APIS MELLIFERA)
STABILITY STUDIES OF MELITTIN – THE MAIN COMPONENT OF HONEYBEE
(APIS MELLIFERA) VENOM USING HPLC
Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej
Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Kierownik Katedry: prof. dr hab. Zenon J. Kokot
Streszczenie
Wstęp. Jad pszczeli jest bogatym źródłem związków farmakologicznie czynnych. Złożony skład jadu pszczelego wpływa na wielokierunkowe działanie tego surowca. Natomiast ze względu na właściwości alergizujące jad pszczeli jest wykorzystywany do produkcji szczepionek
przeznaczonych do leczenia alergii na jad owadów błonkoskrzydłych. Na rynkach europejskim i światowym zarejestrowane są preparaty na
bazie jadu pszczelego. Jednakże wciąż brakuje jednoznacznych wskazań do standaryzacji tego produktu. Tymczasem standaryzacja jest
konieczna, aby było zapewnione bezpieczeństwo stosowania jadu jako leku. Tym bardziej, że jest on silną toksyną. Jednym z etapów standaryzacji jadu pszczelego powinno być określenie jego trwałości.
Cel. Badanie miało na celu ocenę trwałości głównego składnika jadu pszczelego – melittyny w roztworach wodnych o różnych stężeniach, w roztworach buforu fosforanowego o różnych wartościach pH, w roztworze soli fizjologicznej oraz w roztworach z dodatkiem substancji stabilizujących w szerokim zakresie stężeń.
Metodyka. Przeprowadzono badania trwałości głównego składnika jadu pszczelego – melittyny, z wykorzystaniem opracowanej
wcześniej metody w oparciu o wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC).
Wyniki. Trwałe okazały się wszystkie wodne roztwory melittyny o stężeniach 100 µg/g i wyższych, roztwór melittyny w buforze fosforanowym o pH równym 3, wszystkie roztwory melittyny z dodatkiem sacharozy oraz roztwory z dodatkiem glicerolu o stężeniach 30% i 40%.
W pozostałych analizowanych roztworach stężenie melittyny w czasie malało. Mniej trwała okazała się melittyna w roztworach jadu
pszczelego.
Wnioski. Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że melittyna wykazuje najwyższą trwałość w roztworach wodnych
pozbawionych dodatków lub z dodatkiem sacharozy. Ponadto na trwałość analizowanych próbek znaczący wpływ ma pH – najbardziej trwałe są roztwory w buforze fosforanowym o pH zbliżonym do naturalnego pH jadu (pH = 3).
SŁOWA KLUCZOWE: melittyna, jad pszczeli, trwałość.
Summary
Introduction. Honeybee venom is a rich source of pharmacologically active compounds. The complex composition of bee venom
results in the multidirectional action of this product. In addition due to its allergenic properties, bee venom is used to produce vaccines for the treatment of allergy to Hymenoptera venoms. Both on the European and global market there are some registered drugs
with bee venom. However, there is still lack of clear indications regarding the standardization of this product, whereas the standardization is necessary to assure the security of usage of venom as a drug. Especially because it is a strong toxin. One of the stages
of standardization of bee venom should be the determination of its stability.
Aim. The aim of the study was to assess the stability of the main component of honeybee venom – melittin in aqueous solutions
of different concentrations, in phosphate buffer solutions of different pH values, in saline solution and in solutions with the addition
of stabilizers in a wide range of concentrations.
Methods. The stability studies of the main component of honeybee venom – melittin were carried out using previously developed
method based on high performance liquid chromatography (HPLC).
Results. It was demonstrated that the following preparations of melittin were stable: all aqueous melittin solutions of concentrations
of more than or equal to 100 ug/g, melittin solution in phosphate buffer of pH = 3, all melittin solutions with the addition of sucrose
and glycerol solutions of the concentration of 30% and 40%. In the rest of the analyzed solutions melittin concentration decreased.
It was also demonstrated that melittin is less stable in aqueous solutions of honeybee venom.
Conclusions. It can be stated that melittin was the most stable in aqueous solutions without any additives or with addition of sucrose.
In addition, pH had a significant impact on the stability of the analyzed samples – the most stable were the solutions in phosphate
buffer of pH close to natural pH of the venom (pH = 3).
KEY WORDS: melittin, honeybee venom, stability.
Wstęp
Produkty pochodzenia naturalnego stanowią niezwykle bogate źródło związków o zróżnicowanych właści-
wościach chemicznych oraz biologicznych. Są zatem
alternatywą dla leków syntetycznych, które często charakteryzują się możliwością wystąpienia poważnych
działań niepożądanych w trakcie ich stosowania. Dlatego
Chromatograficzne badania trwałości melittyny – głównego składnika jadu pszczoły miodnej (Apis mellifera)
też uwaga laboratoriów badawczych na całym świecie
skupia się na poszukiwaniu innowacyjnych leków pochodzenia naturalnego łączących w sobie zarówno skuteczność, jak i bezpieczeństwo stosowania.
Ponadto substancje pochodzenia naturalnego mogą
służyć nie tylko jako leki, ale są również wykorzystywane w badaniach pozwalających zrozumieć rolę szlaków
metabolicznych zaangażowanych w rozwój chorób oraz
lepiej wyjaśnić działanie już istniejących leków.
Organizmy, których genom został w pełni rozszyfrowany, są najlepszym źródłem innowacyjnych związków farmakologicznie aktywnych, ponieważ w przypadku tych
organizmów identyfikacja oraz poznanie struktury nowoodkrytych substancji za pomocą nowoczesnych technik
spektrometrii mas jest w dużym stopniu ułatwione. Modelowym przykładem takiego organizmu jest pszczoła miodna
(Apis mellifera).
Wiele produktów pszczelich (miód, mleczko pszczele,
propolis, wosk, pyłek kwiatowy, pierzga) charakteryzuje się
odżywczymi i terapeutycznymi właściwościami, jednak na
szczególną uwagę zasługuje jad pszczeli. Jest on bogatym
źródłem związków farmakologicznie czynnych. Złożony
skład jadu pszczelego wpływa na wielokierunkowe działanie
tego surowca. Potwierdzono już jego skuteczność w leczeniu takich schorzeń, jak: artretyzm [1], reumatyzm, ból [2,
3], choroby nowotworowe [4, 5] oraz choroby skóry. Natomiast ze względu na właściwości alergizujące jad pszczeli
jest wykorzystywany do produkcji szczepionek przeznaczonych do leczenia alergii na jad owadów błonkoskrzydłych.
Na rynkach europejskim i światowym zarejestrowane są preparaty na bazie jadu pszczelego. Jednakże wciąż
brakuje jednoznacznych wskazań do standaryzacji tego
produktu. Tymczasem standaryzacja jest konieczna, aby
było zapewnione bezpieczeństwo stosowania jadu jako
leku. Tym bardziej, że jest on silną toksyną. Wiele czynników może bowiem wpływać na zmianę jego składu:
pochodzenie geograficzne, pora pozyskiwania surowca
(rok, miesiąc), technologia otrzymywania, warunki przechowywania oraz rasa, linia i płeć pszczół [6, 7, 8, 9].
Innym problemem jest zapewnienie odpowiedniej jakości produktu poprzez stałe monitorowanie surowca pod
względem zawartości metali (w tym metali toksycznych), związków szkodliwych dla zdrowia (antybiotyków, pestycydów, insektycydów), a także leków syntetycznych nielegalnie dodawanych do leków naturalnych
w celu zwiększenia ich skuteczności terapeutycznej.
Jednym z etapów standaryzacji jadu pszczelego powinno być określenie jego trwałości. Niezwykle istotne jest
zbadanie wpływu różnych czynników na trwałość jadu,
między innymi wpływu temperatury (trwałość termiczna),
naświetlenia (trwałość fotochemiczna), stężenia jadu, rozpuszczalników, konserwantów, dodatków stabilizujących,
pH (trwałość w roztworach).
427
W trakcie takich badań należy zwrócić szczególną
uwagę na to, jak zmienia się zawartość poszczególnych
składników w jadzie. W tym celu określona musi być
kinetyka rozkładu poszczególnych związków w zależności od różnych czynników. Należy również zidentyfikować produkty rozkładu składników jadu. Produkty te
mogą być związkami potencjalnie toksycznymi, stąd tak
ważna jest ich identyfikacja, a w dalszej kolejności poznanie ich właściwości biologicznych.
Badania trwałości jadu pszczelego umożliwią określenie warunków, jakie należy zachować podczas pobierania surowca, jego przechowywania, a także pozwolą
określić sposoby przygotowywania postaci leku na bazie
jadu pszczelego i warunki ich przechowywania. Ma to
na celu zapewnienie bezpieczeństwa stosowania preparatów jadu oraz ich skuteczności terapeutycznej.
Cel
Badanie miało na celu ocenę trwałości głównego składnika jadu pszczelego – melittyny w roztworach wodnych
o różnych stężeniach, w roztworach buforu fosforanowego
o różnych wartościach pH, w roztworze soli fizjologicznej
oraz w roztworach z dodatkiem substancji stabilizujących w
szerokim zakresie stężeń.
Materiał i metody
Wzorzec melittyny został zakupiony w firmie Sigma
Chemicals Co. Natomiast próbki jadu pszczelego pochodziły z pasieki położonej w miejscowości Góry w powiecie
kaliskim, w województwie wielkopolskim.
Jad zbierano drażniąc pszczoły prądem elektrycznym
przez specjalny aparat umieszczony w ulu. Impulsy elektryczne powodowały skurcz odwłoka pszczół i wydzielenie
jadu na powierzchnię szklanej płytki. Po wysuszeniu jad
przenoszono do naczyniek, w których był następnie przechowywany w temperaturze 5°C bez dostępu światła.
Przeprowadzono badania trwałości głównego składnika jadu pszczelego – melittyny, z wykorzystaniem
opracowanej wcześniej metody w oparciu o wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) (Ryc. 1.).
Trwałość jadu badana była w roztworach wodnych w
zakresie stężeń od 50 do 1000 µg/ml, natomiast trwałość
melittyny analizowano w stężeniach od 50 do 300 µg/ml.
Dodatkowo badano wpływ innych roztworów na trwałość analizowanych próbek: bufory fosforanowe (pH 3, 7,
9) oraz 0,9% NaCl. W badaniach wykorzystano także dodatki stabilizujące mające zastosowanie w przygotowywaniu postaci farmaceutycznych (Tween 80 w stężeniach:
0,005%; 0,01%, 0,05%; glicerol w stężeniach: 20%, 30%,
40%; sacharoza w stężeniach: 0,5 M, 1,0 M, 1,5 M).
Wszystkie badania trwałości melittyny i jadu przeprowadzono w temperaturze 25°C.
428
Jan Matysiak i inni
Nawet po upływie 14 dób zawartość melittyny wynosiła
dla stężeń sacharozy 0,5 M, 1,0 M i 1,5 M odpowiednio
81%, 87% i 75%. W pozostałych roztworach poddanych
analizie stężenie melittyny w czasie malało: liniowo
w roztworach wodnych (Ryc. 5.), natomiast wykładniczo
w pozostałych roztworach (Ryc. 6.).
Rycina 1. Chromatogram jadu pszczelego. Zidentyfikowane
piki: 1 = apamina (stęż. = 7,35 μg/ml), 3 = peptyd MCD (stęż.
= 7,66 μg/ml), 7 = fosfolipaza A2 (stęż. = 28,12 μg/ml),
8 = cytochrom c (stęż. = 25,00 μg/ml), 9 = melittyna (stęż.
= 129,66 μg/ml), 2, 4, 5, 6, 10, 11, 12 – inne składniki.
Figure 1. LC pattern of honeybee venom. Identified peaks: 1 =
apamine (conc. = 7,35 μg/ml), 3 = MCDP (conc. = 7.66 μg/ml),
7 = phospholipase A2 (conc. = 28.12 μg/ml), 8 = cytochrome c
(conc. = 25.00 μg/ml), 9 = melittin (conc. = 129.66 μg/ml),
2, 4, 5, 6, 10, 11, 12 = minor components.
Rycina 2. Zmiany stężenia melittyny (c [µg/g]) w roztworze
wodnym jako funkcja czasu (temp. 25°C).
Figure 2. Concentrations of melittin (c [µg/g]) in aqueous
solution as a function of time (temp. 25°C).
Analizy HPLC wykonane zostały z wykorzystaniem
aparatu firmy Agilent Technologies, seria 1200. Użyto
kolumnę BioBasic-8, 5 μm, 4,6 x 100 mm, firmy Thermo Scientific. Rozdział chromatograficzny jadu pszczelego przeprowadzono przy gradiencie liniowym 5% B –
80% B w ciągu 30 minut (faza A – 0,1% TFA w wodzie,
faza B – 0,1% TFA w mieszaninie acetonitrylu i wody
(80:20)). Przepływ fazy ruchomej wynosił 1 ml/min,
objętość nastrzyku: 40 μl, temperatura rozdziału: 25°C.
Detekcję prowadzono przy długości fali λ = 220 nm.
Wyniki i dyskusja
Badania trwałości prowadzono przez okres 2 tygodni
w temperaturze 25°C. W celu dokonania interpretacji
wyników przyjęto założenie, że melittyna jest trwała
wówczas, gdy procentowy spadek jej stężenia po 4.
dobie jest mniejszy lub równy 5%. Trwałe okazały się
wszystkie wodne roztwory melittyny o stężeniach 100
µg/g i wyższych (Ryc. 2.), roztwór melittyny w buforze
fosforanowym o pH równym 3, wszystkie roztwory
melittyny z dodatkiem sacharozy oraz roztwory z dodatkiem glicerolu o stężeniach 30% i 40%. W pozostałych
analizowanych roztworach stężenie melittyny w czasie
malało: liniowo w wodnym roztworze o najniższym
stężeniu (50 µg/g), natomiast wykładniczo w pozostałych roztworach (Ryc. 3.). W roztworach z dodatkiem
Tweenu 80 rozkład melittyny był najszybszy (Ryc. 4.).
Mniej trwała okazała się melittyna w roztworach jadu pszczelego. Po 4. dobie zawartość melittyny wyższą
lub równą 95% jej początkowej zawartości stwierdzono
jedynie w przypadku roztworów z dodatkiem sacharozy.
Rycina 3. Zmiany stężenia melittyny (c [µg/g]) w glicerolu
(20%) jako funkcja czasu (temp. 25°C).
Figure 3. Concentrations of melittin (c [µg/g]) in glycerol
solution (20%) as a function of time (temp. 25°C).
Rycina 4. Zmiany stężenia melittyny (c [µg/g]) w Tweenie 80
(0,05%) jako funkcja czasu (temp. 25°C).
Figure 4. Concentrations of melittin (c [µg/g]) in Tween 80
solution (0.05%) as a function of time (temp. 25°C).
Chromatograficzne badania trwałości melittyny – głównego składnika jadu pszczoły miodnej (Apis mellifera)
429
chemicznych (ELISA, Immunoblot). Dane uzyskane z prze
prowadzonych badań oraz te z badań planowanych pozwolą
na pełną charakterystykę badanego produktu. Przyczynią
się tym samym do posunięcia prac nad standaryzacją jadu
pszczelego i w konsekwencji pozwolą na opracowanie
postaci leku na bazie tego surowca.
Piśmiennictwo
Rycina 5. Zmiany stężenia melittyny (c [µg/g]) w wodnym
roztworze jadu jako funkcja czasu (temp. 25°C).
Figure 5. Concentrations of melittin (c [µg/g]) in aqueous
solution of honeybee venom as a function of time (temp.
25°C).
Rycina 6. Zmiany stężenia melittyny (c [µg/g]) w roztworze
jadu w buforze fosforanowym o pH = 7 jako funkcja czasu
(temp. 25°C).
Figure 6. Concentrations of melittin (c [µg/g]) in phosphate
buffer (pH = 7) solution of honeybee venom as a function of time
(temp. 25°C).
Wnioski
Przeprowadzone badania pozwoliły określić wpływ zastosowanych warunków na stabilność analizowanych próbek.
Na podstawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że
melittyna wykazuje najwyższą trwałość w roztworach wodnych pozbawionych dodatków lub z dodatkiem sacharozy.
Ponadto na trwałość analizowanych próbek znaczący wpływ
ma pH – najbardziej trwałe są roztwory w buforze fosforanowym o pH zbliżonym do naturalnego pH jadu (pH = 3).
Konieczna jest kontynuacja badań trwałości jadu
pszczelego z wykorzystaniem takich technik analitycznych, jak: HPCE, HPTLC, SDS-PAGE, spektrometria
mas (MALDI-TOF-MS, ESI-qTOF-MS) oraz metod bio-
1. Park H.J., Lee S.H., Son D.J. et al.: Antiarthritic effect
of bee venom: inhibition of inflammation mediator
generation by suppression of NF-kappaB through interaction with the p50 subunit. Arthritis Rheum., 2004, 50,
3504–3515.
2. Kwon Y.B., Ham T.W., Kim H.W. et al.: Water soluble
fraction (< 10 kDa) from bee venom reduces visceral
pain behavior through spinal alpha 2-adrenergic activity
in mice. Pharmacol. Biochem. Behav., 2005, 80, 181–
187.
3. Kim H.W., Kwon Y.B., Ham T.W. et al.: Acupoint
stimulation using bee venom attenuates formalin-induced
pain behavior and spinal cord fos expression in rats.
J. Vet. Med. Sci., 2003, 65, 349–355.
4. Russell P.J., Hewish D., Carter T. et al.: Cytotoxic
properties of immunoconjugates containing melittin-like
peptide 101 against prostate cancer: in vitro and in vivo
studies. Cancer Immunol. Immunother., 2004, 53, 411–
421.
5. Putz T., Ramoner R., Gander H. et al.: Antitumor action
and immune activation through cooperation of bee venom
secretory phospholipase A2 and phosphatidylinositol-(3,
4)-bisphosphate. Cancer Immunol. Immunother., 2006, 55,
1374–1383.
6. Kokot Z.J., Matysiak J., Kłos J. et al.: Application of principal component analysis for evaluation of chemical and
antimicrobial properties of honeybee (Apis mellifera)
venom. J. Apicult. Res., 2009, 48, 168–175.
7. Leluk J., Schmidt J., Jones D.: Comparative studies on
the protein composition of hymenopteran venom reservoirs.
Toxicon, 1989, 27, 105–114.
8. Schumacher M.J., Schmidt J.O., Egen N.B. et al.: Biochemical variability of venoms from individual European
and africanized honeybees (Apis mellifera). J. Allergy
Clin. Immunol., 1992, 90, 59–65.
9. Palma M.S., Brochetto-Braga M.R.: Biochemical variability between venoms from different honey-bee (Apis
mellifera) races. Comparative Biochemistry and Physiology
C-Pharmacology,Toxicology and Endocri-nology, 1993,
106, 423–427.
Adres do korespondencji:
prof. dr hab. Zenon J. Kokot
Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej i Analitycznej UMP
ul. Grunwaldzka 6
60-780 Poznań